两步发酵法降解大豆抗原蛋白的研究

蛋白主要由７ｓ伴球蛋白及１１ｓ球蛋白组成，含量约 生菌，产生多种生物活性因子，改善动物肠胃道对营
占８７％。７Ｓ伴球蛋白由ｄ７、仅、Ｂ三个亚基组成，分子量 养物质的吸收利用（李建，２００９）。马文强等的研究采
分别为６８、６７及５７ｋＤａ，１ｌＳ球蛋白由６个酸性亚基和 用混菌发酵，检测到混菌发酵样品营养品质的改善。
６个碱性亚基组成，酸性亚基有两种分子量，分别为 朱曦等研究了枯草芽孢杆菌、酵母菌及乳酸菌混菌发
３４．８及４０ ｋＤａ，碱性亚基分子量约为１９．６ ｋＤａ（李成 酵的条件。吴胜华等用小肽含量作为检测指标，采用
二元发酵法发酵大豆粕（吴胜华等，２００８）。但混菌发
酵时菌种之间相互作用的研究报道较少。本文拟通过
ＰＹ６００电热恒温箱，ＨＱＬ４５Ａ恒温摇床，ＤＹＹ一５
在１．２．３．１节发酵产物中接种５％的酵母菌及乳
电泳仪，ＰＨｓ一３ｃ ｐＨ计，ＬＤｚｘ一４０ｃＩ立式自动电热压 酸菌，搅拌均匀并压紧，用塑料膜密封静止发酵，发酵
力灭菌锅等。
温度为Ｃ，发酵时间为Ｄ。
１．２方法
设计Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ ４个因素３水平正交试验（见表１）。
图ｌ 三种茵的摇瓶发酵样品的检测
准备枯草芽孢杆菌的ＰＤＡ液体发酵液及乳酸菌 ２．２两菌混合发酵对大豆抗原蛋白降解度的影响
的ＭＲＳ液体发酵液作为菌种。料水比为１：０．６，ｐＨ值 ２．２．１
。 为６．５条件下，枯草芽孢杆菌的接种量为４％，乳酸菌 影响
酵母菌对枯草芽孢杆菌降解大豆抗原蛋白的
万方数据
图２为枯草芽孢杆菌与不同接种量酵母菌混菌 发酵样品的检测图。从图２可以看出，２％～５％的酵母 菌接种量下，１ ｌＳ抗原蛋白基本没有降解，７Ｓ伴球蛋 白除了在２％的酵母菌接种量时有所降解，其他接种 量降解也不明显。实验室多次研究表明，该株枯草芽 孢杆菌发酵７２ ｈ，抗原蛋白的残留仅为３％～４％。由 此可见，酵母菌与枯草芽孢杆菌共同发酵，大大降低 了枯草芽孢杆菌对抗原蛋白的降解能力。
体培养基。２瓶接入枯草芽孢杆菌，３７℃摇床中培养
图１为摇瓶发酵样品的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测图。从图１
１６ ｈ后，ｌ瓶中投入１００ ｍｇ １１Ｓ抗原蛋白粉末，另ｌ瓶 可以看出，枯草芽孢杆菌可以很好的降解两种抗原蛋
投入ｌｌＳ＋７Ｓ抗原蛋白粉末２００ ｍｇ，发酵２４ ｈ。另２瓶 白。在摇瓶发酵的２４ ｈ内，枯草芽孢杆菌把１１Ｓ抗原
Ｒ嗍ｒｃｈ ｏｎ ｄｅｇ咫ｄａｔｉＯｎ卸ｔｉｇｅｎ ｐｒｏｔｅｊ．咀ｂｙ ｔｗ删ｔ印ｆ奄ｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈＯｄ
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Ａｂｓｔｍｃｔ：Ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｒＩｌｉｘｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｃｏｍｂｉｎｅ ｗｉｔ｝Ｉ ｙｅａｓｔ ａｎｄ Ｂａｃｉｕｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｃｏｍｂｉｎｅ ｗｉｔｈ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｆｅ彻ｅｎｔｉｎｇ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ，ａｎｄ ｔｈｅ ｍｉｘｅｄ ｆｅ彻ｅｎｔａ土ｉｏｎ ｒｅｓｕｈｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔ｝ｌａｔ ｔ｜ｌｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｄ ｂｅｅｎ ８ｔｒｏｎｇｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ａｅｒｏｂｉｃ ｆｅ册ｅｎｔａｔｉｏｎ而ｔｈ Ｂａｃｉｕｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｗａｓ ａｓ ａ ｐｒｅ—ｆｅＨｌｌｅｎｔａｔｉｏｎ， ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆ．ｅ瑚ｅｎｔａ土ｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｙｅａｓｔ ｗａｓ ａｓ ａ ｐｏｓｔ—ｆｂｎ：Ｉｌｅｎｔａｔｉｏｎ， ｏｎｅ ｔ’Ｖｏ—ｓｔｅｐ ｆｅ瑚ｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ｆｅ珊ｅｎｔａｔｉｏｎ．Ａｎｄ ｔｈｅ ｔｗｏ—ｓｔｅｐ ｆｅ珊ｅｎｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ
酵液。
１．２．２两种菌混合发酵固体生豆粕试验
１．２．２．１枯草芽孢杆菌与酵母菌的混合发酵
准备枯草芽孢杆菌与酵母菌的ＰＤＡ液体培养基
注：１．枯草芽孢杆菌菌液；２．７ｓ＋枯草芽孢杆菌发酵液：３．１１ｓ＋枯草芽
的发酵液作为菌种。料水比为１：０．６，ｐＨ值为６．５条
孢杆菌发酵液；４．Ｉ １Ｓ＋酵母菌发酵液；５．７Ｓ＋酵母菌发酵液；６．
万方数据
歪茎釜；亟童叁壁墨堕竖盘皇垫堕墨鱼丝堑窒
堕壁！塞蔓
１．１．１菌种来源
的接种量分别为２％、３％、４％、５％，３７℃静止发酵７２ ｈ。
枯草芽孢杆菌、酵母菌由华中农业大学微生物学 用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ检测发酵样品。
国家重点实验室发酵分室提供；乳酸菌筛选自食品。
１．２．３三种菌两步发酵法正交试验
１．１．２培养基
注：ｃｋ．未接种豆粕；１～７．两步法发酵样品。 图４ 两步发酵样品抗原蛋白的检测
３讨论 两步发酵法中，降解抗原蛋白的主要菌种是枯草
芽孢杆菌、酵母菌及乳酸菌的主要作为动物肠道益生 菌添加剂。好氧性前发酵阶段，枯草芽孢杆菌不受酵 母菌及乳酸菌产生的酸类影响，大量繁殖并分泌大量 蛋白酶。厌氧后发酵阶段，酵母菌与乳酸菌大量增殖， 而酶降解抗原的作用实际上从好氧的前发酵阶段一 直持续到厌氧的后发酵阶段，酶的降解作用不需要氧 气，且乳酸菌也可以产生少量降解抗原蛋白的酶。这 是两步发酵法中抗原蛋白能充分降解的原因。
ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｒｅａｔｅｓｔ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｐｒｅ—ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｒｎｅ，
ｆｏＵｏｗｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｐｏｓｔ—ｆｅｍｌｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｅ—ｆｅ珊ｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｈａｄ ａ ｍｉｎｏｒ碰琵ｃｔ．
Ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｌｓｏ ｉｕｕｍｉｎａｔｅｄ ｔｈａｔ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｐｒｅ—ｆｅ瑚ｅｎｔ砒ｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ３５℃，ｔｉｍｅ ｗａｓ ４８ｈ，ａＩｌｄ ｔｈｅ ｐｏｓｔ—ｆｅ瑚ｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ４２℃，ｔｉｍｅ ｗａｓ ３２ ｈ，ｔ｝ｌｅ附ｏ ｍａｉｎ ａｎｔ培ｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
石慧，华中农业大学楚天学院，讲师。４３０２０５，湖北省华中 研究发酵菌种之间的相互作用，采用两步发酵法减少
农业大学楚天学院望荃楼１０３９室。
菌种之间的相互抑制，增强菌种的功能，以获得更好
罗璇、刘艳、梁运祥（通讯作者），单位及通讯地址同第一 的发酵工艺。
作者。
ｌ材料与方法
收稿日期：２０１０埘一２０
＠１．１材料
弼参凌瞵港瞻姥获堑城臻翼包嘞璐篪
石慧罗璇刘艳梁运祥
摘 要：以枯草芽孢杆菌、酵母茵混茵和枯草芽孢杆菌、乳酸茵混茵发酵生豆粕，研究表明，酵母
茵及乳酸菌对枯草芽孢杆菌降解抗原蛋白的能力均具有较强的抑制作用。以枯草芽孢杆茵好氧发酵
作为前发酵，乳酸菌及酵母茵厌氧发酵作为后发酵对生豆粕进行两步发酵，结果表明：前发酵时间对
１．２．３．１ 枯草芽孢杆菌的好氧性前发酵
枯草芽孢杆菌、酵母菌培养基：马铃薯葡萄糖培
料水比为１：Ｏ．６，ｐＨ值为６．５，枯草芽孢杆菌的
养基（ＰＤＡ）；乳酸菌培养基：ＭＲＳ培养基；发酵培养 接种量为４％，好氧发酵生豆粕，发酵温度为Ａ，发酵
基：生豆粕（购自东海粮油）。
时间为Ｂ。
１．１．３主要仪器
１．２．３．２酵母菌及乳酸菌的厌氧性后发酵
注：１４乳酸菌的接种量分别为：２％、３％、４％、５％。 图３枯草芽孢杆菌与乳酸茵混合发酵生豆粕样品的检测
２．３三种菌两步发酵法的发酵条件及抗原蛋白的检 测（见表２、图４）
从表２可以看出，４个因素的极差ＲＢ＞Ｒｃ＞ＲＤ＞Ｒ＾， 可见，４个因素影响抗原蛋白残留率的主次顺序是： 前发酵时间＞后发酵温度＞后发酵时间＞前发酵温度。
优质蛋白质，是动物饲料的主要蛋白质来源（石慧等，
混菌发酵是近年来饲料行业研究的热点，混菌发
２００６）。但是大豆中的蛋白质多为大分子蛋白或糖蛋 酵不仅可以有效去除豆粕中的抗营养因子，将抗原蛋
白，具有抗原性，幼小牲畜难以吸收利用甚至导致腹 白转换为动物容易利用的小分子肽类，还可以在饲料
泻死亡等过敏反应（韩鹏飞等，２００９）。大豆中的抗原 中添加枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌，增加肠道益
准备２瓶４０ ｒｎｌ的ＰＡ瓶，每瓶装３８ Ｉｌｌｌ ＭＲＳ液 有一定的降解作用，但不能降解１ １Ｓ大豆抗原蛋白。
体培养基，灭菌，接人乳酸菌，密闭，３７℃摇床中培养
２４ ｈ，往瓶中分别投入１００ ｍｇ １ｌＳ抗原蛋白粉末及
２００ ｍｇ １１Ｓ＋７Ｓ抗原蛋白粉末，发酵２４ ｈ。
以上摇床转速均为２２０ ｒ／ｍｉｎ，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ检测发
其中前发酵时间影响最大，前发酵温度在设计的３水 平范围内影响最小。抗原蛋白残留率最低试验条件为 前发酵温度为３５℃，前发酵时间为４８ ｈ，后发酵温度为 ４２℃，后发酵时间为３２ ｈ。为提高设备的利用率，缩短 生长周期，也可采用抗原蛋白残留量率很低，发酵时 间最短的为试验号３中的发酵条件。
注：ｃｋ．未发酵生豆粕；ｌ一酵母菌的接种量分别为：２％、３％、４％、５％。 图２枯草芽孢杆茵与酵母菌混茵发酵样品的检测
件下，枯草芽孢杆菌的接种量为４％，酵母菌的接种量 分别为２％、３％、４％、５％，３２℃好氧静止发酵７２ ｈ。用 ＳＤＳ—ＰＡＧＥ检测发酵样品。 １．２．２．２枯草芽孢杆菌与乳酸菌混合发酵固体生豆粕
酵母菌液：７．１ ｌＳ＋乳酸菌发酵液；８．７Ｓ＋乳酸菌发酵液：９等Ｌ酸 菌菌液；Ｍ．低分子量蛋白质标准：ｃｋ．未发酵抗原蛋白：７ｓ指７Ｓ 伴球蛋白，１ｌＳ指１１Ｓ球蛋白。
１．２．１单菌摇瓶发酵试验 １．２．１．１抗原蛋白的分离纯化
表１ ４因素３水平正交试验设计
用粉碎机将脱脂大豆粕粉碎，过８０目筛。用参考
文献１９－，０１的方法纯化抗原蛋白ｌｌＳ球蛋白及７Ｓ伴球
蛋白。分离所得的１１Ｓ抗原蛋白比较纯，但７Ｓ伴球蛋
白并不能达到预期的纯度。
１．２．１．２摇瓶发酵
２结果与分析
用２５０ ｍ１三角瓶准备４瓶５０ ｒＩｌｌ灭菌的ＰＤＡ液 ２．１三种菌对大豆抗原蛋白亚基的降解特点
ＰＤＡ培养基接入酵母菌，２８℃摇床中培养１６ ｈ，其中 蛋白的酸性亚基及碱性亚基降解到２０．Ｏ ｋＤａ以下，把
１瓶投入１００ ｍｇ １１Ｓ抗原蛋白粉末，另ｌ瓶投入 ７Ｓ伴球蛋白３个亚基降解到３４．０ ｋＤａ以下。酵母菌
１１Ｓ＋７Ｓ抗原蛋白２００ ｍｇ粉末，发酵２４ ｈ。
不降解任何大分子抗原蛋白。乳酸菌对７Ｓ抗原蛋白
２．２．２乳酸菌对枯草芽孢杆菌降解大豆抗原蛋白的 影响
图３为枯草芽孢杆菌与不同接种量乳酸菌混菌 发酵样品检测图。从图３可以看出，当乳酸菌的接种 量为２％、３％时，两种抗原蛋白的亚基都大量降解，但 当接种量为４％、５％时，抗原蛋白的降解减少，出现明 显的抗原色带。说明乳酸菌与枯草芽孢杆菌的共发酵 也降低了枯草芽孢杆菌降解抗原蛋白的能力。
Ｄｅｓｉｄｕｅ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎⅡｌｅａｌ ｗａＬｓ ｏｎｌｙ ０．１５％．
鬟对ｗｏｒｄｓ：ａｎｔｉｇｅｎ ｐｍｔｅｉｎ；ｔｗｏ—ｓｔｅｐ ｆｅ聊ｅｎｔａｔｉｏｎ；Ｂａｃｉｕｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；ｙｅａｓｔ；ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ
脱脂大豆粕蛋白质含量为４５％·５５％，为全价的 贤等，２００７）。
豆粕中抗原蛋白的降解影响最大，后发酵温度其次，前发酵温度影响最小；当前发酵温度为３５℃，前
发酵时间为４８ ｈ，后发酵温度４２℃，后发酵时间３２ ｈ，豆粕中两种主要抗原蛋白的残留量仅０．１５％。
关键词：大豆抗原蛋白；两步发酵法；枯草芽孢杆菌；酵母菌；乳酸菌
中图分类号：Ｓ８１６．３２
文献标识码：Ａ
文章编号：１００ｌ一９９１Ｘ（２０１１）０３—００２２—０４
本文中抗原残留率最低的试验方案发酵总耗时 ８０ ｈ，高于马文强等（２００８）、朱曦等（２００７）和吴胜华等
万方数据Biblioteka Baidu
《同斟工业》·２０１１年第３２置鞠３期
试验研究
储藏条件对进日鱼粉储藏品质魄影响
陈小旭王卫国
摘要：试验的目的是考查进口智利鱼粉样品在不同温度、水分和湿度储藏条件下储藏特性指标