ligation independent cloning-分子克隆技术ppt课件
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优点：依赖连接酶的克隆方法简单 高效，是克隆单个基因的常用的方 法。
不足：一方面，插入片段要经过限 制性内切酶处理，这样在实验设计 时就要考虑目的基因的DNA序列， 不能实现多基因的平行操作，不适 合高通量；另一方面，该过程使用 连接酶，不但延长了实验的周期， 而且也会带来载体自连背景，增加 了筛选工作量。
LIGATION-INDEPENDENT CLONING
1
经典的克隆方法
经典的克隆方法，主要分为以下两 种：(1)粘性末端连接，即载体质粒 和待插入的外源片段都通过合适的 限制性内切酶切割，产生相互匹配 的粘性末端，然后在连接酶作用下 重新形成磷酸二酯键而得到环化的 重组质粒；(2)平末端连接，平末端 连接中，载体和片段均为平端，都 没有粘性末端突出。
双酶切
PCR 双酶切
连接
2
LIGATION-INDEPENDENT CLONING
在很多情况下，重组DNA技术的应用都会受到 基因序列中原有的酶切位点的限制，尤其是多基 因片段的重组往往更容易受到限制酶酶切位点序 列的限制，研究者不得不使用一些非常稀有的酶 切位点或者采用其它的DNA重组方法，大大增 加了DNA重组的工作量和难度。因此，开发一 种不受序列限制而且需要准确重组的新方法就显 得十分重要。
化，互补的粘性末端退火形成环状分子，经转化
进大肠杆菌细胞后，细菌的修复系统修复这些突
出和缺口而得到正确重组子(如图)。 刘超等, 2011, 不依赖于连接反应克隆(LIC)的技术进展, 基因组学与应用生物学, Vol.30 No.13 (DOI: 10.5376/gab.cn.2011.30.0013)
各种酶切位点的麻烦，而且实验过程中可以实行并行操作，对所有的样品进行同 样的处理。 (2)速度快。T4 DNA Polymerase所需的时间只要40min，然后75℃热处理 20min，载体与目的片段共混孵育10min。相比经典的克隆方法更节约时间。 (3)克隆效率高且操作简便。如前所述，该方法不依赖连接酶，完全是靠粘性末端 配对退火，所以不匹配的末端不可能形成双链，载体自连背景低。 (4)相对而言费用较低。该方法中所需要的引物虽然有额外10~15 bp附加碱基， 但是相对而言位点特异性重组中所要求的引物是较短的，而且克隆过程中省去了 连接酶，也没有使用价格不菲的特殊重组酶。 综合以上几个方面考虑，LIC是一种适合于高通量基因克隆和蛋白质表达的优秀方 法。
Resistance
AMP AMP AMP AMP AMP
Tag(s) Size
2 kDa 45 kDa 28 kDa 58 kDa 14 kDa
yORF (your open reading frame)6
Vector
Tag
2BT 2CT 2GT 2NT 2ST
His6-tev-yORF His6-MBP-N10-tev-yORF His6-GST-tev-yORF His6-NusA-tev-yORF His6-Sumo-tev-yORF
Expression Host
E.coli T7 E.coli T7 E.coli T7 Ewk.baidu.comcoli T7 E.coli T7
Aslanidis和de Jong (1990)在1990年所提出的 不依赖连接反应克隆(ligation-independent cloning, LIC)充分满足了上述要求。这种方式不 仅克服了常规依赖连接酶克隆方法的缺点，而且 操作简便、方法快捷及连接效率高，应用日益广 泛。
在T4 DNA聚合酶的3′-5′外切酶活性下和一种特
SLIC用途广泛，它不仅可用于任何2个DNA片段的重组， 而且可用于多个DNA 片段的重组．
5
刘超等, 2011, 不依赖于连接反应克隆(LIC)的技术进展, 基因组学与应用生物学, Vol.30 No.13 (DOI: 10.5376/gab.cn.2011.30.0013)
LIGATION-INDEPENDENT VECTORS
该方法的基本原理如下：利用PCR技术在插入片段的两 侧分别加上几十bp 的同源末端，参加重组的片段分别 在没有dNTP存在的情况下用T4 DNA 聚合酶中的3’5’外切酶活性22℃ 处理，产生含有同源序列的5 端突 起．突出端的长度可以通过控制3’-5’外切酶活性的 作用时间来实现，加入dCTP即可终止外切酶活性．将 各片段的酶切产物按等摩尔比混合，在T4 DNA连接缓 冲液中于37℃ 完成突出单链的复性重组，形成含有大 的缺口的环状中间体．用此中间体转化大肠杆菌，利用 大肠杆菌本身的修复机制完成中间体的修复．
3
LIC方法的特点
LIC方法依赖于T4 DNA Polymerase的核酸外切酶活性，这样就要求被处理的线 性载体和片段的末端仅含有3种碱基，这样才可以有效控制反应以产生特定大小的 粘性末端。要求载体有较固定的粘性末端，且对于如何使载体线性化有特殊的要 求。
LIC方法的优势在于： (1)待克隆的PCR片段不需要限制性内切酶处理。这样就省去了在设计引物时考虑
4
LIC方法的改进——SLIC
在很多情况下，DNA 片段的克隆和表达，尤其是多基 因片段的重组往往会受到限制酶酶切位点序列的限制 ， 因此，建立一种不受序列限制而且需要准确重组的新方 法就显得十分重要．
Li & Elledge所建立的不依赖序列和连接的克隆方法 (sequence and ligation-independent cloning， SLIC)就能满足上述要求．该方法不受DNA序列的限制， 可以将任意序列的多个DNA片段组装到一起，而且不 需要连接反应即可完成体外的重组．
定的dNTP存在的缓冲液条件下反应，插入片段
能产生10~15个碱基的粘性末端(Aslanidis and
de Jong,1990)。载体和PCR片段依靠长的粘性
末端重组，此过程不需要连接酶。这种克隆方法
不需要考虑插入片段的序列，任何基因都能被克
隆到该载体中。而且，整个流程简单到不需要任
何限制性内切酶和连接酶，两者在体外条件下孵
不足：一方面，插入片段要经过限 制性内切酶处理，这样在实验设计 时就要考虑目的基因的DNA序列， 不能实现多基因的平行操作，不适 合高通量；另一方面，该过程使用 连接酶，不但延长了实验的周期， 而且也会带来载体自连背景，增加 了筛选工作量。
LIGATION-INDEPENDENT CLONING
1
经典的克隆方法
经典的克隆方法，主要分为以下两 种：(1)粘性末端连接，即载体质粒 和待插入的外源片段都通过合适的 限制性内切酶切割，产生相互匹配 的粘性末端，然后在连接酶作用下 重新形成磷酸二酯键而得到环化的 重组质粒；(2)平末端连接，平末端 连接中，载体和片段均为平端，都 没有粘性末端突出。
双酶切
PCR 双酶切
连接
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LIGATION-INDEPENDENT CLONING
在很多情况下，重组DNA技术的应用都会受到 基因序列中原有的酶切位点的限制，尤其是多基 因片段的重组往往更容易受到限制酶酶切位点序 列的限制，研究者不得不使用一些非常稀有的酶 切位点或者采用其它的DNA重组方法，大大增 加了DNA重组的工作量和难度。因此，开发一 种不受序列限制而且需要准确重组的新方法就显 得十分重要。
化，互补的粘性末端退火形成环状分子，经转化
进大肠杆菌细胞后，细菌的修复系统修复这些突
出和缺口而得到正确重组子(如图)。 刘超等, 2011, 不依赖于连接反应克隆(LIC)的技术进展, 基因组学与应用生物学, Vol.30 No.13 (DOI: 10.5376/gab.cn.2011.30.0013)
各种酶切位点的麻烦，而且实验过程中可以实行并行操作，对所有的样品进行同 样的处理。 (2)速度快。T4 DNA Polymerase所需的时间只要40min，然后75℃热处理 20min，载体与目的片段共混孵育10min。相比经典的克隆方法更节约时间。 (3)克隆效率高且操作简便。如前所述，该方法不依赖连接酶，完全是靠粘性末端 配对退火，所以不匹配的末端不可能形成双链，载体自连背景低。 (4)相对而言费用较低。该方法中所需要的引物虽然有额外10~15 bp附加碱基， 但是相对而言位点特异性重组中所要求的引物是较短的，而且克隆过程中省去了 连接酶，也没有使用价格不菲的特殊重组酶。 综合以上几个方面考虑，LIC是一种适合于高通量基因克隆和蛋白质表达的优秀方 法。
Resistance
AMP AMP AMP AMP AMP
Tag(s) Size
2 kDa 45 kDa 28 kDa 58 kDa 14 kDa
yORF (your open reading frame)6
Vector
Tag
2BT 2CT 2GT 2NT 2ST
His6-tev-yORF His6-MBP-N10-tev-yORF His6-GST-tev-yORF His6-NusA-tev-yORF His6-Sumo-tev-yORF
Expression Host
E.coli T7 E.coli T7 E.coli T7 Ewk.baidu.comcoli T7 E.coli T7
Aslanidis和de Jong (1990)在1990年所提出的 不依赖连接反应克隆(ligation-independent cloning, LIC)充分满足了上述要求。这种方式不 仅克服了常规依赖连接酶克隆方法的缺点，而且 操作简便、方法快捷及连接效率高，应用日益广 泛。
在T4 DNA聚合酶的3′-5′外切酶活性下和一种特
SLIC用途广泛，它不仅可用于任何2个DNA片段的重组， 而且可用于多个DNA 片段的重组．
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刘超等, 2011, 不依赖于连接反应克隆(LIC)的技术进展, 基因组学与应用生物学, Vol.30 No.13 (DOI: 10.5376/gab.cn.2011.30.0013)
LIGATION-INDEPENDENT VECTORS
该方法的基本原理如下：利用PCR技术在插入片段的两 侧分别加上几十bp 的同源末端，参加重组的片段分别 在没有dNTP存在的情况下用T4 DNA 聚合酶中的3’5’外切酶活性22℃ 处理，产生含有同源序列的5 端突 起．突出端的长度可以通过控制3’-5’外切酶活性的 作用时间来实现，加入dCTP即可终止外切酶活性．将 各片段的酶切产物按等摩尔比混合，在T4 DNA连接缓 冲液中于37℃ 完成突出单链的复性重组，形成含有大 的缺口的环状中间体．用此中间体转化大肠杆菌，利用 大肠杆菌本身的修复机制完成中间体的修复．
3
LIC方法的特点
LIC方法依赖于T4 DNA Polymerase的核酸外切酶活性，这样就要求被处理的线 性载体和片段的末端仅含有3种碱基，这样才可以有效控制反应以产生特定大小的 粘性末端。要求载体有较固定的粘性末端，且对于如何使载体线性化有特殊的要 求。
LIC方法的优势在于： (1)待克隆的PCR片段不需要限制性内切酶处理。这样就省去了在设计引物时考虑
4
LIC方法的改进——SLIC
在很多情况下，DNA 片段的克隆和表达，尤其是多基 因片段的重组往往会受到限制酶酶切位点序列的限制 ， 因此，建立一种不受序列限制而且需要准确重组的新方 法就显得十分重要．
Li & Elledge所建立的不依赖序列和连接的克隆方法 (sequence and ligation-independent cloning， SLIC)就能满足上述要求．该方法不受DNA序列的限制， 可以将任意序列的多个DNA片段组装到一起，而且不 需要连接反应即可完成体外的重组．
定的dNTP存在的缓冲液条件下反应，插入片段
能产生10~15个碱基的粘性末端(Aslanidis and
de Jong,1990)。载体和PCR片段依靠长的粘性
末端重组，此过程不需要连接酶。这种克隆方法
不需要考虑插入片段的序列，任何基因都能被克
隆到该载体中。而且，整个流程简单到不需要任
何限制性内切酶和连接酶，两者在体外条件下孵