MALDI样品制备方法

MALDI-TOF的样品制备

¾样品制备

¾基质选择

¾样品净化

样品制备的一般顺序：

选择基质

制备基质溶液

制备样品溶液

混匀基质和样品

点靶

放干

100 pmol/µl

多聚物

10 -100 pmol/µl 核酸

0.1 -10 pmol/µl (糖蛋白10 pmol/µl)多肽和蛋白质

理想浓度样品类型

理想的样品浓度

注: 1 pmol/ul = 10-6M 常见的样品制备方法

干燥液滴法

真空干燥法

压碎结晶法

快速蒸发法

双层法

夹心法

电喷雾法

快速点样法

预点基质法

先点样品法 压片法

干燥液滴法

操作步骤：

•在适当的溶剂中配制新鲜的饱和基质溶液

•离心,吸取5-10 uL基质溶液上清,加到小离心管中

•加入1-2 uL样品溶液(1-100 mM) ，涡旋混匀

•吸取0.5-2 uL点靶

•室温自然干燥

本法最为常用，适用于大多数情况。

干燥液滴法的优缺点

优点

1.方法简单，适用于很多种样品

2.具有较好的耐盐性

3.适用于混合物

4.可以洗去表面的不挥发性盐份

缺点

1.使用某些基质（如2,5-dihydroxybenzoic acid ）时，

结晶不均匀，容易长在液滴的外环边上。

2.有些组份与基质不能形成共结晶。

真空干燥法

操作步骤：

•在适当的溶剂中配制新鲜的饱和基质溶液

•离心,吸取5-10 uL基质溶液上清,加到小离心管中

•加入1-2 uL样品溶液(1-100 mM) ，涡旋混匀

•吸取0.5-2 uL点靶

•把靶放入真空干燥器内，抽真空到10-2Torr以下，使溶液快速干燥

注：本法是干燥液滴法的一种变体。

真空干燥法的优缺点

优点

减小结晶颗粒的大小

提高结晶的均匀程度

提高质量准确度和分辨率

缺点

效果不总是好于干燥液滴法

需要额外的真空泵

碱金属离子加合峰较强

压碎结晶法

操作步骤：

•在适当的溶剂中配制新鲜的饱和基质溶液

•离心,吸1 uL基质溶液点到靶上，自然放干

•取一块干净的玻璃片盖在基质晶体上按压

•轻轻刷去多余的基质碎颗粒

•吸取5-10 uL基质溶液上清,加到小离心管中

•加入1-2 uL样品溶液(1-100 mM) ,涡旋混匀

•吸取1 uL混合液点到压碎的干燥基质上

•室温自然干燥1分钟后，把靶浸入蒸馏水中，以除去不挥发性溶剂

•用吸水纸吸去多余水份，自然放干

注：本法适用于含有高浓度不挥发性物质（如甘油、尿素、DMSO等）的样品

压碎结晶法（简化版）

操作步骤：

•在适当的溶剂中配制新鲜的饱和基质溶液

•离心，吸1 uL基质溶液，用枪头在靶上涂刮，自然放干•吸取5-10 uL基质溶液上清,加到小离心管中

•加入1-2 uL样品溶液(1-100 mM) ,涡旋混匀

•吸取1 uL混合液点到压碎的干燥基质上

•室温自然干燥1分钟后，把靶浸入蒸馏水中，以除去不挥发性溶剂

•用吸水纸吸去多余水份，自然放干。

注：本法适用于含有高浓度不挥发性物质（如甘油、尿素、DMSO等）的样品

压碎结晶法的优缺点

优点

1.简单有效

2.对高浓度杂质有较好的容耐性

3.结晶更均匀，点与点之间的重现性更好

缺点

1.比较费时

2.难以高通量

3.吸取基质溶液时，要防止吸入未溶解的基质颗粒

快速蒸发法

操作步骤：

•在丙酮中加入1-2%的水或0.1%TFA(v/v)，再加入基质，使其浓度至半饱和（饱和至1/3饱和之间）

•吸0.5 uL基质点靶

•吸1 uL样品溶液点在放干的基质颗粒上，放干

•除盐：吸5-10 uL0.1% TFA加到样品点上，放置2-10秒钟，吹去液滴

注：本法的分辨率和准确度最好

快速蒸发法的优缺点

优点

1.结晶均匀，颗粒小，无甜点效应

2.信号强度与浓度的相关性更好

3.灵敏度、分辨率和准确度更好

4.便于除盐

5.可批量预点基质(类似于PAC靶)，便于通量分析

缺点

1.制样的重现性较差，点与点之间的重现性较差

2.对肽有效，但对蛋白的效果久佳

双层法

操作步骤：

•先配底层基质：用易挥发溶剂（如丙酮或甲醇）配制浓的基质溶液(5-50 mg/mL)

•吸0.5 uL底层基质点靶，放干

•再配上层基质：在适当的溶剂（对基质的溶解能力不能太强太快）中配制新鲜的饱和基质溶液

•离心,吸取5-10 uL基质溶液上清,加到小离心管中

•加入1-2 uL样品溶液,涡旋混匀

•吸取0.5 uL点在放干的基质颗粒上，放干

•除盐：吸5-10 uL0.1% TFA加到样品点上，放置2-10秒钟，吹去液滴

注：本法结合了压碎晶体法和快速蒸发法的特点，分辨率和准确度很好