醋酸纤维薄膜电泳 原理 步骤 详细

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8.定量(Quantify) （1）洗脱比色：将各蛋白质区带仔细剪下，分臵各 试管中，另从空白背景剪块平均大小的膜条臵于 空白管中。各管加入 0.4mol/l NaOH 4ml, 于 37 ℃ 水浴 20 分钟（不时振荡），待颜色脱净即用波长 620nm比色，以空白管调零读取各管吸光度。 （2）计算 吸光度总和（T） =A+α1+α2+β+γ（吸光度）
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Ponceau S
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丽春红S染色扫描法结果
蛋白组分
Alb 1 2
g/L
35～52 1.0～4.0 4.0～8.0 5.0～10.0
占蛋白百分数 （ %）
57～68 1.0～5.7 4.9～11.2 7.0～13

6.0～13.0
9.8～18.2
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Schematic representation of a protein electrophoresis
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几种疾病的蛋白电泳变化 Abnormal serum protein electrophoresis
病名 肾病 肝硬化 原发性肝癌 多发性骨髓瘤 慢性炎症 无丙种球蛋白症 双白蛋白血症 Alb ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 1 ↑ ↓ AFP ↑ ↑ 2 ↑ ↑ ↓ ↑ - 桥 ↑ ↓ ↑↑ ↑ ↑↑ ↑ ↓↓
醋酸纤维薄膜电泳
Cellulose acetate membrane electrophoresis，CAME
李莉
http://www.shsmu.edu.cn/
讲课内容
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醋酸纤维素
醋酸纤维薄膜的特点
影响电泳结果的因素
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳
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一、醋酸纤维素（Cellulose acetate ） 是 纤 维 素 醋 酸 酯 (acetate ester of cellulose )，由纤维素的羟基进行乙酰化后制得， 将它溶于有机溶剂涂抹成均匀的薄膜，待有机 溶剂挥发后，即为白色不透明的醋酸纤维薄膜 厚度：0.15mm
2.电渗(electroosmosis)作用小 3. 需加样量少 4. 亲水性较小
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血清蛋白质各组分的相对分子重量及等电点
Molecular weight and isoelectric point of serum proteins
serum protein
MW
66248 130000 200000 1300000 1500000
pI
4.86 5.02 5.02 5.12 6.8～7.3
Alb 1 2
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Amido black 10B
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氨基黑10B染色洗脱法结果
蛋白组分 Alb 1 2 平均值 （%） 65.59 3.12 6.16 9.09 17.40 参考范围 （ %） 57.45～71.73 1.76～4.48 4.04～8.28 6.79～11.39 11.85～22.97
[ 原理 ] CAME是以醋纤膜（CAM）作支持物的一种区 带电泳技术。 将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8.6的缓冲 液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。 由于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电 荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳 迁移率不同，彼此得以分离。 Ions have different migration rates depending on their total charge, size, and shape, and can therefore be separated.
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EQ V = ———— 6r
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[器材和试剂] 1.器材 （1）醋酸纤维薄膜（8×2mm） （2）点样器 （3）染色皿，漂洗器，镊子 （4）722型分光光度计 （5）电泳仪：直流电源整流器，水平电泳槽 2.试剂 （1）巴比妥缓冲液（pH8.6 I=0.06） （2）氨基黑10B染色液 （3）漂洗液：95%乙醇、冰醋酸、H2O （4）洗脱液：0.4mol/L NaOH
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血清蛋白组分的相对百分数： A%=A/T×100% α1%=α1/T×100% α2%=α2/T×100% β%=β/T×100% γ%=γ/T×100%
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思
考
题
问答题 1.CAME的基本原理是什么？ 2.CAME分离血清蛋白电泳时应注意哪些问题？
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醋酸纤维素薄膜电泳装臵示意图
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6.染色(Stain) 电泳完毕后断电，用镊子取出薄膜条投入染液 5 ~10 分钟，染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使 染色充分 7．漂洗(Wash) 从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入漂 洗皿中反复漂洗，直至背景漂尽为止。此时清晰 可见5条色带，待干
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[操作] 1.将电泳槽臵于水平平台上。将缓冲液注入电泳槽 中两边的电极槽缓冲液的高度要在同一点平面上 2.在醋纤膜一端欲点样处作好标记，然后将薄膜放 进缓冲液中，湿润速度按膜吸收缓冲液的快慢而 定，应让其自然浸润 3.将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的薄膜取出， 用滤纸吸去膜上过多的缓冲液 4.用加样器蘸取血清（约5ul）,垂直印在CAM粗糙面 上，待样品全部渗入薄膜内后，移开点样器
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Magnification of Cellulose Acetate filter
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讲课内容
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醋酸纤维素
醋酸纤维薄膜的特点
影响电泳结果的因素
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳
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二、醋酸纤维薄膜的特点
Characteristics of Cellulose Acetate Membrane 1.吸附作用小
①点样时血清点加不均匀 ②薄膜局部干燥 ③电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少 ④缓冲液变质 ⑤电泳时薄膜位臵不正,与电流方向不平行
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2. 电泳图谱分离不清 ①标本加量过多 ②电流过低 ③薄膜结构过分致密，透水性差 ④薄膜表面干燥
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3. 电泳速度慢
①电流过低 ②供给薄膜的液量不足 ③电泳时温度过低 ④缓冲液离子强度过高 ⑤薄膜中杂质多
ห้องสมุดไป่ตู้
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-桥
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双白蛋白血症
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讲课内容
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醋酸纤维素
醋酸纤维薄膜的特点
影响电泳结果的因素
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳
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三、影响电泳结果的因素 Factors affecting results 1. 电泳图谱不齐
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讲课内容
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醋酸纤维素
醋酸纤维薄膜的特点
影响电泳结果的因素
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳
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血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳
Separate serum protein in cellulose
acetate membrane electrophoresis
http://www.shsmu.edu.cn/
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醋酸纤维素薄膜规格及点样位臵示意图
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5．电泳(Electrophoresis) （1）加样后，将薄膜条架于支架两端，无光泽面朝 下（点样面），点样侧臵于阴极端，膜两侧分别 塔上纱布，纱布一端垂入缓冲液中。薄膜应位正， 平直无弯曲，加上槽盖平衡5分钟后通电电泳 （2）正确连接电泳槽与整流器对应的正负极。开启 电源通电。电压 10~15V/cm膜总宽。电泳40~60分 钟，泳动距离约达3.5~4cm时即可断电
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4. 白蛋白（Albumin)区带中间部分不着色，染色不足 可能为染料使用过久或加血清(Serum)过多 5.γ球蛋白(γ-globin)向反方向移动 主要因为电渗（ electro-osmosis）现象 可升高缓冲液液面或加大电流量加以改进，并 注意两侧电泳槽内缓冲液液面是否在同一水平。