两点法终点法速率法

什么叫两点法、终点法、速率法?
两点法：测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产物或底物浓度的总变化量以求取酶反应初速度的方法。

终点法：通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量，以求出酶活力的方法，亦称平衡法。

速率法：是指连续测定(每15秒~1分钟监测一次)酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应的初速度的方法，即连续监测法。

一、常用生化检测项目分析方法举例
1．终点法检测常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。

以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。

2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。

（两点法）
3．连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。

一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。

4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。

二、分析参数设置
分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。

各种测定项目的分析参数（analysis paramete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。

生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定分析参数。

因此必须理解各参数的确切意义。

一、分析参数介绍
（一）必选分析参数
这类参数是分析仪检测的前提条件，没有这些参数无法进行检测。

1．试验名称试验名称（test code）是指测定项目的标示符，常以项目的英文缩写来表示。

2．方法类型（也称反应模式）方法类型（assay）有终点法、两点法、连续监测法等，根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型。

3．反应温度一般有30℃、37℃可供选择，通常固定为37℃。

4．主波长主波长（primary wavelength）是指定一个与被测物质反应产物的光吸收有关的波长。

5．次波长次波长（secondary wavelength）是在使用双波长时，要指定一个与主波长、干扰物质光吸收有关的波长。

6．反应方向反应方向（response direction）有正向反应和负向反应两种，吸光度增加为正向反应，吸光度下降为负向反应。

7．样品量样品量（sampling volum）一般是2μl～35μl，以0.1μl步进，个别分析仪最少能达到1.6μl。

可设置常量、减量和增量。

8．第一试剂量第一试剂量（first regengt volum）一般是20～300μl，以1μl步进。

9．第二试剂量第二试剂量（second regengt volum）一般也是20～300μl，以1μl 步进。

10．总反应容量总反应容量（total reacting volum）在不同的分析仪有一个不同的规定范围，一般是180～350μl，个别仪器能减少至120μl。

总反应容量太少无法进行吸光度测定。

11．孵育时间孵育时间（incubate time）在终点法是样品与试剂混匀开始至反应终点为止的时间，在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间。

12．延迟时间延迟时间（delay time）在连续监测法中样品与反应试剂（第二试剂）混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间。

13．连续监测时间连续监测时间（continuous monitoring time）在延迟时间之后即开始，一般为60～120s，不少于4个吸光度检测点（3个吸光度变化值）。

14．校准液个数及浓度校准曲线线性好并通过坐标零点的，可采用一个校准液（calibrator）；线性好但不通过坐标零点，应使用两个校准液；对于校准曲线呈非线性者，必须使用两个以上校准液。

每一个校准液都要有一个合适的浓度。

15．校准K值或理论K值通过校准得到的K值为校准K值（calibrate coefficient）或由计算得出的K值为理论K值。

16．线性范围即方法的线性范围（linearity range），超过此范围应增加样品量或减少样品量重测。

与试剂/样品比值有关。

17．小数点位数检测结果的小数点位数（decimal point digit）。

（二）备选分析参数
这类分析参数与检测结果的准确性有关，一般来说不设置这类分析参数，分析仪也能检测出结果，但若样品中待测物浓度太高等，检测结果可能不准确。

1．样品预稀释设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值，便可在分析前自动对样品进行高倍稀释。

2．底物耗尽值底物耗尽值（substrate exhaust limit）在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸光度下降限。

若低于此限时底物已太少，不足以维持零级反应而导致检测结果不准确。

3．前区检查免疫比浊法中应用，以判断是否有抗原过剩。

将终点法最后两个吸光度值的差别（ΔA）设置一个限值，如果后一点的吸光度比前一点低，表示已有抗原过剩，应稀释样品后重测。

4．试剂空白吸光度范围超过此设定范围表示试剂已变质，应更换合格试剂。

5．试剂空白速率连续监测法中使用，是试剂本身在监测过程中没有化学反应时的变化速率。

6．方法学补偿系数用于校准不同分析方法间测定结果的一致性，有斜率和截距两个参数。

7．参考值范围对超过此范围的测定结果，仪器会打印出提示。

（三）某些参数的特殊意义
1．最小样品量最小样品量是指分析仪进样针能在规定的误差范围内吸取的最小样品量。

一般分析仪的最小样品量是2μl，目前也有小至1.6μl的。

在样品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度的情况下往往需采用分析仪的最小样品量作为减量参数，从而使分析仪检测范围（与线性范围不同）的上限得以扩大。

2．最大试剂量方法灵敏度很高而线性上限低的检测项目，如血清白蛋白的溴甲酚氯法测定，以往手工法操作时样品量10μl，试剂量4ml，这样试剂量/样品量比例（R/S）为200，线性上限则为60g/L。

此法移植到分析仪上后，R/S却很难达到200，致使线性上限变低。

因此对这类检测项目最大试剂量非常重要。

3．弹性速率在酶活性测定中，当酶活性太高，在连续监测期中已不呈线性反应时，有些仪器具有弹性速率（flexrate）功能，能自动选择反应曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果，使酶活性测定的线性范围得以扩大。

如AST 可从1000U/L扩展至4000U/L，从而减少稀释及重测次数、降低成本。

4．试剂空白速率当样品中存在胆红素时，胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰。

因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光吸收，而且胆红素在碱性环境中可被氧化转变，因而在肌酐反应过程中胆红素的光吸收呈下降趋势。

若在加入第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率，因为此段中苦味酸尚未与肌酐反应，而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化转变，因而以第二试剂加入后的速率变化，减去试剂空白速率变化，便可消除胆红素的负干扰，见图7-8。

二、单波长和双波长方式
（一）概念
采用一个波长检测物质的光吸收强度的方式称为单波长(mono-wavelength)方式。

当反应液中含有一种组分，或在混合反应液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时，可以选用。

在吸光度检测中，使用一个主波长和一个次波长的称双波长方式。

当反应液中存在干扰物的较大吸收、从而影响测定结果的准确性时，采用双波长方式更好。

（二）双波长的作用
双波长(di-wavelength)测定优点是①消除噪音干扰;②减少杂散光影响;③减少样
品本身光吸收的干扰。

从光源，到比色杯、单色器、检测器的整个光路系统中，均存在着随时间发生变化的不稳定的检测信号，即噪音，而双波长检测是同时进行的，两种波长检测产生的噪音基本上相同，因而能消除噪音干扰。

当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会产生非特异性的光吸收，而干扰测定结果的准确性。

采用双波长方式测定可以部分消除这类干扰，提高检测的准确性。

（三）次波长的确定方法
当被测物的主波长确定之后，再选择次波长。

如根据甘油三酯等干扰物吸收光谱特征，选择次波长，使干扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值，而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较大的差异。

一般来说，次波长应大于主波长100nm。

以主波长与次波长吸光度差来计算结果。

（四）双波长的具体应用
对于某些反应速度快且无法设置为两点终点法的分析项目，尤其是单试剂分析中，可以利用双波长的方式来部分消除样品本身的光吸收干扰。

目前用单试剂法测定的项目应用双波长的为血清总蛋白（双缩脲法）主波长500nm，次波长576nm；血清白蛋白（溴甲酚氯法）主、次波长分别为600和700nm；钙（偶氮砷Ⅲ法）主、次波长分别为660、770nm；磷（紫外比色法）主、次波长为340、405nm，镁（二甲苯胺蓝法）主、次波长为505和600nm。

三、单试剂和双试剂方式
反应过程中只加一次试剂称单试剂方式，加两次试剂便为双试剂方式。

目前的生化分析仪大多可用双试剂方式分析，其优点是：①可提高试剂的稳定性，多数双试剂混合成单一工作试剂时，其稳定时间缩短；②能设置两点终点法，来消除来自样品本身的光吸收干扰；③在某些项目检测时能消除非特异性化学反应的干扰。

如血清ALT测定，血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的指示酶（乳酸脱氢酶）起反应，使结果偏高。

若先加入缺乏α-酮戊二酸的第一试剂，使其它酮酸与指示酶反应之后再加入含有α-酮戊二酸的第二试剂，启动真正的ALT酶促反应生成丙酮酸，而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反应消耗的NAD＋能真正反映ALT的活性，从而消除以上副反应的影响。

四、测定过程的自动监测
各种自动生化分析仪或多或少都具有对测定过程进行各种监测的功能，以便在没有人"监督"化学反应的情况下提高检测的准确性。

高档分析仪的监测功能更强。

1．试剂空白监测每种试剂都有一定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的变质：如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因酚被氧化为醌而变为红色；碱性磷酸酶、γ－谷氨酰转移酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或硝基苯胺而变黄；有些试剂久置后变浑浊。

这些情况均可使空白吸光度升高。

丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应检测项目，其试剂在放置过程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降等。

试剂空白的测定方法有两种：①每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度，这种方式适用于先取样品后加试剂的分析仪。

②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度，适用于先加试剂后取样品的分析仪。

2．试剂空白变化速率监测一些酶试剂在反应温度下不稳定，其空白吸光度可随着时间逐渐发生变化，这种变化的主要原因与工具酶或辅酶的纯度有关，且因试剂的组成和生产厂家的不同而不同。

这种变化会影响测定结果的准确性，一般使结果偏高。

如果设置此项监测，分析仪在结果计算时会自动减去试剂空白变化速率。

在以监测NAD（P）H减少为指示反应的酶活性测定中，空白速率可监测并消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降；在色素原为底物的酶活性测定中，空白速率可监测并消除底物自身分解造成的吸光度升高。

有关空白速率监测在胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐负干扰消除中的作用，已如前述。

3．样品信息监测由于样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果产生非化学反应的干扰。

根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，用双波长或多波长检测其性质和程度，一般是测定样品在600nm／570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小来分别判断样品溶血、脂浊和黄疸程度。

然后在结果计算时自动减去这部分干扰，这将有利于提高分析结果的可靠性。

4．结果可靠性监测
（1）终点监测：终点法测定要判断所选的测光点是否到达终点或平衡点。

一些分析仪在所选终点后再选一个测光点，比较这两点吸光度的差异来判断反应是否到达终点。

（2）线性期监测：连续监测法选择时间－吸光度反应曲线上的线性期来计算酶活性或被测物浓度，因此仪器要确定此连续监测期是否呈线性。

其监测方法为①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归，计算出各点的方差，根据方差值的大小来判断是否呈线性；②取连续监测期开始若干点的变化速率与连续监测期最后若干点的变化速率进行比较，来判断是否为线性期。

5．底物消耗的监测在连续监测法测定酶活性时，如果在监测期内吸光度上升或下降超过其底物耗尽值，则说明该样品酶活性非常高，底物将被耗尽，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不可靠。

此时不打印结果或打印结果同时也打印出底物耗尽提示，该样品应稀释一定的倍数重新测定。

此监测对于采用负反应分析酶活性的方法甚为重要。

见图7-9
6．方法线性范围监测每种待测物分析都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果若超过此范围，分析仪将显示测定结果超过线性范围的提示，多数分析仪会自动将样品减量或增量重新测定。

一、分析方法分类
（一）终点法
被测物质在反应过程中完全被转变为产物，即达到反应终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法（end essay）。

实际上被测物并没有完全被转变，而只是与产物达到一个动态的化学平衡，因此该法称为平衡法更为恰当。

从时间-吸光度曲线来看，到达反应终点或平衡点时，吸光度将不再变化。

分析仪通常在反应终点附近连续选择两个吸光度值，求出其平均值计算结果，并可根据两点的吸光度差来判断反应是否到达反应终点。

终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。

终点时间的确定：①根据时间-吸光度曲线来确定，如Trinder反应测定尿酸，反应曲线上3～5min时其吸光度已趋向稳定，因而可将5min作为反应终点。

②根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定，如在血清白蛋白的溴甲酚绿法测定中，白蛋白与溴甲酚绿在10s内很快完成反应，之后α球蛋白和β球蛋白与溴甲酚绿发生"慢反应"，使反应曲线上吸光度在10s后仍继续缓慢上升，持续约达10min，因此终点时间应采用10～30s，而不应选择10min。

1．一点终点法：在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，这种方法称为一点终点法（one point end essay），其反应曲线见图7-3。

其检测结果的计算公式是：待测物浓度CU=（待测吸光度AU －试剂空白吸光度AB）×K。

K为校准系数，详见第五节二操作方法。

2．两点终点法：在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果，称为两点终点法（two point end essay），其反应曲线见图7-4。

计算公式为CU=（待测吸光度A2－待测吸光度A1）×K。

该法能有效地消除溶血（hemolysis）、黄疸（icterus）和脂浊（lipo-turbid）等样品本身光吸收（见图7-5）造成的干扰。

在单试剂分析加入试剂的初期、或双试剂分析中第二试剂加入之初，若指示反应吸光度尚未明显变化，则可在此时选择第一个吸光度，在指示反应终点时选择第
二个吸光度，从而设置成两点终点法。

但指示反应初期吸光度无明显变化的化学反应较少，如单试剂方式测定总蛋白、白蛋白、钙、磷、镁等的终点法分析项目，及双试剂方式测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的终点法分析项目，因反应初期吸光度已有明显变化，因而均难以用上述方式设置两点终点法。

但在双试剂分析中，如果将第一吸光度选择在第二试剂加入前，此时指示反应一般尚未开始，则能容易设置两点终点法。

在此要注意必须将两次读吸光度时不同比色液体积进行校正。

目前全自动分析仪均具有此自动校正功能，不必手工进行校正。

（二）固定时间法
指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算，称为固定时间法（fixed-time essay），反应曲线见图7-6。

其计算公式与两点终点法相同，为CU=(A2-A1)×K。

有时也称此法为两点法。

该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。

例如：苦味酸法测定肌酐，反应的最初30s内，血清中快反应干扰物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能与碱性苦味酸反应；在第二个30s时碱性苦味酸主要与肌酐反应，且此段时间－吸光度曲线的线性较好（故也可用连续监测法测定肌酐）；在80～120s及其以后，碱性苦味可与蛋白质以及其它慢反应干扰物反应。

这样选用反应的第二个30s为测定时间，既避免了快反应物质的干扰，也避免了慢反应物质的影响，使肌酐浓度与吸光度变化呈良好的线性关系，有利于提高分析的特异性和准确度。

（三）连续监测法
连续监测法（continuous monitoring essay）又称速率法（rate essay），是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值（ΔA/min）计算结果，见图7-7A和B。

所谓线性期就是各点吸光度差值相等，如图7-7C所示，图中δ1及δ5值偏小，而δ2＝δ3＝δ4，故A1点至A4点属线性段。

此线性期对底物来说属零级反应，期间的ΔA/min即为酶促反应的初速度，其大小与被测酶活性成正比。

连续监测法的优点即是可以确定线性期并计算ΔA/min，根据此值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显着地优于手工法。

连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。

酶活性（U/L）＝ΔA/min×理论（或校准）K值，代谢物浓度CU=ΔA/min×校准K值。

关于理论K值和校准K值叙述如下：
1．理论K值：多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用，因而根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：酶活性
(U/L)=ΔA/min× ，将此式中以K来表示，此K值可通过对已知值即指示物质的毫摩尔消光系数（ε）、反应液总容量（TV）、样品容量（SV）和比色杯光径（d）计算后得出，即为理论K值，可作为分析参数输入到分析仪中。

采用理论K值的前提应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等。

但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差异，可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差。

温度的影响有时也非常大，由于反应盘是半暴露的，因此随着较冷试剂的加入，反应盘中的温度会逐渐降低，尽管开始测定时反应盘温度已升到37°C，但在某一项目测定过程的开始阶段，温度可能达不到37°C ，甚至仅35°C左右，且反应过程中
仍有可能上下波动，这对于酶学反应来说影响是很大的。

如采用37°C时的理论K值，将会使测定结果降低，温度的波动还会使得结果的重复性降低。

当然，若试剂在加入反应杯前经试剂臂内加热装置预温，则基本不影响反应盘温度。

由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长、带宽以及加样系统的准确性等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不同，因而有必要获得实际的摩尔吸光系数，然后用来计算的K值称为实测K值。

（1）NADH（NADPH）摩尔吸光系数的测定：NADH（NADPH）没有标准纯制品，而且配成溶液后稳定性又较差，不能直接用NADH 或NADPH标准液来校正仪器，须通过有NAD+(NADP+)参与的反应途径。

用已糖激酶(HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系。

葡萄糖有标准纯制品，又有国家批准文号的葡葡糖标准液。

因此，根据公式
A=εbC，已知比色杯光径b和葡萄糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度A 后便可计算出NADH（NADPH）的摩尔吸光系数ε为A/bC。

假设，葡萄糖标准液浓度为1Ommo1/L(0.01mol/L)，标准液加入量为3.5μL，酶试剂加入量为
335μL，比色杯光径为0.7cm，在340nm测得吸光度为0.465，则实测NADH摩尔吸光系数= ＝6424，即在此台分析仪上340nm波长处测得NADH（NADPH）的摩尔吸光系数为6424，而理论上NADH（NADPH）的ε为6220。

（2）"色素原"酶促产物在405nm波长摩尔吸光系数的测定：有许多酶底物为人工合成的"色素原"底物，其本身无色，经酶作用后释放出有色的反应产物，在405nm波长具有吸收峰。

最常用色素原底物及其产物为: ALP测定以磷酸对硝基苯酚(4-Nitrophenyl phosphate，4-NPP)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-Nitrophenol，4-NP)，GGT测定以γ-L-谷氨酰对硝基苯胺
(γ-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或γ-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺
(γ-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroaniline，4-NA)或对硝基-5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid，ANBA)。

对硝基苯酚的摩尔吸光系数为18700(405nm)，对硝基苯胺的摩尔吸光系数为9870(405nm)，对硝基-5-氨基苯甲酸的摩尔吸光系数为9490(405nm)。

下面是对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定方法。

试剂：① 4-NP标准储存液(1Ommo1/L)。

② 4-NP标准应用液(2.5mmo1/L，以0.84mol/L AMP缓冲液稀释而成)。

③底物缓冲液(l5mmol/L 4-NPP配于
0.84mol/L AMP-HCL缓冲液中，37℃,pH l0.09土0.02)。

测定方法：4-NP标准液加入量为5μL，底物缓冲液加入量为350μL，波长405nm，光径0.7cm，温度37℃，测定得吸光度为A1；另用蒸馏水代替4-NP标准液，按上述方法测定其吸光度为A2，4-NP标准液吸光度ΔA= A1- A2，若测得ΔA为0.460，则
实测4-NP摩尔吸光系数＝＝18662
2．校准K值酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动计算得出。

在进行酶学测定时，如果分析条件的变化如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏差可同等程度地影响校准物和待测样品，则使用校准品能进行补偿。

一般来说以使用校准K 值为好，但必须有两个先决条件：①必须使用配套的试剂；②必须使用配套的高质量的校准品，该校准品应具有溯源性。

使用与该分析仪配套的酶活性校准品也可得到较好的酶活性测定结果。

关于酶活性标准品，欧洲标准局（BCR）和美国。