毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式

毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式通过转化DNA与毕赤酵母基因组中同源序列的同源重组，毕赤酵母与酿酒酵母一样可产生

稳定的阳性转化子。这些重组的菌株在无选择压力条件下，即使其携带的基因是多拷贝的，

也表现出极度稳定性。常用的表达载体都含有HIS4基因，编码组氨酸脱氢酶基因，这些载

体经限制性内切线性化以后，可在AOX1或his4位点进行同源重组，从而产生HIS+重组子。单交换插入比双交换（替换）要更容易发生，多拷贝事件自发发生的几率只有单交换几率的

1-10%。

1. 基因插入AOX1或aox1::AGR4位点

GS115 的AOX1或KM71 的aox1::AGR4 位点可以与载体上AOX1位点（AOX1 启动

子，AOX1 转录终止子TT或下游3’AOX1三个位点发生同源重组，这样就在AOX1 或

aox1::AGR4 基因的上游或下游插入一个或多个基因拷贝。因为插入的表达盒没有破坏

原有基因组中的AOX1，所以转化子在GS115 中为HIS+ Mut+表型，在KM71 中为HIS+

Muts表型。

2. 基因替换AOX1位点

在his4 菌株如GS115 中，载体及基因组中AOX1启动子及3’AOX1 区的双交

换事件(取

代)，结果AOX1 编码区全部被取代，产生HIS＋Muts 表型。以AOX1 位点由基

因替

代而产生的Muts表型作为指示，可很容易地筛选出HIS＋转化子的Mut 表

型。基因取

代的结果是缺失了AOX1 位点（Muts），增加了含有pAOX1、目的基因、HIS4

的表达

盒。基因取代（双交换事件）不如基因插入（单交换事件）发生得多。 3. 基

因插入His4位点

GS115（Mut+）或KM71（Muts）中，载体上HIS4 基因与染色体上his4 位点之

间发生

单交换事件，结果在his4位点插入一个或多个基因拷贝。由于基因组上AOX1

或

aox1::AGR4 位点未发生重组，这些His＋转化子的表型均与亲本菌株相同。 4. 多拷贝插入

尽管多拷贝事件自发发生的概率很低，但是通过在培养基中加入选择性标记，

还是很容

易在转化子中筛选到插入多拷贝的表达核的转化子。