巨噬细胞提取方法
巨噬细胞中基因敲除
巨噬细胞中基因敲除
巨噬细胞中的基因敲除是一种基因编辑技术，用于研究特定基因在巨噬细胞中的功能和作用。
这种技术可以通过使用特定的基因编辑工具，如CRISPR-Cas9系统，来精确地删除或失活巨噬细胞中的某个基因，从而观察这个基因缺失后对巨噬细胞功能的影响。
巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，具有吞噬、杀菌、抗原呈递等多种功能。
因此，研究巨噬细胞中特定基因的功能，对于深入了解免疫系统的功能和机制，以及开发新的治疗策略具有重要意义。
在进行巨噬细胞基因敲除实验时，首先需要选择合适的基因编辑工具和实验方法，然后制备巨噬细胞，并将基因编辑工具导入到细胞中。
接下来，通过筛选和鉴定，确定基因编辑是否成功，并观察基因缺失对巨噬细胞功能的影响。
需要注意的是，基因敲除实验具有一定的复杂性和风险性，需要严格遵循实验规范和伦理要求。
同时，由于巨噬细胞在免疫系统中的重要作用，基因敲除实验可能会对机体的免疫功能产生一定的影响，因此需要谨慎评估和控制实验风险。
总之，巨噬细胞中的基因敲除是一种重要的实验手段，可以用于研究特定基因在巨噬细胞中的功能和作用，为深入了解免疫系统的功能和机制提供重要的实验依据。
小鼠腹腔巨噬细胞体内吞噬功能测定
小鼠腹腔巨噬细胞体内吞噬功能测定摘要】目的建立小鼠腹腔巨噬细胞体内吞噬功能测定方法，并测定其吞噬率。
方法用6%淀粉肉汤诱导小鼠腹腔产生巨噬细胞，体内吞噬5%鸡红细胞，并测定其吞噬率。
结果小鼠腹腔巨噬细胞成活率＞98%，平均吞噬百分率和平均吞噬指数分别是38.04%和0.39。
结论本实验方法可以用于小鼠腹腔巨噬细胞的相关研究。
【关键词】巨噬细胞吞噬功能小鼠巨噬细胞属于免疫细胞，有抗肿瘤、免疫调节等多项功能[1]。
巨噬细胞具有很强的吞噬功能，在体内外均能吞噬颗粒物质，将巨噬细胞与颗粒物质(如白色假丝酵母菌、鸡红细胞或葡萄球菌等)混合孵育一定时间后，颗粒物质可被巨噬细胞吞噬，本次实验颗粒物质是鸡红细胞CRBC，观察巨噬细胞吞噬CRBC的百分率和吞噬指数，了解其吞噬功能。
巨噬细胞可以用各种方法和各种来源获得，以小鼠腹腔巨噬细胞取材最为经济实用。
1 材料与方法1.1 实验动物健康小白鼠，体重20-25g，8-12周龄，雄性，由第四军医大学实验动物中心提供。
1.2 主要试剂 6%淀粉肉汤，5%鸡红细胞，瑞氏染液，台盼蓝染液，小牛血清,EMDM培养液。
1.3 主要仪器 Nikon双目光学显微镜，TDL-60B湘仪离心机。
1.4 材料一次性5ml注射器，手术剪刀，镊子，小试管，尖嘴吸管，牛鲍计数板。
1.5 小鼠腹腔巨噬细胞体内吞噬功能测定小鼠的腹腔注射6%淀粉肉汤液1.0ml，诱导小鼠产生腹腔巨噬细胞。
48h后小鼠腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水悬液1.0ml。
30min后，颈椎脱臼处死小鼠，吸取腹腔液（腹腔液太少可用含10%小牛血清的EMDM液冲洗小鼠腹腔以收集腹腔液），1500r/min 8min离心，洗涤腹腔液，取少量腹腔液置于洁净载玻片上，推成涂片，瑞氏染色后油镜下（10*100）观察小白鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞现象，每片计数200个巨噬细胞，计数吞噬率和吞噬指数[1]。
吞噬率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞/200个巨噬细胞*100%吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞数*2/200个巨噬细胞1.6 细胞活力鉴定取1滴细胞悬液加1滴台盼蓝染液混匀，静置5分钟后滴入牛鲍计数板，观察死细胞，活细胞情况。
小鼠原代腹腔巨噬细胞提取方法(超详细~)
小鼠原代腹腔巨噬细胞提取方法（超详细）
实验前准备：
超净工作台、水平式低速离心机、10ml离心管、2.5mL注射器、细胞吸管、3％肉汤淀粉溶液、无菌眼科剪、无菌眼科镊、75％酒精溶液、无菌PBS溶液、DMEM细胞培养基、胎牛血清、细胞计数版、倒置显微镜等。
实验操作步骤
（1）我们对健康雄性C57BL/6小鼠腹腔注射3％肉汤淀粉溶液1 mL，持续3d，以便刺激腹腔巨噬细胞产生。
注：3％肉汤淀粉溶液提前配制，高温除菌后使用。
（2）小鼠颈椎脱臼处死，用75％酒精溶液对其充分消毒。
（3）固定小鼠，暴露腹腔。
（4）无菌条件下用剪刀沿腹中线剪开皮肤，暴露腹膜，切记勿伤及腹膜壁。
（5）向腹膜腔注射DMEM培养基3mL，并轻柔小鼠腹部片刻。
（6）用吸管反复冲洗腹膜腔并回收灌洗液。
（7）移入无菌的10ml的离心管中，以1000r/min，离心 5min，弃上清液。
（8）加入 5ml DMEM 培养基重悬细胞，上述步骤重复两次。
（9）加入含有10% FBS的DMEM培养液重悬细胞，细胞计数，调整细胞浓度为1×106 个/mL。
（10）将细胞悬液接种于 6 孔培养板中，放于37℃、5％二氧化碳
饱培养箱中培养，待后续实验研究。
脂多糖刺激巨噬细胞分泌含miR-155-5p_的外泌体促进肝星状细胞的活化及迁移
肝纤维化是肝炎-肝硬化-肝癌三部曲的重要病理表型，研究表明抑制肝纤维化能有效减缓肝炎向肝癌的进程［1］。
但目前临床上针对肝纤维化没有行之有效的治疗方案［2］。
因而，深入探索纤维化机制为寻找延缓乃至逆转纤维化的治疗靶点和节约医疗资源具有十分重要意义。
肝巨噬细胞在肝纤维化中发挥至关重要的作用，其主要功能与炎症、肝细胞损伤、肝星状细胞的活化和纤维化密切相关［3］。
肝星状细胞在肝脏生理和纤维生成起到关键作用，其能够受到肝巨噬细胞的调控［4］。
近来Lipopolysaccharide stimulates macrophages to secrete exosomes containing miR-155-5p to promote activation and migration of hepatic stellate cellsLIN Jiayi 1,LOU Anni 1,LI Xu 1,21Department of Emergency Medicine,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;2Key Laboratory of First Aid and Trauma Research,Ministry of Education,Hainan Medical College,Haikou 571199,China摘要：目的探索脂多糖（LPS ）刺激下的巨噬细胞来源的外泌体对肝星状细胞的激活及迁移能力的影响及分子机制。
方法以100ng/mL 丙二醇甲醚醋酸（PMA ）处理人THP-1巨噬细胞24h ，诱导其分化为巨噬细胞，给予脂多糖刺激后收集巨噬细胞的培养上清，运用超速离心法提取外泌体并加以鉴定。
荧光定量PCR （qRT-PCR ）检测外泌体中miR-155-5p 的表达。
采用Transwell 共培养体系观察巨噬细胞分泌的外泌体对肝星状细胞LX2增殖、氧化应激、迁移和I 型胶原等纤维化标志物表达的影响。
肺泡巨噬细胞的制备及RNA提取
PAM (肺泡巨噬细胞) 的制备一、准备工作1、高压灭菌好的1×PBS两瓶（1000ml/瓶）、小托盘1个、500ml烧杯2个、大剪刀1把、镊子2把和50ml离心管若干。
另需准备好解剖小猪用的手术刀片、棉线等。
2、细胞培养液的配备生长液：10%胎牛血清+DMEM培养基+双抗+两性霉素二、制备细胞1、将小猪腋下放血致死2、从颈部剖开腹腔，避免伤到气管和肺脏3、用棉线结扎气管上部，然后剪断气管，将气管和肺脏完整取出来，放到准备好的大烧杯中4、转移到细胞培养室，用PBS冲洗干净肺脏表面，弃除杂物5、在操作工作台上用灭菌好的剪刀剪断结扎了的气管。
（以下步骤需无菌操作）6、吸取PBS灌进肺内，充盈后，用手轻轻捏揉肺叶数次后，把肺内液体倒出到蓝盖瓶中。
7、重复灌洗2次8、将所收集的液体分装到50ml离心管中，4℃2000g、10min离心9、视情况可以将沉淀细胞再用PBS或培养基清洗离心1次10、在细胞沉淀中，加入2ml Trizol试剂，用移液器充分吹打、混匀，直到形成清亮不粘稠的液体（表明细胞被充分溶解，基因组DNA被充分打断）。
11、后续可按Trizol试剂的标准操作抽提总RNA。
也可以把此Trizol试剂保存在冰箱中保存。
RNA抽提第二阶段：分离阶段6．加入0. 2 ml 氯仿,剧烈混匀20 s ,室温放置10 min 。
7．10 000 rpm/min,4 ℃离心15 min。
第三阶段：RNA的沉淀8．吸取上清于5 ml 离心管中,加入0.5mL异丙醇（预冷）颠倒混匀5 次,室温放置10 min 。
(注意：在吸取上清时，切不可将上清与酚交界处的蛋白及下面的酚吸起，造成RNA的污染) 9．10 000 rpm/min,4 ℃离心10min。
（RNA沉淀在离心后形成胶质片状沉淀附着于试管壁）第四阶段：RNA的漂洗10．去上清,沉淀用1ml 75 %乙醇漂洗，振荡，7 000 rpm/min,4 ℃离心10 min，倒净乙醇。
小鼠原代骨髓细胞提取及诱导骨髓来源的巨噬细胞分化方法(详细版)
小鼠原代骨髓细胞提取及诱导骨髓来源的巨噬细胞分化实验前准备：超净工作台、水平式低速离心机、10ml离心管、75cm2细胞培养皿、2mL注射器、无菌40μm尼龙过滤器、细胞吸管、无菌眼科剪、无菌眼科镊、75％酒精溶液、无菌PBS溶液、红细胞裂解液、DMEM细胞培养基、胎牛血清、M-CSF因子、细胞计数版、倒置显微镜等。
操作步骤：（1）C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，用75％酒精溶液对其充分消毒，固定小鼠。
（2）无菌条件下分离并取下小鼠的股骨和胫骨，小心不要打破骨头。
然后放入事先含有75%酒精的75cm2的细胞培养皿中。
（3）移入生物安全柜中，进一步分离去除骨周围组织，然后将其移入含有1×PBS的另一细胞培养皿中清洗，最后再将其转移另一 75cm2细胞培养皿（含有1%双抗的DMEM的细胞培养基）中等待下一步处理。
（4）用眼科组织剪去除股骨和胫骨的骨两端，然后含有2ml DMEM 细胞培养基的注射器从骨的一个断端冲洗骨髓细胞到10ml无菌离心管中，重复 3 次。
（5）1500r/min，离心 8min，弃上清液。
（6）加入5ml红细胞裂解液，吸管反复吹打，然后静置 3min。
（7）1500r/min，离心 8min，弃上清液。
（8）加入5ml DMEM 细胞培养基重悬细胞，然后用40μm尼龙过滤器过滤细胞。
（9）1500r/min，离心 8min，弃上清液，重复 3 次。
（10）a 加入含有 20%FBS/ DMEM 的细胞培养液重悬细胞，到该步骤提取完毕。
b 加入含有 20ng/ml的 M-CSF 的 20%FBS/ DMEM 细胞培养液重悬细胞，诱导骨髓细胞分化为巨噬细胞。
细胞计数，调整细胞浓度至1×106／mL。
接种75cm2细胞培养皿中。
（11）放于37℃、5％二氧化碳饱培养箱中培养，待后续实验研究。
小鼠三个不同部位巨噬细胞的分离培养与鉴定
小鼠三个不同部位巨噬细胞的分离培养与鉴定[摘要] 目的建立小鼠三种不同部位巨噬细胞体外分离培养的方法，并对其进行鉴定。
方法分别从小鼠腹腔、脾脏、骨髓中分离获取巨噬细胞，经台盼蓝染色计数后于含10%胎牛血清的DMEM培养液、1%小牛血清的RPMI-1640培养基中培养；通过活细胞形态观察；HE 染色光镜观察；吞噬鸡红细胞功能检测；酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表达等生物学技术鉴定培养的贴壁细胞性质。
结果获得高纯度的巨噬细胞，具有巨噬细胞的形态特征，具备良好的吞噬功能，鸡红细胞吞噬率分别为腹腔94.68%，脾脏92.47%，骨髓93.11%；酸性磷酸酶染色阳性率为腹腔89.43%，脾脏85.21%，骨髓88.55%；α-醋酸奈酚酯酶染色阳性率为腹腔85.32%，脾脏81.81%，骨髓85.76%。
结论小鼠三个不同部位均可简便实用的分离出巨噬细胞，可以满足不同的研究目的。
巨噬细胞不仅是许多病原体的宿主细胞,而且在先天性和后天性免疫应答过程中起着关键性作用[1-3],比如调节促炎和抗炎细胞因子的释放、吞噬或杀死胞内微生物和肿瘤细胞、降解和提呈抗原等。
它还可以与其他免疫细胞协同发挥更大的功能，比如树突状细胞、粒细胞、NK细胞和T细胞等。
小鼠巨噬细胞吞噬作用是反映机体非特异性免疫功能的主要指标，也是临床免疫学实验常用的方法之一。
现将已有的巨噬细胞分离方法改进，从3种不同部位分离小鼠巨噬细胞，并做以对比。
1 材料与方法1.1主要试剂和仪器DMEM培养基（Hyclone）；RPMI-1640培养基（GIBCO）；胎牛血清（GIBCO）；倒置显微镜（Olympus）；CO2培养箱（Binder，Thermo）。
1.2 从小鼠腹腔中分离巨噬细胞（1）取6~8周龄左右的小鼠，腹腔注射2mL无菌的液体石蜡。
待3~4d后收集腹腔细胞。
（2）颈椎脱臼法法处死小鼠，消毒，用注射器抽取5mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1~2 min，静置5min，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中。
一种肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法与流程
一种肝脏固有和浸润巨噬细胞的分离方法与流程1. 肝脏固有巨噬细胞的分离肝脏固有巨噬细胞是肝脏内的一种重要免疫细胞，它们在肝脏的免疫应答和炎症反应中发挥着重要作用。
为了分离肝脏固有巨噬细胞，我们可以采用以下方法：(1) 肝脏细胞的提取：从肝脏中提取细胞，可以使用肝脏灌注法或酶消化法。
(2) 巨噬细胞的分离：通过密度梯度离心法，将肝脏细胞中的巨噬细胞分离出来。
常用的密度梯度介质有Percoll等。
(3) 巨噬细胞的纯化：通过抗体标记和磁珠分选等方法，将巨噬细胞从其他细胞中纯化出来。
2. 肝脏浸润巨噬细胞的分离肝脏浸润巨噬细胞是指从血液或其他组织中浸润到肝脏中的巨噬细胞。
为了分离肝脏浸润巨噬细胞，我们可以采用以下方法：(1) 肝脏细胞的提取：从肝脏中提取细胞，可以使用肝脏灌注法或酶消化法。
(2) 浸润巨噬细胞的分离：通过免疫磁珠分选等方法，将浸润巨噬细胞从其他细胞中分离出来。
(3) 浸润巨噬细胞的纯化：通过抗体标记和流式细胞术等方法，将浸润巨噬细胞从其他细胞中纯化出来。
3. 细胞表面标记物的应用在分离和鉴定巨噬细胞的过程中，我们可以利用细胞表面标记物的特异性来区分不同的巨噬细胞亚群。
常用的细胞表面标记物包括F4/80、CD11b、CD68等。
4. 细胞培养和鉴定分离得到的巨噬细胞可以进行细胞培养和鉴定。
在培养过程中，我们可以观察细胞的形态、生长速度和分化情况等指标，以确定细胞的纯度和功能状态。
同时，我们还可以利用免疫荧光染色等方法对细胞进行鉴定。
5. 细胞功能分析通过对分离得到的巨噬细胞进行功能分析，我们可以了解它们在肝脏免疫应答和炎症反应中的作用。
例如，可以通过刺激巨噬细胞并检测其产生的炎症因子或调节其他免疫细胞的分化来评估其功能。
6. 免疫表型检测通过对分离得到的巨噬细胞进行免疫表型检测，我们可以了解其免疫表型特征和功能状态。
常用的免疫表型检测方法包括流式细胞术和免疫印迹等。
7. 实时荧光定量PCR技术实时荧光定量PCR技术是一种常用的基因表达分析方法，可以用于检测巨噬细胞中特定基因的表达水平。
肠道巨噬细胞的提取
肠道巨噬细胞的提取肠道巨噬细胞的提取是一个复杂的过程，下面将尽量清晰地为您分点阐述：一、实验准备实验动物：选择6-8周龄，体重在18-22克之间的健康小鼠，如昆明小鼠或SPF级小鼠。
实验材料：准备必要的实验器材，如注射器、细胞培养板、离心管等，以及实验试剂，如PBS缓冲液、RPMI-1640培养液、胎牛血清等。
二、提取步骤注射刺激物：向小鼠腹腔内注射3%巯基乙醇酸钠或其他刺激物，以积聚巨噬细胞。
注射量为每只小鼠2ml，注射后等待3天。
处死小鼠并消毒：采用脱颈方式处死小鼠，将小鼠置于无菌操作台上，用75%乙醇浸湿小鼠腹部皮肤3分钟进行消毒。
收集腹腔液：用无菌剪刀剪开小鼠腹部皮肤，暴露腹膜。
然后用无菌巴氏吸管从腹腔开口深入腹腔，反复冲洗腹膜腔，灌洗液可回收约8ml。
离心与清洗：将收集到的灌洗液在常温条件下以1000r/min离心10分钟，弃去上清液，用PBS液洗涤细胞沉淀。
细胞培养：用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液重悬细胞，然后将细胞接种到培养板中，在37℃、5%CO2的培养箱中培养3小时。
之后洗去未贴壁的细胞，剩下的贴壁细胞即为巨噬细胞。
巨噬细胞观察与计数：培养24小时后，在倒置显微镜下观察细胞形态。
使用0.5%胰酶消化细胞，离心并重悬细胞悬液，使用细胞计数板计数每个灌洗液中分离的巨噬细胞数量。
三、活性检测（可选）通过台盼蓝染色法检测巨噬细胞的活性。
将巨噬细胞与台盼蓝染液混合后静置一段时间，然后滴在载玻片上观察。
活细胞不会被染色，而死细胞则会被染成蓝色，从而区分活细胞和死细胞，并计算细胞活性。
请注意，以上步骤仅供参考，具体操作可能因实验条件和需求而有所不同。
在实际操作中，应严格遵循实验室安全规范和操作指南以确保实验的成功和安全。
外周血巨噬细胞提取的方法
外周血巨噬细胞提取的方法引言：外周血巨噬细胞是一类具有吞噬细菌、清除腐败细胞和参与免疫调节等功能的重要免疫细胞。
提取外周血巨噬细胞对于研究其功能和应用于临床诊断和治疗具有重要意义。
本文将介绍几种常用的外周血巨噬细胞提取方法，包括密度梯度离心法、附着法、负选择法和磁珠分选法。
一、密度梯度离心法密度梯度离心法是一种常用的外周血巨噬细胞提取方法。
首先，将外周血样品与等体积的生理盐水混合，然后缓慢倒入离心管中。
接下来，将离心管放入离心机中进行离心，离心速度和时间要根据具体实验要求来确定。
离心完成后，可以观察到不同密度的细胞在离心管中分层，外周血巨噬细胞通常位于上层的白细胞层。
最后，使用移液管将上层白细胞层吸取出来，并进行进一步的处理和分离。
二、附着法附着法是一种简单而高效的外周血巨噬细胞提取方法。
首先，将外周血样品加入到含有巨噬细胞黏附剂的培养皿中，使细胞在培养皿上附着。
然后，倒入培养基，将非附着的细胞倒出。
接下来，加入培养基和细胞活化剂，促使外周血巨噬细胞分化和增殖。
最后，通过离心或洗涤的方式将附着的外周血巨噬细胞收集起来。
三、负选择法负选择法是一种常用的外周血巨噬细胞提取方法，它通过去除其他类型的细胞来富集外周血巨噬细胞。
首先，使用特定抗体标记其他类型的细胞，如淋巴细胞和红细胞。
然后，将标记的细胞和外周血样品混合，通过磁珠分选或离心的方式将标记的细胞去除。
接下来，收集未被标记的细胞，即富集了外周血巨噬细胞。
四、磁珠分选法磁珠分选法是一种高效的外周血巨噬细胞提取方法。
首先，使用特定抗体标记外周血巨噬细胞表面的特定蛋白。
然后，将标记的细胞和磁珠混合，通过磁力分选的方式将标记的细胞富集起来。
接下来，使用磁力将富集的细胞与磁珠分离，得到纯化的外周血巨噬细胞。
总结：外周血巨噬细胞提取的方法有多种，包括密度梯度离心法、附着法、负选择法和磁珠分选法。
每种方法都有其特点和适用场景。
选择合适的提取方法可以高效地获得外周血巨噬细胞，并为后续的实验和研究提供可靠的基础。
小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定
小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定【摘要】目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。
方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含有10%成牛血清的DMEM培养液中培养。
采用倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色计算存活率，瑞氏染色计算纯度。
结果获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。
结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。
【关键词】小鼠；巨噬细胞；分离；培养；鉴定0.引言巨噬细胞是动物机体内重要的免疫细胞，具有抗肿瘤和免疫调节等重要作用[1，2] ，被广泛应用于体外免疫增强药物的非特异性免疫功能评价[3] 。
有很多文献报到已能从多种组织和器官中分离纯化巨噬细胞，但这些方法大多都是繁琐、复杂，所需时间长且耗资较大。
本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定简便的方法。
1.材料与方法1.1实验对象清洁级巴贝斯小鼠，体重在（30-32g），由兰州大学实验动物中心提供。
1.2实验方法1.2.1小鼠腹腔单核巨噬细胞的分离培养随机选取巴贝斯小鼠，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液5ml。
轻柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，至于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min （1000r/min），弃上清，用PBS洗涤2遍。
再用含10%成牛血清的RPMI-1640培养液（0.1%双抗溶液）调节至2×106ml-1，接种于培养瓶及6孔板，置37℃，5%CO2培养箱培养2h，弃上清。
用不含小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤2遍，然后加含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃CO2培养箱中继续培养[4]。
倒置显微镜观察细胞形态。
1.2.2巨噬细胞的观察与鉴定（1）台盼蓝染色计算存活率。
4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。
小鼠腹腔巨噬细胞准备
peritoneal macrophage cell preparation1.小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡3分钟，取出小鼠，置于无菌纸上，腹面朝上；2.用镊子提起小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，撕开皮肤，完全暴露腹膜；3. 10ml注射器装上大号针头，注入6 ml Hanks液或PBS，用镊子提起腹膜，向腹腔中注入Hanks液，针尖朝上，避开肠和脂肪，回抽腹腔液，不同方向冲洗数次，吸出腹腔液；4.细胞悬液离心200×g10分钟，用Hanks液洗一次，用RPMI1640－5%小牛血清悬起细胞，2×106细胞/ ml.5.细胞悬液置入培养瓶，37度培养2小时后，吸弃上清，用预热培养基洗二次，留下贴壁细胞；6.含10 mM EDTA的PBS加入培养瓶，覆盖细胞，37度孵育20分钟，用吸管用力吹打下细胞，或用橡皮擦帚轻轻刮下细胞，即为腹腔巨噬细胞，纯度一般大于90%，每只小鼠平均可得2×106腹腔巨噬细胞。
注:1.雌性小鼠6-8周最适用。
雄性小鼠肠壁脂肪多。
不利于腹腔液收集；2.在冲洗过程中应小心，以免刺破血管或肠壁，血液流入腹腔液；3.吸出的腹腔液应洗后再贴壁，否则有血浆膜形成，影响贴壁；4.贴壁巨噬细胞分离有较多方法，如利多卡因孵育，但大多不理想，故细胞分离后应用台盼兰染色检测活力；5.橡皮擦帚可自制，用自行车气门芯上的橡皮管套在预先折弯的滴管尖头上，灭菌后使用，较为实用；6.炎性巨噬细胞的制备可用3%的脱水硫羟乙酸培养基2ml，注入小鼠腹腔，4天后同法集腹腔细胞，每只小鼠腹腔细胞产量可以增加到3×107细胞左右。
需指出的是炎性巨噬细胞的功能活性与正常腹腔巨噬细胞有很大差异。
小鼠腹腔巨噬细胞提取的经验方法总结如下：第一：用刺激物质的方法，一般都是在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠（应该现配现用，否则效果较差）每只2ML。
实验当天将小鼠断头处死，置于1%的新洁尔灭或者75%的乙醇溶液中浸泡2—3MIN，消毒皮肤。
小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养
·６３８·现代生物医学进展删．ｂｉｏｍｅｄ．ｎｅｔ．ｃａＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＭｏｄｅｒｎＢｉｏｍｅｍｃｉＩＩｅ２００８Ｖ０１．８Ｎｏ．４小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养李海涛１肖丹２屈学民１刘渊声１马长升１杨继庆１（１第四军医大学生物医学工程系陕西西安７１００３２；２第四军医大学军事预防医学系陕西西安７１００３２）摘要目的：建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离的简便方法，为低强度激光照射对巨噬细胞功能的影响研究提供实验细胞。
方法：以无血清的ＲＰＭＩ．１６４０培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含１０％小牛血清的ＲＰＭＩ．１６４０培养液中培养。
采用倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色计算存活率，瑞氏染色计算纯度。
结果：获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。
结论：本法是一种简便实用的分离小鼠腹腔巨噬细胞的方法。
关键词：小鼠；巨噬细胞；分离中图分类号：Ｑ８１３文献标识码：Ａ文章编号：１６７３—６２７３【２００８１０４—０６３８—０２ＳｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＭｏｕｓｅＰｅｒｉｔｏｎｅａｌＭａｃｒｏｐｈａｇｅｓＬＩＨａｉ－ｔａｏ，ＸＩＡＯＤａｎ，ＱＵＸｕｅ－ｍｉｎ，ＬＩＵＹｕａｎ－ｓｈｅｎｇ，ＭＡＣｈａｎｇ－ｓｈｅｎｇ，ＹＡＮＧＪｉ－ｑｉｎｇ（１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｔｈｅＦｏｕｒｔｈＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ＇ａｎ７１００３２，Ｃｈｉｎａ；２ＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＰｒｅｖｅｎｔｌ＂ｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ｔｈｅＦｏｕｒｔｈＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，尉，翩７１００３２，Ｃｈｉｎａ）ＡＢＳｌｌＲＡＣＴＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｏｆｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｎｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｅｌｌｓｆｏｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｌｏｗ－ｅｎｅｒｇｙｌａｓｅｒｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａｍｏｕｓｅ’ＳｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｃａｖｉｔｙｗａｓｄｏｕｃｈｅｄｂｙｕｓｉｎｇＲＰＭＩ一１６４０ｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈｏｕｔＦＣＳ，ａｎｄｔｈｅｍｏｕｓｅ’Ｓｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｗｅｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄａｎｄｏｂｔａｉｎｅｄ，ｂｅｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎＲＰＭＩ一１６４０ｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１０％ＦＣＳ．ＴｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｃｅｌｌｓＷａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｉｎｖｅｒｔｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓＷａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｒｙｐａｎｂｌｕｅｓｔａｉｎ．ＴｈｅｐｕｒｉｔｙｏｆｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙＷｒｉｇｈｔ’Ｓｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅｈｉｇｈｌｙｐｕｒｉｆｉｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｈａｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅｉｎｏｒｇａｎｉｓｍ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ｗｈｉｃｈｉｓｓｉｍｐｌｅａｎｄｅａｓｙｔｏａｐｐｌｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍｏｕｓｅ；Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ；ＳｅｐａｒａｔｉｏｎＣｈｉｎｅ∞ＬｉｂｒａｒｙＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｑ８１３Ｄｏｃｕｍｅｎｔｃｏｄｅ：ＡＡｒｔｉｃｌｅＩＤ：１６７３－６２７３（２００８）０４－０６３８－０２前言巨噬细胞是机体的重要防御细胞，在抗感染、抗肿瘤及免疫调节中起着非常重要的作用。
外周血巨噬细胞提取的方法
外周血巨噬细胞提取的方法
一、密度梯度离心法
密度梯度离心法是一种常用的巨噬细胞提取方法。
首先，需要采集外周血，将其离心分离得到外周血单个核细胞（PBMC）。
然后，将PBMC通过密度梯度离心进行分离，常用的离心介质包括Ficoll或Percoll。
将离心介质与采集到的外周血混合，进行离心，通过不同密度的离心梯度分离巨噬细胞。
然后，从离心梯度中收集巨噬细胞，进一步进行培养或实验处理。
二、黏附法
黏附法是一种简单有效的巨噬细胞提取方法。
将采集到的外周血直接加入无血清培养基中，并将细胞悬浮液加入黏附性培养皿（如塑料培养皿或玻璃培养皿）中。
将黏附的巨噬细胞培养在37摄氏度的恒温箱中，因为巨噬细胞具有黏附性，它们会附着在培养皿上。
借助黏附性，可以使巨噬细胞从其他细胞中分离出来，最终得到纯净的巨噬细胞。
三、磁珠分选法
磁珠分选法是一种广泛应用的巨噬细胞提取方法。
首先，使用特异性表面抗体与磁珠结合，制备带有抗体的磁珠。
然后，将采集到的外周血加入含有巨噬细胞表面标记物特异性抗体的磁珠混悬液中，进行抗体结合。
接下来，使用磁力装置分离出带有巨噬细胞的磁珠，将磁珠与巨噬细胞分离出来。
最后，通过去除磁珠实现巨噬细胞的提取。
以上所述的是常用的巨噬细胞提取方法，但不同的实验目的、研究要求和设备条件可能会选择不同的方法。
对于专业实验室，可能会采用多种
方法结合使用，以提高巨噬细胞的纯度和提取效率。
在进行巨噬细胞提取时，应严格遵守操作规范，确保实验的可靠性和安全性。
小鼠腹腔巨噬细胞 提取量
小鼠腹腔巨噬细胞提取量
小鼠腹腔巨噬细胞的提取量可以根据实验所需的具体目的和方法来确定。
以下是一种常用的提取方法：1. 将小鼠处死后，用70%乙醇消毒小鼠腹部。
2. 用剪刀将小鼠腹部的皮肉切开，暴露腹腔。
3. 使用无菌吸管或针头，注入预冷PBS缓冲液到腹腔内，轻轻摇动或用力揉搓腹部几分钟，以充分洗涤腹腔巨噬细胞。
4. 用吸管或注射器将洗涤液吸取出来，转移到离心管中。
5. 对洗涤液进行离心，速度和时间要根据巨噬细胞的大小和沉降速度来确定。
通常，离心速度为
300-400 g，离心时间为5-10分钟。
6. 将上清液去除，留下含有巨噬细胞的沉淀。
7. 再次加入适量的预冷PBS缓冲液进行洗涤，重复上述离心步骤。
8. 最后，根据实验要求，将沉淀溶解或悬浮于适合的细胞培养液中，用于后续实验。
需要注意的是，提取量的多少受到小鼠体内巨噬细胞的数量以及实验处理步骤的差异等因素的影响。
因此，在每个实验中，都需要根据具体实验要求进行优化和调整。
外周血巨噬细胞提取的方法
外周血巨噬细胞提取的方法步骤一：样品收集步骤二：稀释血液将收集到的外周血样品转移到无菌离心管中。
血液与提取缓冲液（例如PBS）的体积比通常为1：1或更高。
确保将血液和缓冲液充分混合，并避免产生气泡。
步骤三：测定血细胞数目使用血细胞计数仪或显微镜对血液样品中的细胞数目进行计数。
这一步骤有助于确定需要提取的巨噬细胞数量和稀释比例。
步骤四：离心在无菌离心管中以200g-300g的速度离心10分钟。
离心的目的是分离外周血样品中的细胞成分，将巨噬细胞沉淀在离心管底部。
步骤五：去除血清将上清液倒出，并保留巨噬细胞沉淀。
使用洗涤缓冲液（例如PBS）轻轻洗涤沉淀，可重复此步骤2-3次以去除血清残留物。
步骤六：裂解红细胞使用裂解缓冲液（例如裂解红细胞缓冲液）裂解红细胞，以消除它们对巨噬细胞的干扰。
在向沉淀中加入裂解缓冲液之前，先把沉淀悬浮均匀。
步骤七：离心在离心管中以200g-300g的速度离心10分钟，以使巨噬细胞重新沉淀。
步骤八：取出上清液将上清液倒出，并保留巨噬细胞沉淀。
步骤九：洗涤巨噬细胞使用洗涤缓冲液（例如PBS）轻轻洗涤沉淀，可重复此步骤2-3次以去除残留物和冲洗缓冲液。
步骤十：培养巨噬细胞将洗涤后的巨噬细胞转移到培养皿中，添加培养基和适当的生长因子和添加剂。
这有助于维持巨噬细胞的正常生理状态并促进其增殖和分化。
步骤十一：观察和分析将培养的巨噬细胞放在显微镜下观察其形态和生长状态。
此外，可以使用相关实验技术，如流式细胞术、基因表达分析等，对提取的巨噬细胞样品进行进一步分析和操作。
外周血巨噬细胞提取的方法主要包括血样品的稀释、离心、去除血清、裂解红细胞、洗涤巨噬细胞和培养等步骤。
这种方法可以方便地从外周血样品中提取和培养巨噬细胞，为研究和诊断提供了重要的实验材料。
请注意，在进行任何实验操作之前，务必遵守相关的生物安全和伦理规定，并严格遵循实验室安全操作规程。
皮肤免疫细胞提取
皮肤免疫细胞提取
摘要：
1.皮肤免疫细胞的概念和作用
2.皮肤免疫细胞提取的方法
3.皮肤免疫细胞提取的应用
4.皮肤免疫细胞提取的注意事项
正文：
皮肤免疫细胞是指在皮肤组织中存在的一类具有免疫功能的细胞，包括T 细胞、B 细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。
这些细胞在皮肤抵御外来病原微生物、监视异常细胞以及维持皮肤免疫平衡方面起着重要作用。
皮肤免疫细胞提取是指从皮肤组织中提取出这些具有免疫功能的细胞。
皮肤免疫细胞提取的方法有多种，主要包括以下几种：
1.机械刮片法：这是一种常用的皮肤免疫细胞提取方法，通过专用刮片工具，轻轻地刮取皮肤表面细胞，然后将细胞悬液进行处理和培养，从而获得皮肤免疫细胞。
2.活检法：活检法是指通过手术或穿刺等方式，从皮肤组织中取得细胞样本，然后进行处理和培养，提取皮肤免疫细胞。
3.细胞悬液法：这种方法是指将皮肤组织放入培养液中，通过振荡、离心等操作，使皮肤细胞分离并形成细胞悬液，然后从中提取皮肤免疫细胞。
皮肤免疫细胞提取在临床和科研中有广泛的应用，例如：
1.用于研究皮肤免疫细胞的功能和调控机制，为皮肤免疫性疾病的治疗提
供理论依据。
2.用于评估皮肤免疫细胞的免疫功能，为评估皮肤免疫状态提供依据。
3.用于开发新型皮肤免疫细胞疗法，通过将皮肤免疫细胞移植到患者体内，增强患者的免疫功能，从而达到治疗疾病的目的。
在进行皮肤免疫细胞提取时，需要注意以下几点：
1.严格无菌操作，避免细胞污染。
2.选择合适的提取方法和培养条件，保证细胞活力和纯度。
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我是按照经典的方法，注射淀粉肉汤3天后腹腔灌洗得来的，培养3小时除去上清液后纯化了巨噬细胞然后加药的，培养24小时后可以看到细胞已经贴壁了，但是我发现加了LPS的组细胞悬浮的比阴性组多，这个就很奇怪了，我的LPS浓度从10ng一直到20ug/mL都有设置，但是吞噬率无一超过阴性组的。
(1) 小鼠2 ml/只腹腔注射3%巯基乙醇酸钠，三天后颈椎脱臼处死小鼠，用75%乙醇浸湿3 min消毒，置超净台中；
(2)用镊子将小鼠下腹部皮肤提起，剪开一个小口，将皮肤撕开，完全暴露腹膜；
(3)用镊子提起腹膜，用10ml注射器向小鼠腹腔中注入6ml PBS缓冲液,针尖向上，避开肠和脂肪,反复回抽腹腔液，不同的方向冲洗数次，最后吸出腹腔液；
(4)将细胞悬液1000r/min条件下离心10min，用PBS液洗涤l次，用含10%的胎牛血清RPMIl-1640将细胞悬起，台盼蓝染色，当活细胞数达到95%以上时调整细胞浓度至2×106个/ml。
(5)将细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔100μL，把细胞培养板放置于37℃5%CO2的培养箱中培养3h；
(6)3h后取出细胞培养板，清洗1次，去除未贴壁的细胞，弃去上清液，然后每孔加入100mL RPMI-1640完全培养液,此时细胞培养板孔内的贴壁细胞即为纯化以后的小鼠腹腔巨噬细胞。
按照以上述制备和纯化腹腔巨噬细胞方法处理细胞后，200μL/孔加入不同浓度的阳性药LPS，阴性对照孔加200μL培养基，放置于培养箱中，培养24 h后取出细胞板，弃上清，用PBS液200μL/孔洗3遍，加0.1%中性红溶液200μL/孔，继续于培养箱中孵育3h。
取出细胞板，弃上清，用PBS液200μL/孔洗两遍后加细胞裂解液(醋酸与无水乙醇等体积混合) 200μL/孔，将96孔板放在微型振荡器上振荡10 min后，放在4℃冰箱12h过夜。
将细胞板520 nm 波长处测定吸光度。
按下式计算吞噬中性红增加率%=(给药孔A值一对照孔A值)/对照孔A值×100%。