枯草芽孢杆菌的分离及筛选教学文案

枯草芽孢杆菌的分离
及筛选
微生物设计性实验
枯草芽孢杆菌的分离及筛选
1 实验目的
掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。

了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。

根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。

2 实验原理
枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。

需氧菌。

有的菌株是α -淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。

广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。

选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。

利用稀释涂步法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。

然后，进行初筛与纯化，鉴定参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。

再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。

3 实验材料
3.1 选择培养基
本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基。

配方：
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
氯化钠 5.0g
可溶性淀粉 10.0g
琼脂 20g
蒸馏水 1000ml
调整 pH 至 7.2
配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。

3.2 溶液或试剂
牛肉膏 1.25g
蛋白胨 2.5g
氯化钠 1.25g
可溶性淀粉 2.5g
琼脂 5g
碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克，100毫升
0.01NHCL。

3.4 仪器或其他用品
平板培养皿10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。

4 实验流程
倒平板→制备梯度稀释液→涂布→培养→初筛→复筛→纯化→保存
5 实验步骤
实验前准备
制备淀粉培养基，无菌水，在121摄氏度下灭菌20min。

倒平板。

把接种工具，培养基，和其他用品全部在超净工作台上摆好，进行紫外线灭菌
30min。

5.1 制备土壤稀释液
取土样时最好选取如花坛等地方的土样，选好采样地点，铲产去表层
5cm，取5～15cm处。

用无菌器具规范采样几十克，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，记录采样时间、地点、采样环境等以备考证。

采样后应尽快分离。

振摇约二十分钟，使土样与水充分混合，将细胞分散。

放入盛有99ml无菌水三角瓶中，常压80度的水浴处理样品1小时后，取出。

用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推，制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释度的土壤溶液。

5.2 涂布
将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-3、10-4、10-5三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-3、10-4、10-5三管土壤稀释液中各吸取
0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。

用无菌涂布器涂布。

右手拿无菌涂布器平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。

室温下静置5～10min，使菌液浸入培养基。

5.3 培养
将淀粉培养基平板倒置于30°C培养箱中培养1～3d。

5.4 初筛
观察菌落表面粗糙不透明，呈污白色或微黄色，将这样的菌种单个菌落分别挑取少许细胞接种到培养基上，置于30°C的培养箱中培养，若发现有杂菌，需要再一次进行分离纯化。

（如不能用肉眼更好的观察，可对其进行革兰氏染色，在显微镜下观察，与标准菌种比较。

）
5.8 复筛
测定其淀粉酶活。

5.8.1 试剂和器材
1、试剂：
（1）碘原液：称取碘11克，碘化钾22克，加水溶解，稀释至500毫升。

（2）稀碘液：取碘原液2毫升，加碘化钾20克，稀释至500毫升，此试剂随配随用。

（3）2%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉2克，加5毫升蒸馏水，搅拌混和，再徐徐倾入70毫升煮沸的蒸馏水中。

继续煮沸2分钟，冷却至室温，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH为6）
（4）柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）45.23克，柠檬酸（C6H8O7·H2O）8.068克，加水溶解，稀释至1000毫升。

（5）标准比色液：称取氯化钴（CoCL2·6H2O）25克和重铬酸钾3.34克溶于100毫升0.01N HCL，其五倍稀释作标准。

（6）样品：细菌-α淀粉酶
2、器材
（1）电热恒温水浴（2）试管
（3）量筒（4）吸量管（1ml）
5.8.2 操作方法：
1、取试管1支，加20毫升2%淀粉，混匀，在30℃水浴中，使管内温度达到30℃。

2、将淀粉酶0.5ml加到30℃的淀粉液中，混匀，在30℃水浴中保温，自加入记时，经5分钟后取反应液1毫升，加入盛有5毫升稀碘液的试管中。

混匀，目测比色，每隔一定时间重复测定，直至呈色与标准比色颜色相同为止，记录反应进行的时间。

3、计算。

在上述条件下，每一小时催化1毫升2%可溶性淀粉水解的酶量，定为一个酶活力单位。

5.9 纯化并保存
菌种保存时一般都需要不受杂菌污染，菌种变异很少，并能尽量保持细菌的形态和生理性状不发生变化。

同时，做好以下工作：
（1）做好菌种保存记录，注明菌种名称，分离年月日、分离者姓名、分离地点等。

（2）防止杂菌污染及意外事故，把菌种保存在2—3只试管中备用。

（3）原始菌种妥善保存。

6 结果与分析
6.1 分离到枯草芽孢杆菌菌的株数
6.2 枯草芽孢杆菌产酶活性大小及形态观察鉴定结果
【注明参考文献，格式参考学术论文样式】
枯草芽孢杆菌的鉴定实验
1、形态的观察（形状、颜色、质地、透明度等）
（1）单个菌体的形态
（2）群体形态的观察
2、革兰氏染色
3、芽孢染色
4、菌体大小测量
5、枯草芽孢杆菌的生理生化鉴定：
一、过氧化氢酶测定
1、原理：过氧化氢酶能催化过氧化氢分解成水和氧
2、试剂：3～10%过氧化氢
培养基：肉汤琼脂培养基
3、操作步骤：将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，30 培养 1～2 天。

取一干净载玻片，在上面加一滴 3～10%的过氧化氢，挑取一环培养 1～2 天的菌苔，在过氧化氢溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现，记作过氧化氢酶阳性，无气泡者为阴性。

也可将液直接加入斜面上，观察气泡的产生。

二、需氧性试验
1、原理：不同种类的芽孢杆菌对氧气的需求性常有差异，因此本实验可作为鉴定芽孢杆菌的一个较重要指标。

2、培养基：半固体培养基
3、操作步骤：用一小环的肉汤菌液穿刺接种到上述培养基中（必须穿刺到管底），一般于 30 培养 3— 7 天观察结果。

若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿着穿刺线上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌三、乙酰甲基甲醇实验 1、原理：本实验是测定芽孢杆菌（或其他细菌）发酵葡萄糖的变化。

有些芽孢杆菌发酵葡萄糖产酸，并将产生的酸进一步转化为中性化合物，如乙酰甲基甲醇或的胍基起作用，生成红色化合物，即表示 2,3-丁二醇。

乙酰甲基甲醇在碱性环境中可被空气中的氧气氧化成二乙酰，后者与蛋白胨中精氨酸所含 V.P. 试验阳性。

若在培养基中加入少量肌酸以补充胍基，可加速反应。

反应式如下： 2 丙酮酸—— >乙酰甲基甲醇 + 2 二氧化碳； -2H 乙酰甲基甲醇———— >二乙酰； +KOH 缩合二乙酰 + NH=C(NH 2)2———— >红色化合物 2、培养基和试剂培养基：蛋白胨 5g，葡萄糖 5g， NaCl 5g ，蒸馏水 1000ml。

调节 PH 6.5，每管分装 4— 5ml ，0.06MPa（ 8lbf/in2 ） 30min 灭菌试剂： 3、步骤： 1.接种与培养将芽孢杆菌测试菌接种于上述培养液中，一般于 30 摄氏度培养 4 天。

2.
结果观察在培养 4 天后，取培养液（约 2ml）和等量的 40%NAOH 相混合，如少量肌酸（约 0.5— 1mg），充分振荡， 2— 5min 后如培养液呈红色，即为V.P. 试验阳性，有时须放置更长时间才出现红色反应。

四、淀粉水解 1、原理：许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将培养基中的淀粉水解成无色糊精等小分子物质或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。

2、
培养基及试剂：培养基：在肉汤琼脂中添加 0.2% 的可溶性淀粉，分
装于三角瓶。

0.1MPa(15lbf/in2)20min 灭菌备用。

试剂： 3、步骤：将培养基融化后，冷却至 50 摄氏度左右，倒成平板，凝固后取菌种点钟于平板上（每皿点钟 2 点），一般于 30 摄氏度培养 2— 4 天，形成菌落后，在平板上滴加卢哥尔氏碘液，以铺满菌落为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有五色透明圈出现，说明淀粉被水解，透明圈的大小，可表明水解能力的大小。

卢哥尔氏碘液 40%NAOH( 或 KOH) ，肌酸。

附表：
培养基的配方
肉汤琼脂培养基
牛肉膏5克
蛋白胨 10克
氯化钠
５克
琼脂
１８克
蒸馏水
１０００毫升
葡萄糖 10 克
pH 121℃灭菌 20min 7.0-7.2 淀粉培养基牛肉膏
５克蛋白胨
１０克氯化钠
５克可溶性淀粉
２克琼脂
１５－２０克蒸馏水
１０００毫升 121℃灭菌 20min Ｖ—Ｐ．实验培养基（半固体培养基）葡萄糖
５克蛋白胨
５克氯化钠
５克蒸馏水
１０００毫升ｐＨ
６．５ 121℃灭菌 20min
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