DTT诱导线粒体应激引起胶质瘤细胞凋亡的机制研究

中国实验诊断学2019年3月第23卷第3期515

human and murine squamous cell carcinoma[JJ Clin Invest, 2011,121(2):809.

[9]Hatakeyama H,Cheng H,Wirth P,et al.Regulation of heparin

binding EGF-Like growth factor by miR212and acquired cetux­imab resistance in head and neck squamous cell carcinoma[J].

PLos One,2010,5(9)：12702

[10]An X,Sarmiento C»Tan T,et al.Regulation of multidrug resist­

ance by microRNAs in anti-cancer therapy[J].Acta Pharm Sin B,2017,7(1)：38.

[11]Kang L.Mao J,Tao Y,et al.MicroRNA-34a suppresses the

breast cancer stem cell-like characteristics by downregulating Notchl pathway]J].Cancer Sci»2015,106(6):700.

[12]Alhasan L.MiR-126Modulates Angiogenesis in Breast Cancer

by Targeting VEGF-A-mRNA[J].Asian Pac J Cancer Prev, 2019,20(1):193.

[13]Zhang Y»Yan J.Wang L.et al.HIF-la Promotes Breast Cancer

Cell MCF-7Proliferation and Invasion Through Regulating miR-210[J].Cancer Biot h er Radiopharm,2017,32(8):297.

[14]Zuo J,Wen M,Lei M,et al.MiR-210links hypoxia with cell pro­

liferation regulation in human Laryngocarcinoma cancer[J].J Cell Biochem,2015,116(6)：1039.

[15]王苹，刘照轩，于红，等.抑制miRNA-210表达降低缺氧所

致喉癌Hep-2细胞放疗耐受的实验研究[J].中华临床医师杂志，2015,9(7):1174.

(收稿日期:2018-11-30)

文章编号：1007-4287(2019)03-0515-04

DTT诱导线粒体应激引起胶质瘤

细胞凋亡的机制研究

周子荐」，沈璐妍2,刘远达彳，全成实"

(1.吉林大学临床医学院，吉林长春130021；2.吉林大学基础医学院病理生理学系；

3.吉林大学第二医院胃肠营养及疝外科)

研究表明，胶质瘤细胞对化疗药的敏感性与其细胞内部发生的内质网应激有着十分密切的关联在化疗药物的作用下，肿瘤细胞内质网稳态受到破坏，蛋白质无法折叠或错误折叠.引起内质网应激図。DTT(二硫苏糖醇)是一种内质网应激诱导剂，可阻止蛋白质中的半胱氨酸残基的氧化，干扰PDI(二硫键异构酶)在蛋白质二硫键形成中的催化作用，导致错误折叠的蛋白大量堆集⑶，从而诱发内质网应激。因此，本实验选用DTT诱导脑胶质瘤细胞系SHG44产生内质网应激，并进行线粒体应激相关指标、线粒体ROS水平和细胞凋亡蛋白检测。

1材料与方法

1.1细胞、主要试剂与仪器人脑胶质瘤细胞系SHG44,购于上海子实生物公司。二硫苏糖醇(DTT)购自北京coolaber公司,Caspase-3活性检测试剂盒购自上海碧云天公司。GRP78蛋白抗体购自proteintech公司；CHOP购自abeam公司；(3-actin、PDI、HSP10、HSP60、ClpP、LON、Htr A2/ ()mi抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG~抗和HRP

*通讯作者标记的山羊抗小鼠IgG二抗购自Santa Cruz公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养及处理细胞培养：使用10%胎牛血清的低糖DMEM培养基置于37'C,5%CQ细胞培养箱中培养，保持饱和湿度。细胞培养每3天进行一次传代，细胞使用0.01M PBS冲洗一次，0.25%胰酶细胞消化，并按照1:3的比例进行传代。药物处理：取对数期生长细胞，设置空白对照组和实验组，实验组采用DTT(5“mol/ml)分别处理3h,6h,12h及24h。

1.2.2MTT比色法检测96孔板接种为1.0X 104细胞/孔，细胞用含10%小牛血清的正常培养液混匀，每孔终体积为100“1,5%CO2、37C培养箱孵育过夜。设置3个阴性对照组，每个实验组设3个复孔，按实验所需加药物处理，每孔终体积为100以。到作用时间点结束后，再往每孔加入10以MTT,孵育4-6h后弃去培养液，每孔加入1500 DMS()。孔板在平板振荡器上振荡5-10min。酶标仪490nm波长测取吸光度值，记录结果，计算抑制率或存活率。

1.2.3细胞线粒体ROS水平检测细胞接种于6孔板上，分组处理同1.2.1。以1：1000Mito-SOX

516Chin J I“ab Diagn.March.2019•Vol23.No.3

Red染色30min.消化、收集细胞.充分洗涤后用流式细胞仪检测。

1.2.4Western Blot消化、收集处理的细胞，加入RIPA细胞裂解液.裂解充分后以14000g、4C 离心20min.取上清为细胞总蛋白，采用BCA试剂盒进行蛋白浓度定量后.使用裂解液调平后，按照I :4体积比例加入5X Loading Buffer.100'C煮沸10min o根据BCA蛋白定量结果计算样品的上样量，每孔总蛋白25“g.选用12%SDS-PAGE凝胶和Tris甘氨酸电泳缓冲液电泳.室温稳压100V电泳。采用湿转法将蛋白转于PVDF膜上，室温下5%脱脂奶粉封闭摇床2h.TBST洗膜.加入按要求稀释的对应的单克隆抗体，4C封闭孵育过夜。TBST洗膜.加入二抗室温摇床孵育2h.TBST洗膜后，发光、凝胶成像系统拍照，结果采用Quantity One软件进行量化分析。

1.2.5Caspase3活性检测使用碧云天公司的Caspase-3活性检测试剂盒，按照试剂盒提供的说明书操作规范步骤.检测细胞裂解液中Caspase-3酶活性。

1.2.6统计学分析用统计软件SPSS19.0对实验数据进行统计分析。所有实验数据均以均数士标准差（_r±x）表示。组间比较采用独立样本『检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1DTT对脑胶质细胞瘤系SHG44细胞活性及凋亡的影响

实验结果如图1.通过MTT法检测DTT对细胞增殖能力的影响.研究发现高浓度的DTT可以抑制胶质瘤细胞增殖能力；凋亡执行蛋白Caspase-3活性逐渐上升（PV0.05）。

2.2DTT对脑胶质瘤内质网应激相关蛋白的影响

与对照组相比.PDI表达量较对照组逐步下降（P<0.05）,GRP78/Bip的表达有显著升高.且表达的升高呈时间依赖性（P<0.05）；CHOP表达水平相对于对照组随药物处理时间延长逐渐上升（PV 0.05）.如图2。

迹

1OOH

SD-I

A

S

3

W

O

E

g

m

q

B

F

A

§

冷

£

A：MTT检测结果量化图:B：Caspase3活性检结果量化图（*表示与con组相比，具有统计学意义「P<0.05）o

图1DTT处理对于SHC44细胞细胞活性以及凋亡的影响

A B C D

CHOP can3h6h12h24h U1I訂i iJUii

4-

M3

PDI SB■■■B9|2

■§i-

GRP78

actin cai3h6h12h24h

A：内质网应激相关蛋白Weslern blot条带图；B：（；RP78蛋白水平瞳化图;C：PD］蛋白水平量化图:D;CH（）1>蛋白水平lit化图（*表示与con组相比，具有统计学意义.-P<0.05）.

图2DTT处理不同时间对于SHG44细胞内质网应激相关蛋白的影响

2.3I）TT对脑胶质瘤线粒体内ROS及线粒体应激相关蛋白的影响

实验结果显示，线粒体内部ROS水平呈时间依赖性升高（P<0.05）,如图3。与对照组相比，热休克蛋白10在3h表达量最高.随后表达逐渐下降。热休克蛋白60以及蛋白水解酶LON.ClpP等与对照组相比都呈现出逐渐上升趋势（PV0.05）,在到6 h达高峰后表达开始逐渐下降。且以上热休克蛋白，蛋白水解酶在24h组表达水平均低于对照组的表达量（P<0.01）。（）mi的表达量则逐渐下降（PV 0.01）,如图403讨论

脑胶质瘤作为成人中枢系统最常见的恶性肿瘤，具有极高的侵袭性，手术难以将其彻底清除。胶质瘤的较强的增殖能力使其常常处于缺氧、营养缺乏等多种不利环境中，为应对这些不利因素.胶质瘤细胞会启动各类应激反应来重建细胞稳态近年来发现.内质网应激可通过激活未折叠蛋白反应的ATF6.IRE1和PERK信号通路参与肿瘤化疗药物的耐药机制旳。然而过度的内质网应激也可以激活PERK-eIF2a-ATF4信号途径下游分子CHOP的表达增加.增加凋亡基因表达•促使细胞凋亡互

。