ligation independent cloning-分子克隆技术ppt课件
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优点:依赖连接酶的克隆方法简单 高效,是克隆单个基因的常用的方 法。
不足:一方面,插入片段要经过限 制性内切酶处理,这样在实验设计 时就要考虑目的基因的DNA序列, 不能实现多基因的平行操作,不适 合高通量;另一方面,该过程使用 连接酶,不但延长了实验的周期, 而且也会带来载体自连背景,增加 了筛选工作量。
LIGATION-INDEPENDENT CLONING
1
经典的克隆方法
经典的克隆方法,主要分为以下两 种:(1)粘性末端连接,即载体质粒 和待插入的外源片段都通过合适的 限制性内切酶切割,产生相互匹配 的粘性末端,然后在连接酶作用下 重新形成磷酸二酯键而得到环化的 重组质粒;(2)平末端连接,平末端 连接中,载体和片段均为平端,都 没有粘性末端突出。
双酶切
PCR 双酶切
连接
2
LIGATION-INDEPENDENT CLONING
在很多情况下,重组DNA技术的应用都会受到 基因序列中原有的酶切位点的限制,尤其是多基 因片段的重组往往更容易受到限制酶酶切位点序 列的限制,研究者不得不使用一些非常稀有的酶 切位点或者采用其它的DNA重组方法,大大增 加了DNA重组的工作量和难度。因此,开发一 种不受序列限制而且需要准确重组的新方法就显 得十分重要。
化,互补的粘性末端退火形成环状分子,经转化
进大肠杆菌细胞后,细菌的修复系统修复这些突
出和缺口而得到正确重组子(如图)。 刘超等, 2011, 不依赖于连接反应克隆(LIC)的技术进展, 基因组学与应用生物学, Vol.30 No.13 (DOI: 10.5376/gab.cn.2011.30.0013)
各种酶切位点的麻烦,而且实验过程中可以实行并行操作,对所有的样品进行同 样的处理。 (2)速度快。T4 DNA Polymerase所需的时间只要40min,然后75℃热处理 20min,载体与目的片段共混孵育10min。相比经典的克隆方法更节约时间。 (3)克隆效率高且操作简便。如前所述,该方法不依赖连接酶,完全是靠粘性末端 配对退火,所以不匹配的末端不可能形成双链,载体自连背景低。 (4)相对而言费用较低。该方法中所需要的引物虽然有额外10~15 bp附加碱基, 但是相对而言位点特异性重组中所要求的引物是较短的,而且克隆过程中省去了 连接酶,也没有使用价格不菲的特殊重组酶。 综合以上几个方面考虑,LIC是一种适合于高通量基因克隆和蛋白质表达的优秀方 法。
Resistance
AMP AMP AMP AMP AMP
Tag(s) Size
2 kDa 45 kDa 28 kDa 58 kDa 14 kDa
yORF (your open reading frame)6
Vector
Tag
2BT 2CT 2GT 2NT 2ST
His6-tev-yORF His6-MBP-N10-tev-yORF His6-GST-tev-yORF His6-NusA-tev-yORF His6-Sumo-tev-yORF
Expression Host
E.coli T7 E.coli T7 E.coli T7 Ewk.baidu.comcoli T7 E.coli T7
Aslanidis和de Jong (1990)在1990年所提出的 不依赖连接反应克隆(ligation-independent cloning, LIC)充分满足了上述要求。这种方式不 仅克服了常规依赖连接酶克隆方法的缺点,而且 操作简便、方法快捷及连接效率高,应用日益广 泛。
在T4 DNA聚合酶的3′-5′外切酶活性下和一种特
SLIC用途广泛,它不仅可用于任何2个DNA片段的重组, 而且可用于多个DNA 片段的重组.
5
刘超等, 2011, 不依赖于连接反应克隆(LIC)的技术进展, 基因组学与应用生物学, Vol.30 No.13 (DOI: 10.5376/gab.cn.2011.30.0013)
LIGATION-INDEPENDENT VECTORS
该方法的基本原理如下:利用PCR技术在插入片段的两 侧分别加上几十bp 的同源末端,参加重组的片段分别 在没有dNTP存在的情况下用T4 DNA 聚合酶中的3’5’外切酶活性22℃ 处理,产生含有同源序列的5 端突 起.突出端的长度可以通过控制3’-5’外切酶活性的 作用时间来实现,加入dCTP即可终止外切酶活性.将 各片段的酶切产物按等摩尔比混合,在T4 DNA连接缓 冲液中于37℃ 完成突出单链的复性重组,形成含有大 的缺口的环状中间体.用此中间体转化大肠杆菌,利用 大肠杆菌本身的修复机制完成中间体的修复.
3
LIC方法的特点
LIC方法依赖于T4 DNA Polymerase的核酸外切酶活性,这样就要求被处理的线 性载体和片段的末端仅含有3种碱基,这样才可以有效控制反应以产生特定大小的 粘性末端。要求载体有较固定的粘性末端,且对于如何使载体线性化有特殊的要 求。
LIC方法的优势在于: (1)待克隆的PCR片段不需要限制性内切酶处理。这样就省去了在设计引物时考虑
4
LIC方法的改进——SLIC
在很多情况下,DNA 片段的克隆和表达,尤其是多基 因片段的重组往往会受到限制酶酶切位点序列的限制 , 因此,建立一种不受序列限制而且需要准确重组的新方 法就显得十分重要.
Li & Elledge所建立的不依赖序列和连接的克隆方法 (sequence and ligation-independent cloning, SLIC)就能满足上述要求.该方法不受DNA序列的限制, 可以将任意序列的多个DNA片段组装到一起,而且不 需要连接反应即可完成体外的重组.
定的dNTP存在的缓冲液条件下反应,插入片段
能产生10~15个碱基的粘性末端(Aslanidis and
de Jong,1990)。载体和PCR片段依靠长的粘性
末端重组,此过程不需要连接酶。这种克隆方法
不需要考虑插入片段的序列,任何基因都能被克
隆到该载体中。而且,整个流程简单到不需要任
何限制性内切酶和连接酶,两者在体外条件下孵
不足:一方面,插入片段要经过限 制性内切酶处理,这样在实验设计 时就要考虑目的基因的DNA序列, 不能实现多基因的平行操作,不适 合高通量;另一方面,该过程使用 连接酶,不但延长了实验的周期, 而且也会带来载体自连背景,增加 了筛选工作量。
LIGATION-INDEPENDENT CLONING
1
经典的克隆方法
经典的克隆方法,主要分为以下两 种:(1)粘性末端连接,即载体质粒 和待插入的外源片段都通过合适的 限制性内切酶切割,产生相互匹配 的粘性末端,然后在连接酶作用下 重新形成磷酸二酯键而得到环化的 重组质粒;(2)平末端连接,平末端 连接中,载体和片段均为平端,都 没有粘性末端突出。
双酶切
PCR 双酶切
连接
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LIGATION-INDEPENDENT CLONING
在很多情况下,重组DNA技术的应用都会受到 基因序列中原有的酶切位点的限制,尤其是多基 因片段的重组往往更容易受到限制酶酶切位点序 列的限制,研究者不得不使用一些非常稀有的酶 切位点或者采用其它的DNA重组方法,大大增 加了DNA重组的工作量和难度。因此,开发一 种不受序列限制而且需要准确重组的新方法就显 得十分重要。
化,互补的粘性末端退火形成环状分子,经转化
进大肠杆菌细胞后,细菌的修复系统修复这些突
出和缺口而得到正确重组子(如图)。 刘超等, 2011, 不依赖于连接反应克隆(LIC)的技术进展, 基因组学与应用生物学, Vol.30 No.13 (DOI: 10.5376/gab.cn.2011.30.0013)
各种酶切位点的麻烦,而且实验过程中可以实行并行操作,对所有的样品进行同 样的处理。 (2)速度快。T4 DNA Polymerase所需的时间只要40min,然后75℃热处理 20min,载体与目的片段共混孵育10min。相比经典的克隆方法更节约时间。 (3)克隆效率高且操作简便。如前所述,该方法不依赖连接酶,完全是靠粘性末端 配对退火,所以不匹配的末端不可能形成双链,载体自连背景低。 (4)相对而言费用较低。该方法中所需要的引物虽然有额外10~15 bp附加碱基, 但是相对而言位点特异性重组中所要求的引物是较短的,而且克隆过程中省去了 连接酶,也没有使用价格不菲的特殊重组酶。 综合以上几个方面考虑,LIC是一种适合于高通量基因克隆和蛋白质表达的优秀方 法。
Resistance
AMP AMP AMP AMP AMP
Tag(s) Size
2 kDa 45 kDa 28 kDa 58 kDa 14 kDa
yORF (your open reading frame)6
Vector
Tag
2BT 2CT 2GT 2NT 2ST
His6-tev-yORF His6-MBP-N10-tev-yORF His6-GST-tev-yORF His6-NusA-tev-yORF His6-Sumo-tev-yORF
Expression Host
E.coli T7 E.coli T7 E.coli T7 Ewk.baidu.comcoli T7 E.coli T7
Aslanidis和de Jong (1990)在1990年所提出的 不依赖连接反应克隆(ligation-independent cloning, LIC)充分满足了上述要求。这种方式不 仅克服了常规依赖连接酶克隆方法的缺点,而且 操作简便、方法快捷及连接效率高,应用日益广 泛。
在T4 DNA聚合酶的3′-5′外切酶活性下和一种特
SLIC用途广泛,它不仅可用于任何2个DNA片段的重组, 而且可用于多个DNA 片段的重组.
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刘超等, 2011, 不依赖于连接反应克隆(LIC)的技术进展, 基因组学与应用生物学, Vol.30 No.13 (DOI: 10.5376/gab.cn.2011.30.0013)
LIGATION-INDEPENDENT VECTORS
该方法的基本原理如下:利用PCR技术在插入片段的两 侧分别加上几十bp 的同源末端,参加重组的片段分别 在没有dNTP存在的情况下用T4 DNA 聚合酶中的3’5’外切酶活性22℃ 处理,产生含有同源序列的5 端突 起.突出端的长度可以通过控制3’-5’外切酶活性的 作用时间来实现,加入dCTP即可终止外切酶活性.将 各片段的酶切产物按等摩尔比混合,在T4 DNA连接缓 冲液中于37℃ 完成突出单链的复性重组,形成含有大 的缺口的环状中间体.用此中间体转化大肠杆菌,利用 大肠杆菌本身的修复机制完成中间体的修复.
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LIC方法的特点
LIC方法依赖于T4 DNA Polymerase的核酸外切酶活性,这样就要求被处理的线 性载体和片段的末端仅含有3种碱基,这样才可以有效控制反应以产生特定大小的 粘性末端。要求载体有较固定的粘性末端,且对于如何使载体线性化有特殊的要 求。
LIC方法的优势在于: (1)待克隆的PCR片段不需要限制性内切酶处理。这样就省去了在设计引物时考虑
4
LIC方法的改进——SLIC
在很多情况下,DNA 片段的克隆和表达,尤其是多基 因片段的重组往往会受到限制酶酶切位点序列的限制 , 因此,建立一种不受序列限制而且需要准确重组的新方 法就显得十分重要.
Li & Elledge所建立的不依赖序列和连接的克隆方法 (sequence and ligation-independent cloning, SLIC)就能满足上述要求.该方法不受DNA序列的限制, 可以将任意序列的多个DNA片段组装到一起,而且不 需要连接反应即可完成体外的重组.
定的dNTP存在的缓冲液条件下反应,插入片段
能产生10~15个碱基的粘性末端(Aslanidis and
de Jong,1990)。载体和PCR片段依靠长的粘性
末端重组,此过程不需要连接酶。这种克隆方法
不需要考虑插入片段的序列,任何基因都能被克
隆到该载体中。而且,整个流程简单到不需要任
何限制性内切酶和连接酶,两者在体外条件下孵