终点法 速率法 二点法
两点法、终点法、速率法
什么叫两点法、起点法、速率法?之杨若古兰创作两点法：测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产品或底物浓度的总变更量以求取酶反应初速度的方法.起点法：通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产品或底物浓度总变更量，以求出酶活力的方法，亦称平衡法.速率法：是指连续测定(每15秒~1分钟监测一次)酶反应过程中某一反应产品或底物的浓度随时间的变更来求出酶反应的初速度的方法，即连续监测法.一、经常使用生化检测项目分析方法举例1．起点法检测经常使用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等.以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因此采取一点起点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点起点法，包含总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用.2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采取此法.（两点法）3．连续监测法对于酶活性测定普通应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等.一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法.4．透射比浊法透射比浊法可用于测定发生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，和血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法.二、分析参数设置分析仪的一些通用操纵步调如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均曾经固化在存储器里，用户不克不及点窜.各种测定项目的分析参数（analysisparamete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数.生化分析仪普通另外留一些检测项目的空白通道，由用户本人设定分析参数.是以必须理解各参数的确切意义.一、分析参数介绍（一）必选分析参数这类参数是分析仪检测的前提条件，没有这些参数没法进行检测.1．试验名称试验名称（test code）是指测定项目的标示符，常以项目的英文缩写来暗示.2．方法类型（也称反应模式）方法类型（assay）有起点法、两点法、连续监测法等，根据被检物资的检测方法道理选择其中一种反应类型.3．反应温度普通有30℃、37℃可供选择，通常固定为37℃. 4．主波长主波长（primary wavelength）是指定一个与被测物资反应产品的光接收有关的波长.5．次波长次波长（secondary wavelength）是在使用双波长时，要指定一个与主波长、干扰物资光接收有关的波长. 6．反应方向反应方向（response direction）有正向反应和负向反应两种，吸光度添加为正向反应，吸光度降低为负向反应.7．样品量样品量（sampling volum）普通是2μl～35μμμl.可设置常量、减量和增量.8．第一试剂量第一试剂量（first regengt volum）普通是20～300μl，以1μl步进.9．第二试剂量第二试剂量（second regengt volum）普通也是20～300μl，以1μl步进.10．总反应容量总反应容量（total reacting volum）在分歧的分析仪有一个分歧的规定范围，普通是180～350μl，个别仪器能减少至120μl.总反应容量太少没法进行吸光度测定. 11．孵育时间孵育时间（incubate time）在起点法是样品与试剂混匀开始至反应起点为止的时间，在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间. 12．延迟时间延迟时间（delay time）在连续监测法中样品与反应试剂（第二试剂）混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间.13．连续监测时间连续监测时间（continuous monitoring time）在延迟时间以后即开始，普通为60～120s，很多于4个吸光度检测点（3个吸光度变更值）.14．校准液个数及浓度校准曲线线性好并通过坐标零点的，可采取一个校准液（calibrator）；线性好但欠亨过坐标零点，应使用两个校准液；对于校准曲线呈非线性者，必须使用两个以上校准液.每一个校准液都要有一个合适的浓度. 15．校准K值或理论K值通过校准得到的K值为校准K值（calibrate coefficient）或由计算得出的K值为理论K值. 16．线性范围即方法的线性范围（linearity range），超出此范围应添加样品量或减少样品量重测.与试剂/样品比值有关. 17．小数点位数检测结果的小数点位数（decimal point digit）.（二）备选分析参数这类分析参数与检测结果的精确性有关，普通来说不设置这类分析参数，分析仪也能检测出结果，但若样品中待测物浓度太高等，检测结果可能禁绝确.1．样品预浓缩设置样品量、浓缩剂量和浓缩后样品量三个数值，即可在分析前主动对样品进行高倍浓缩.2．底物耗尽值底物耗尽值（substrate exhaust limit）在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸光度降低限.若低于此限时底物已太少，缺乏以保持零级反应而导致检测结果禁绝确.3．前区检查免疫比浊法中利用，以判断是否有抗原过剩.将起点法最初两个吸光度值的不同（ΔA）设置一个限值，如果后一点的吸光度比前一点低，暗示已有抗原过剩，应浓缩样品后重测.4．试剂空白吸光度范围超出此设定范围暗示试剂已蜕变，应更换合格试剂.5．试剂空白速率连续监测法中使用，是试剂本人在监测过程中没有化学反应时的变更速率.6．方法学抵偿系数用于校准分歧分析方法间测定结果的分歧性，有斜率和截距两个参数.7．参考值范围对超出此范围的测定结果，仪器会打印出提示.（三）某些参数的特殊意义1．最小样品量最小样品量是指分析仪进样针能在规定的误差范围内汲取的最小样品量.普通分析仪的最小样品量是2μμl 的.在样品含高浓度代谢产品或高活性酶浓度的情况下常常需采取分析仪的最小样品量作为减量参数，从而使分析仪检测范围（与线性范围分歧）的上限得以扩大.2．最大试剂量方法灵敏度很高而线性上限低的检测项目，如血清白蛋白的溴甲酚氯法测定，以往手工法操纵时样品量10μl，试剂量4ml，如许试剂量/样品量比例（R/S）为200，线性上限则为60g/L.此法移植到分析仪上后，R/S却很难达到200，导致线性上限变低.是以对这类检测项目最大试剂量非常次要.3．弹性速率在酶活性测定中，当酶活性太高，在连续监测期中已不呈线性反应时，有些仪器具有弹性速率（flexrate）功能，能主动选择反应曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果，使酶活性测定的线性范围得以扩大.如AST可从1000U/L扩展至4000U/L，从而减少浓缩及重测次数、降低成本.4．试剂空白速率当样品中存在胆红素时，胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰.因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光接收，而且胆红素在碱性环境中可被氧化改变，因此在肌酐反应过程中胆红素的光接收呈降低趋势.若在加入第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率，因为此段中苦味酸尚未与肌酐反应，而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化改变，因此以第二试剂加入后的速率变更，减去试剂空白速率变更，即可清除胆红素的负干扰，见图7-8.二、单波长和双波长方式（一）概念采取一个波长检测物资的光接收强度的方式称为单波长(mono-wavelength)方式.当反应液中含有一种组分，或在混合反应液中待测组分的接收峰与其它共存物资的接收波长无堆叠时，可以选用.在吸光度检测中，使用一个主波长和一个次波长的称双波长方式.当反应液中存在干扰物的较大接收、从而影响测定结果的精确性时，采取双波长方式更好.（二）双波长的感化双波长(di-wavelength)测定利益是①清除乐音干扰;②减少杂散光影响;③减少样品本人光接收的干扰.从光源，到比色杯、单色器、检测器的全部光路零碎中，均存在着随时间发生变更的不波动的检测旌旗灯号，即乐音，而双波长检测是同时进行的，两种波长检测发生的乐音基本上不异，因此能清除乐音干扰.当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会发生非特异性的光接收，而干扰测定结果的精确性.采取双波长方式测定可以部分清除这类干扰，提高检测的精确性.（三）次波长的确定方法当被测物的主波长确定以后，再选择次波长.如根据甘油三酯等干扰物接收光谱特征，选择次波长，使干扰物在主、次波利益有尽可能不异的光接收值，而被测物在主、次波利益的光接收值应有较大的差别.普通来说，次波长应大于主波长100nm.以主波长与次波长吸光度差来计算结果.（四）双波长的具体利用对于某些反应速度快且没法设置为两点起点法的分析项目，特别是单试剂分析中，可以利用双波长的方式来部分清除样品本人的光接收干扰.目前用单试剂法测定的项目利用双波长的为血清总蛋白（双缩脲法）主波长500nm，次波长576nm；血清白蛋白（溴甲酚氯法）主、次波长分别为600和700nm；钙（偶氮砷Ⅲ法）主、次波长分别为 660、770nm；磷（紫外比色法）主、次波长为340、405nm，镁（二甲苯胺蓝法）主、次波长为505和 600nm.三、单试剂和双试剂方式反应过程中只加一次试剂称单试剂方式，加两次试剂便为双试剂方式.目前的生化分析仪大多可用双试剂方式分析，其利益是：①可提高试剂的波动性，多数双试剂混合成单一工作试剂时，其波动时间缩短；②能设置两点起点法，来清除来自样品本人的光接收干扰；③在某些项目检测时能清除非特异性化学反应的干扰.如血清ALT测定，血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的唆使酶（乳酸脱氢酶）起反应，使结果偏高.若先加入缺乏α-酮戊二酸的第一试剂，使其它酮酸与唆使酶反应以后再加入含有α-酮戊二酸的第二试剂，启动真实的ALT酶促反应生成丙酮酸，而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反应耗费的NAD＋能真正反映ALT的活性，从而清除以上副反应的影响.四、测定过程的主动监测各种主动生化分析仪或多或少都具有对测定过程进行各种监测的功能，以便在没有人"监督"化学反应的情况下提高检测的精确性.高档分析仪的监测功能更强.1．试剂空白监测每种试剂都有必定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变常常提示着该试剂的蜕变：如利用Trinder反应为道理的检测试剂会因酚被氧化为醌而变成红色；碱性磷酸酶、γ－谷氨酰转移酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或硝基苯胺而变黄；有些试剂久置后变浑浊.这些情况均可使空白吸光度升高.丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应检测项目，其试剂在放置过程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而降低等.试剂空白的测定方法有两种：①每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度，这类方式适用于先取样品后加试剂的分析仪.②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度，适用于先加试剂后取样品的分析仪.2．试剂空白变更速率监测一些酶试剂在反应温度下不波动，其空白吸光度可随着时间逐步发生变更，这类变更的次要缘由与工具酶或辅酶的纯度有关，且因试剂的构成和生产厂家的分歧而分歧.这类变更会影响测定结果的精确性，普通使结果偏高.如果设置此项监测，分析仪在结果计算时会主动减去试剂空白变更速率.在以监测NAD（P）H 减少为唆使反应的酶活性测定中，空白速率可监测并清除由NADH本身氧化所形成的吸光度降低；在色素原为底物的酶活性测定中，空白速率可监测并清除底物本身分解形成的吸光度升高.有关空白速率监测在胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐负干扰清除中的感化，已如前述.3．样品信息监测因为样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果发生非化学反应的干扰.根据溶血、脂浊、黄疸的光谱接收特性，用双波长或多波长检测其性质和程度，普通是测定样品在600nm／570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小来分别判断样品溶血、脂浊和黄疸程度.然后在结果计算时主动减去这部分干扰，这将有益于提高分析结果的可靠性.4．结果可靠性监测（1）起点监测：起点法测定要判断所选的测光点是否到达起点或平衡点.一些分析仪在所选起点后再选一个测光点，比较这两点吸光度的差别来判断反应是否到达起点.（2）线性期监测：连续监测法选择时间－吸光度反应曲线上的线性期来计算酶活性或被测物浓度，是以仪器要确定此连续监测期是否呈线性.其监测方法为①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归，计算出各点的方差，根据方差值的大小来判断是否呈线性；②取连续监测期开始若干点的变更速率与连续监测期最初若干点的变更速率进行比较，来判断是否为线性期.5．底物耗费的监测在连续监测法测定酶活性时，如果在监测期内吸光度上升或降低超出其底物耗尽值，则说明该样品酶活性非常高，底物将被耗尽，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不成靠.此时不打印结果或打印结果同时也打印出底物耗尽提示，该样品应浓缩必定的倍数从头测定.此监测对于采取负反应分析酶活性的方法甚为次要.见图7-96．方法线性范围监测每种待测物分析都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果若超出此范围，分析仪将显示测定结果超出线性范围的提示，多数分析仪会主动将样品减量或增量从头测定.一、分析方法分类（一）起点法被测物资在反应过程中完整被改变成产品，即达到反应起点，根据起点吸光度的大小求出被测物浓度，称为起点法（end essay）.实际上被测物并没有完整被改变，而只是与产品达到一个动态的化学平衡，是以该法称为平衡法更为恰当.从时间-吸光度曲线来看，到达反应起点或平衡点时，吸光度将不再变更.分析仪通常在反应起点附近连续选择两个吸光度值，求出其平均值计算结果，并可根据两点的吸光度差来判断反应是否到达反应起点.起点法参数设置简单，反应时间普通较长，精密度较好.起点时间的确定：①根据时间-吸光度曲线来确定，如Trinder反应测定尿酸，反应曲线上3～5min时其吸光度已趋向波动，因此可将5min作为反应起点.②根据被测物反应起点，结合干扰物的反应情况来确定，如在血清白蛋白的溴甲酚绿法测定中，白蛋白与溴甲酚绿在10s内很快完成反应，以后α球蛋白和β球蛋白与溴甲酚绿发生 "慢反应"，使反应曲线上吸光度在10s后仍继续缓慢上升，持续约达10min，是以起点时间应采取10～30s，而不该选择10min. 1．一点起点法：在反应到达起点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个起点吸光度值，这类方法称为一点起点法（one point end essay），其反应曲线见图7-3.其检测结果的计算公式是：待测物浓度CU=（待测吸光度AU－试剂空白吸光度AB）×K. K为校准系数，详见第五节二操纵方法.2．两点起点法：在被测物反应或唆使反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达起点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果，称为两点起点法（two point end essay），其反应曲线见图7-4.计算公式为CU=（待测吸光度A2－待测吸光度A1）×K.该法能无效地清除溶血（hemolysis）、黄疸（icterus）和脂浊（lipo-turbid）等样品本人光接收（见图7-5）形成的干扰.在单试剂分析加入试剂的初期、或双试剂分析中第二试剂加入之初，若唆使反应吸光度尚未明显变更，则可在此时选择第一个吸光度，在唆使反应起点时选择第二个吸光度，从而设置成两点起点法.但唆使反应初期吸光度无明显变更的化学反应较少，如单试剂方式测定总蛋白、白蛋白、钙、磷、镁等的起点法分析项目，及双试剂方式测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的起点法分析项目，因反应初期吸光度已有明显变更，因此均难以用上述方式设置两点起点法.但在双试剂分析中，如果将第一吸光度选择在第二试剂加入前，此时唆使反应普通尚未开始，则能容易设置两点起点法.在此要留意必须将两次读吸光度时分歧比色液体积进行校订.目前全主动分析仪均具有此主动校订功能，不必手工进行校订.（二）固定时间法指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非起点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算，称为固定时间法（fixed-time essay），反应曲线见图7-6.其计算公式与两点起点法不异，为CU=(A2-A1)×K.有时也称此法为两点法.该分析方法有助于解决某些反应的非特异性成绩.例如：苦味酸法测定肌酐，反应的最初30s内，血清中快反应干扰物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能与碱性苦味酸反应；在第二个30s时碱性苦味酸次要与肌酐反应，且此段时间－吸光度曲线的线性较好（故也可用连续监测法测定肌酐）；在80～120s及其当前，碱性苦味可与蛋白质和其它慢反应干扰物反应.如许选用反应的第二个30s为测定时间，既防止了快反应物资的干扰，也防止了慢反应物资的影响，使肌酐浓度与吸光度变更呈良好的线性关系，有益于提高分析的特异性和精确度.（三）连续监测法连续监测法（continuous monitoring essay）又称速率法（rate essay），是在测定酶活性或用酶法测定代谢产品时，连续拔取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变更值（ΔA/min）计算结果，见图7-7A和B.所谓线性期就是各点吸光度差值相等，如图7-7C所示，图中δ1及δ5值偏小，而δ2＝δ3＝δ4，故A1点至A4点属线性段.此线性期对底物来说属零级反应，期间的ΔA/min即为酶促反应的初速度，其大小与被测酶活性成反比.连续监测法的利益即是可以确定线性期并计算ΔA/min，根据此值再精确地计算酶活性，因此使主动生化分析仪在酶活性测定方面明显地优于手工法.连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，普通是某些基于酶法测定的代谢物.酶活性（U/L）＝ΔA/min×理论（或校准）K值，代谢物浓度CU=ΔA/min×校准K值.关于理论K值和校准K值论述如下：1．理论K值：多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用，因此根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：酶活性(U/L)=ΔA/min× ，将此式中以K来暗示，此K值可通过对已知值即唆使物资的毫摩尔消光系数（ε）、反应液总容量（TV）、样品容量（SV）和比色杯光径（d）计算后得出，即为理论K值，可作为分析参数输入到分析仪中.采取理论K值的前提该当是样品和试剂的加量精确、比色杯光径精确、温度控制精确和波长精确等.但事实上因为各型分析仪在打针器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差别，可形成样品和试剂加量和吸光度检测的偏差.温度的影响有时也非常大，因为反应盘是半流露的，是以随着较冷试剂的加入，反应盘中的温度会逐步降低，尽管开始测定时反应盘温度已升到37°C，但在某一项目测定过程的开始阶段，温度可能达不到37°C ，甚至仅35°C摆布，且反应过程中仍有可能上下动摇，这对于酶学反应来说影响是很大的.如采取37°C时的理论K值，将会使测定结果降低，温度的动摇还会使得结果的反复性降低.当然，若试剂在加入反应杯前经试剂臂内加热安装预温，则基本不影响反应盘温度.因为摩尔吸光系数受比色杯光径、波长、带宽和加样零碎的精确性等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的分歧，因此有须要获得实际的摩尔吸光系数，然后用来计算的K值称为实测K 值.（1）NADH（NADPH）摩尔吸光系数的测定：NADH （NADPH）没有尺度纯成品，而且配成溶液后波动性又较差，不克不及直接用NADH 或NADPH尺度液来校订仪器，须通过有NAD+(NADP+)介入的反应途径.用已糖激酶(HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖时，葡萄糖的耗费与NADH的生成呈等摩尔关系.葡萄糖有尺度纯成品，又有国家批准文号的葡葡糖尺度液.是以，根据公式A=εbC，已知比色杯光径b和葡萄糖尺度液浓度，测得葡萄糖尺度管的吸光度A后即可计算出NADH（NADPH）的摩尔吸光系数εμL，酶试剂加入量为335μL，比色杯光径为0.7cm，在340nm测得吸光度为0.465，则实测NADH摩尔吸光系数= ＝6424 ，即在此台分析仪上340nm波利益测得NADH （NADPH）的摩尔吸光系数为6424，而理论上NADH （NADPH）的ε为6220.（2）"色素原"酶促产品在405nm波长摩尔吸光系数的测定：有很多酶底物为人工合成的"色素原"底物，其本人无色，经酶感化后释放出有色的反应产品，在405nm波长具有接收峰.最经常使用色素原底物及其产品为: ALP测定以磷酸对硝基苯酚 (4-Nitrophenyl phosphate，4-NPP)为底物，经酶感化后释放出黄色的对硝基苯酚(4-Nitrophenol，4-NP)，GGT测定以γ-L-谷氨酰对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或γ-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)为底物，经酶感化后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroaniline，4-NA)或对硝基-5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid， ANBA).对硝基苯酚的摩尔吸光系数为18700(405nm)，对硝基苯胺的摩尔吸光系数为9870(405nm)，对硝基-5-氨基苯甲酸的摩尔吸光系数为9490(405nm).上面是对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定方法.试剂：① 4-NP尺度储存液(1Ommo1/L).② 4-NP尺度利用液(2.5mmo1/L，以0.84mol/L AMP缓冲液浓缩而成).③ 底物缓冲液(l5mmol/L 4-NPP配于0.84mol/L AMP-HCL缓冲液中，37℃,pH l0.09土0.02).测定方法：4-NP尺度液加入量为5μL，底物缓冲液加入量为350μL，波长405nm，光径0.7cm，温度37℃，测定得吸光度为A1；另用蒸馏水代替4-NP尺度液，按上述方法测定其吸光度为A2，4-NP尺度液吸光度ΔA= A1- A2，若测得ΔA为0.460，则。
两点法终点法速率法
什么叫两点法、终点法、速率法两点法：测定酶反应开始后某一时间内t1到t2产物或底物浓度的总变化量以求取酶反应初速度的方法.终点法：通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量,以求出酶活力的方法,亦称平衡法.速率法：是指连续测定每15秒~1分钟监测一次酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应的初速度的方法,即连续监测法.一、常用生化检测项目分析方法举例1．终点法检测常用的有总胆红素氧化法或重氮法、结合胆红素氧化法或重氮法、血清总蛋白双缩脲法、血清白蛋白溴甲酚氯法、总胆汁酸酶法、葡萄糖葡萄糖氧化酶法、尿酸尿酸酶法、总胆固醇胆固醇氧化酶法、甘油三酯磷酸甘油氧化酶酶法、高密度脂蛋白胆固醇直接测定法、钙偶氮砷Ⅲ法、磷紫外法、镁二甲苯胺蓝法等.以上项目中,除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外,其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法,包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用.2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法.两点法3．连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法,如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等.一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等,也可用连续监测法.4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目,多数属免疫比浊法,载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子,以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法.分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等,其程序均已经固化在存储器里,用户不能修改.各种测定项目的分析参数analysis paramete大部分也已设计好,存于磁盘中,供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式,用户可以更改这些参数.生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道,由用户自己设定分析参数.因此必须理解各参数的确切意义.一、分析参数介绍一必选分析参数这类参数是分析仪检测的前提条件,没有这些参数无法进行检测.1．试验名称试验名称testcode是指测定项目的标示符,常以项目的英文缩写来表示.2．方法类型也称反应模式方法类型assay有终点法、两点法、连续监测法等,根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型.3．反应温度一般有30℃、37℃可供选择,通常固定为37℃.4．主波长主波长primarywavelength是指定一个与被测物质反应产物的光吸收有关的波长. 5．次波长次波长secondarywavelength是在使用双波长时,要指定一个与主波长、干扰物质光吸收有关的波长.6．反应方向反应方向responsedirection有正向反应和负向反应两种,吸光度增加为正向反应,吸光度下降为负向反应.7．样品量样品量samplingvolum一般是2μl～35μl,以0.1μl步进,个别分析仪最少能达到1.6μl.可设置常量、减量和增量.8．第一试剂量第一试剂量firstregengtvolum一般是20～300μl,以1μl步进.9．第二试剂量第二试剂量secondregengtvolum一般也是20～300μl,以1μl步进.10．总反应容量总反应容量totalreactingvolum在不同的分析仪有一个不同的规定范围,一般是180～350μl,个别仪器能减少至120μl.总反应容量太少无法进行吸光度测定.间,在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间.12．延迟时间延迟时间delaytime在连续监测法中样品与反应试剂第二试剂混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间.13．连续监测时间连续监测时间continuousmonitoringtime在延迟时间之后即开始,一般为60～120s,不少于4个吸光度检测点3个吸光度变化值.14．校准液个数及浓度校准曲线线性好并通过坐标零点的,可采用一个校准液calibrator；线性好但不通过坐标零点,应使用两个校准液；对于校准曲线呈非线性者,必须使用两个以上校准液.每一个校准液都要有一个合适的浓度.15．校准K值或理论K值通过校准得到的K值为校准K值calibratecoefficient或由计算得出的K值为理论K值.16．线性范围即方法的线性范围linearityrange,超过此范围应增加样品量或减少样品量重测.与试剂/样品比值有关.17．小数点位数检测结果的小数点位数decimalpointdigit.二备选分析参数这类分析参数与检测结果的准确性有关,一般来说不设置这类分析参数,分析仪也能检测出结果,但若样品中待测物浓度太高等,检测结果可能不准确.1．样品预稀释设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值,便可在分析前自动对样品进行高倍稀释.2．底物耗尽值底物耗尽值substrateexhaustlimit在负反应的酶活性测定中,可设置此参数,以规定一个吸光度下降限.若低于此限时底物已太少,不足以维持零级反应而导致检测结果不准确.3．前区检查免疫比浊法中应用,以判断是否有抗原过剩.将终点法最后两个吸光度值的差别ΔA设置一个限值,如果后一点的吸光度比前一点低,表示已有抗原过剩,应稀释样品后重4．试剂空白吸光度范围超过此设定范围表示试剂已变质,应更换合格试剂.5．试剂空白速率连续监测法中使用,是试剂本身在监测过程中没有化学反应时的变化速率. 6．方法学补偿系数用于校准不同分析方法间测定结果的一致性,有斜率和截距两个参数. 7．参考值范围对超过此范围的测定结果,仪器会打印出提示.三某些参数的特殊意义1．最小样品量最小样品量是指分析仪进样针能在规定的误差范围内吸取的最小样品量.一般分析仪的最小样品量是2μl,目前也有小至1.6μl的.在样品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度的情况下往往需采用分析仪的最小样品量作为减量参数,从而使分析仪检测范围与线性范围不同的上限得以扩大.2．最大试剂量方法灵敏度很高而线性上限低的检测项目,如血清白蛋白的溴甲酚氯法测定,以往手工法操作时样品量10μl,试剂量4ml,这样试剂量/样品量比例R/S为200,线性上限则为60g/L.此法移植到分析仪上后,R/S却很难达到200,致使线性上限变低.因此对这类检测项目最大试剂量非常重要.3．弹性速率在酶活性测定中,当酶活性太高,在连续监测期中已不呈线性反应时,有些仪器具有弹性速率flexrate功能,能自动选择反应曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果,使酶活性测定的线性范围得以扩大.如AST可从1000U/L扩展至4000U/L,从而减少稀释及重测次数、降低成本.4．试剂空白速率当样品中存在胆红素时,胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰.因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光吸收,而且胆红素在碱性环境中可被氧化转变,因而在肌酐反应过程中胆红素的光吸收呈下降趋势.若在加入第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率,因为此段中苦味酸尚未与肌酐反应,而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化转变,因而以第二试剂加入后的速率变化,减去试剂空白速率变化,便可消除胆红素的负干扰,见图7-8.一概念采用一个波长检测物质的光吸收强度的方式称为单波长mono-wavelength方式.当反应液中含有一种组分,或在混合反应液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时,可以选用.在吸光度检测中,使用一个主波长和一个次波长的称双波长方式.当反应液中存在干扰物的较大吸收、从而影响测定结果的准确性时,采用双波长方式更好.二双波长的作用双波长di-wavelength测定优点是①消除噪音干扰;②减少杂散光影响;③减少样品本身光吸收的干扰.从光源,到比色杯、单色器、检测器的整个光路系统中,均存在着随时间发生变化的不稳定的检测信号,即噪音,而双波长检测是同时进行的,两种波长检测产生的噪音基本上相同,因而能消除噪音干扰.当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时,会产生非特异性的光吸收,而干扰测定结果的准确性.采用双波长方式测定可以部分消除这类干扰,提高检测的准确性.三次波长的确定方法当被测物的主波长确定之后,再选择次波长.如根据甘油三酯等干扰物吸收光谱特征,选择次波长,使干扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值,而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较大的差异.一般来说,次波长应大于主波长100nm.以主波长与次波长吸光度差来计算结果.四双波长的具体应用对于某些反应速度快且无法设置为两点终点法的分析项目,尤其是单试剂分析中,可以利用双波长的方式来部分消除样品本身的光吸收干扰.目前用单试剂法测定的项目应用双波长的为血清总蛋白双缩脲法主波长500nm,次波长576nm；血清白蛋白溴甲酚氯法主、次波长分别为600和700nm；钙偶氮砷Ⅲ法主、次波长分别为660、770nm；磷紫外比色法主、次波长为340、405nm,镁二甲苯胺蓝法主、次波长为505和600nm.反应过程中只加一次试剂称单试剂方式,加两次试剂便为双试剂方式.目前的生化分析仪大多可用双试剂方式分析,其优点是：①可提高试剂的稳定性,多数双试剂混合成单一工作试剂时,其稳定时间缩短；②能设置两点终点法,来消除来自样品本身的光吸收干扰；③在某些项目检测时能消除非特异性化学反应的干扰.如血清ALT测定,血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的指示酶乳酸脱氢酶起反应,使结果偏高.若先加入缺乏α-酮戊二酸的第一试剂,使其它酮酸与指示酶反应之后再加入含有α-酮戊二酸的第二试剂,启动真正的ALT酶促反应生成丙酮酸,而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反应消耗的NAD＋能真正反映ALT 的活性,从而消除以上副反应的影响.四、测定过程的自动监测各种自动生化分析仪或多或少都具有对测定过程进行各种监测的功能,以便在没有人"监督"化学反应的情况下提高检测的准确性.高档分析仪的监测功能更强.1．试剂空白监测每种试剂都有一定的空白吸光度范围,试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的变质：如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因酚被氧化为醌而变为红色；碱性磷酸酶、γ－谷氨酰转移酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或硝基苯胺而变黄；有些试剂久置后变浑浊.这些情况均可使空白吸光度升高.丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应检测项目,其试剂在放置过程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降等.试剂空白的测定方法有两种：①每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度,这种方式适用于先取样品后加试剂的分析仪.②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度,适用于先加试剂后取样品的分析仪.2．试剂空白变化速率监测一些酶试剂在反应温度下不稳定,其空白吸光度可随着时间逐渐发生变化,这种变化的主要原因与工具酶或辅酶的纯度有关,且因试剂的组成和生产厂家的不同而不同.这种变化会影响测定结果的准确性,一般使结果偏高.如果设置此项监测,分析定中,空白速率可监测并消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降；在色素原为底物的酶活性测定中,空白速率可监测并消除底物自身分解造成的吸光度升高.有关空白速率监测在胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐负干扰消除中的作用,已如前述.3．样品信息监测由于样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果产生非化学反应的干扰.根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性,用双波长或多波长检测其性质和程度,一般是测定样品在600nm／570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小来分别判断样品溶血、脂浊和黄疸程度.然后在结果计算时自动减去这部分干扰,这将有利于提高分析结果的可靠性.4．结果可靠性监测1终点监测：终点法测定要判断所选的测光点是否到达终点或平衡点.一些分析仪在所选终点后再选一个测光点,比较这两点吸光度的差异来判断反应是否到达终点.2线性期监测：连续监测法选择时间－吸光度反应曲线上的线性期来计算酶活性或被测物浓度,因此仪器要确定此连续监测期是否呈线性.其监测方法为①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归,计算出各点的方差,根据方差值的大小来判断是否呈线性；②取连续监测期开始若干点的变化速率与连续监测期最后若干点的变化速率进行比较,来判断是否为线性期.5．底物消耗的监测在连续监测法测定酶活性时,如果在监测期内吸光度上升或下降超过其底物耗尽值,则说明该样品酶活性非常高,底物将被耗尽,监测期的吸光度将偏离线性,使测定结果不可靠.此时不打印结果或打印结果同时也打印出底物耗尽提示,该样品应稀释一定的倍数重新测定.此监测对于采用负反应分析酶活性的方法甚为重要.见图7-96．方法线性范围监测每种待测物分析都有一个可测定的浓度或活性范围,样品结果若超过此范围,分析仪将显示测定结果超过线性范围的提示,多数分析仪会自动将样品减量或增量重新测定.一终点法被测物质在反应过程中完全被转变为产物,即达到反应终点,根据终点吸光度的大小求出被测物浓度,称为终点法endessay.实际上被测物并没有完全被转变,而只是与产物达到一个动态的化学平衡,因此该法称为平衡法更为恰当.从时间-吸光度曲线来看,到达反应终点或平衡点时,吸光度将不再变化.分析仪通常在反应终点附近连续选择两个吸光度值,求出其平均值计算结果,并可根据两点的吸光度差来判断反应是否到达反应终点.终点法参数设置简单,反应时间一般较长,精密度较好.终点时间的确定：①根据时间-吸光度曲线来确定,如Trinder反应测定尿酸,反应曲线上3～5min时其吸光度已趋向稳定,因而可将5min作为反应终点.②根据被测物反应终点,结合干扰物的反应情况来确定,如在血清白蛋白的溴甲酚绿法测定中,白蛋白与溴甲酚绿在10s内很快完成反应,之后α球蛋白和β球蛋白与溴甲酚绿发生"慢反应",使反应曲线上吸光度在10s后仍继续缓慢上升,持续约达10min,因此终点时间应采用10～30s,而不应选择10min. 1．一点终点法：在反应到达终点,即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值,这种方法称为一点终点法onepointendessay,其反应曲线见图7-3.其检测结果的计算公式是：待测物浓度CU=待测吸光度AU－试剂空白吸光度AB×K.K为校准系数,详见第五节二操作方法.2．两点终点法：在被测物反应或指示反应尚未开始时,选择第一个吸光度,在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度,此两点吸光度之差用于计算结果,称为两点终点法twopointendessay,其反应曲线见图7-4.计算公式为CU=待测吸光度A2－待测吸光度A1×K.该法能有效地消除溶血hemolysis、黄疸icterus和脂浊lipo-turbid等样品本身光吸收见图7-5造成的干扰.在单试剂分析加入试剂的初期、或双试剂分析中第二试剂加入之初,若指示反应吸光度尚未明显变化,则可在此时选择第一个吸光度,在指示反应终点时选择第二个吸光度,从而设置成两点终点法.但指示反应初期吸光度无明显变化的化学反应较少,如单总胆固醇、甘油三酯等的终点法分析项目,因反应初期吸光度已有明显变化,因而均难以用上述方式设置两点终点法.但在双试剂分析中,如果将第一吸光度选择在第二试剂加入前,此时指示反应一般尚未开始,则能容易设置两点终点法.在此要注意必须将两次读吸光度时不同比色液体积进行校正.目前全自动分析仪均具有此自动校正功能,不必手工进行校正.二固定时间法指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点,此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度,这两点的吸光度差值用于结果计算,称为固定时间法fixed-timeessay,反应曲线见图7-6.其计算公式与两点终点法相同,为CU=A2-A1×K.有时也称此法为两点法.该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题.例如：苦味酸法测定肌酐,反应的最初30s 内,血清中快反应干扰物如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等能与碱性苦味酸反应；在第二个30s 时碱性苦味酸主要与肌酐反应,且此段时间－吸光度曲线的线性较好故也可用连续监测法测定肌酐；在80～120s及其以后,碱性苦味可与蛋白质以及其它慢反应干扰物反应.这样选用反应的第二个30s为测定时间,既避免了快反应物质的干扰,也避免了慢反应物质的影响,使肌酐浓度与吸光度变化呈良好的线性关系,有利于提高分析的特异性和准确度.三连续监测法连续监测法continuousmonitoringessay又称速率法rateessay,是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时,连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值,并以此线性期的单位吸光度变化值ΔA/min计算结果,见图7-7A和B.所谓线性期就是各点吸光度差值相等,如图7-7C所示,图中δ1及δ5值偏小,而δ2＝δ3＝δ4,故A1点至A4点属线性段.此线性期对底物来说属零级反应,期间的ΔA/min即为酶促反应的初速度,其大小与被测酶活性成正比.连续监测法的优点即是可以确定线性期并计算ΔA/min,根据此值再准确地计算酶活性,因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显着地优于手工法.连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度,一般是某些基于酶法测定的代谢物.酶活性U/L＝ΔA/min×理论或校1．理论K值：多用于酶活性测定中,因酶活性尚无公认的校准品可用,因而根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：酶活性U/L=ΔA/min×,将此式中以K来表示,此K值可通过对已知值即指示物质的毫摩尔消光系数ε、反应液总容量TV、样品容量SV 和比色杯光径d计算后得出,即为理论K值,可作为分析参数输入到分析仪中.采用理论K值的前提应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等.但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差异,可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差.温度的影响有时也非常大,由于反应盘是半暴露的,因此随着较冷试剂的加入,反应盘中的温度会逐渐降低,尽管开始测定时反应盘温度已升到37°C,但在某一项目测定过程的开始阶段,温度可能达不到37°C,甚至仅35°C左右,且反应过程中仍有可能上下波动,这对于酶学反应来说影响是很大的.如采用37°C时的理论K值,将会使测定结果降低,温度的波动还会使得结果的重复性降低.当然,若试剂在加入反应杯前经试剂臂内加热装置预温,则基本不影响反应盘温度.由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长、带宽以及加样系统的准确性等的影响,书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不同,因而有必要获得实际的摩尔吸光系数,然后用来计算的K值称为实测K值.1NADHNADPH摩尔吸光系数的测定：NADHNADPH没有标准纯制品,而且配成溶液后稳定性又较差,不能直接用NADH或NADPH标准液来校正仪器,须通过有NAD+NADP+参与的反应途径.用已糖激酶HK或葡萄糖脱氢酶GD方法测定葡萄糖时,葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系.葡萄糖有标准纯制品,又有国家批准文号的葡葡糖标准液.因此,根据公式A=εbC,已知比色杯光径b和葡萄糖标准液浓度,测得葡萄糖标准管的吸光度A后便可计算出NADHNADPH 的摩尔吸光系数ε为A/bC.假设,葡萄糖标准液浓度为1Ommo1/L0.01mol/L,标准液加入量为3.5μL,酶试剂加入量为335μL,比色杯光径为0.7cm,在340nm测得吸光度为0.465,则实测NADH摩尔吸光系数=＝6424 ,即在此台分析仪上340nm波长处测得NADHNADPH的摩尔吸2"色素原"酶促产物在405nm波长摩尔吸光系数的测定：有许多酶底物为人工合成的"色素原"底物,其本身无色,经酶作用后释放出有色的反应产物,在405nm波长具有吸收峰.最常用色素原底物及其产物为:ALP测定以磷酸对硝基苯酚4-Nitrophenylphosphate,4-NPP为底物,经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚4-Nitrophenol,4-NP,GGT测定以γ-L-谷氨酰对硝基苯胺γ-L-Glutamyl-p-nitroanilide或γ-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺γ-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan为底物,经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺p-Nitroaniline,4-NA或对硝基-5-氨基苯甲酸2-amino-nitrobenzoicacid,ANBA.对硝基苯酚的摩尔吸光系数为18700405nm,对硝基苯胺的摩尔吸光系数为9870405nm,对硝基-5-氨基苯甲酸的摩尔吸光系数为9490405nm.下面是对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定方法.试剂：①4-NP标准储存液1Ommo1/L.②4-NP标准应用液2.5mmo1/L,以0.84mol/LAMP缓冲液稀释而成.③底物缓冲液l5mmol/L4-NPP配于0.84mol/LAMP-HCL缓冲液中,37℃,pHl0.09土0.02.测定方法：4-NP标准液加入量为5μL,底物缓冲液加入量为350μL,波长405nm,光径0.7cm,温度37℃,测定得吸光度为A1；另用蒸馏水代替4-NP标准液,按上述方法测定其吸光度为A2,4-NP标准液吸光度ΔA=A1-A2,若测得ΔA为0.460,则实测4-NP摩尔吸光系数＝＝186622．校准K值酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动计算得出.在进行酶学测定时,如果分析条件的变化如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏差可同等程度地影响校准物和待测样品,则使用校准品能进行补偿.一般来说以使用校准K值为好,但必须有两个先决条件：①必须使用配套的试剂；②必须使用配套的高质量的校准品,该校准品应具有溯源性.使用与该分析仪配套的酶活性校准品也可得到较好的酶活性测定结果.酶活性标准品,欧洲标准局BCR和美国国家标准技术研究院NIST均发表了人血清基质的酶活性标准物,但目前尚无公认的标准校准品问世.四透射比浊法。
两点法、终点法、速率法
什么叫两点法、终点法、速率法?两点法：测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产物或底物浓度的总变化量以求取酶反应初速度的方法。
终点法：通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量，以求出酶活力的方法，亦称平衡法。
速率法：是指连续测定(每15秒~1分钟监测一次)酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应的初速度的方法，即连续监测法。
一、常用生化检测项目分析方法举例1．终点法检测常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。
以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。
2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。
（两点法）3．连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。
一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。
4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。
二、分析参数设置分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。
各种测定项目的分析参数（analysis paramete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。
实用文档之两点法、终点法、速率法
实用文档之"什么叫两点法、终点法、速率法?"两点法：测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产物或底物浓度的总变化量以求取酶反应初速度的方法。
终点法：通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量，以求出酶活力的方法，亦称平衡法。
速率法：是指连续测定(每15秒~1分钟监测一次)酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应的初速度的方法，即连续监测法。
一、常用生化检测项目分析方法举例1．终点法检测常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。
以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。
2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。
（两点法）3．连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。
一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。
4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。
二、分析参数设置分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。
各种测定项目的分析参数（analysis paramete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。
两点法、终点法、速率法
什么叫两点法、终点法、速率法?两点法：测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产物或底物浓度的总变化量以求取酶反应初速度的方法。
终点法：通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量，以求出酶活力的方法，亦称平衡法。
速率法：是指连续测定(每15秒~1分钟监测一次)酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应的初速度的方法，即连续监测法。
一、常用生化检测项目分析方法举例1．终点法检测常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。
以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。
2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。
（两点法）3．连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。
一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。
4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。
二、分析参数设置分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。
两点法、终点法、速率法
什么叫两点法、终点法、速率法?之五兆芳芳创作两点法：测定酶反响开始后某一时间内(t1到t2)产品或底物浓度的总变更量以求取酶反响初速度的办法.终点法：通过测定酶反响开始到反响达到平衡时产品或底物浓度总变更量，以求出酶活气的办法，亦称平衡法.速率法：是指连续测定(每15秒~1分钟监测一次)酶反响进程中某一反响产品或底物的浓度随时间的变更来求出酶反响的初速度的办法，即连续监测法.一、经常使用生化检测项目阐发办法举例1．终点法检测经常使用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等.以上项目中，除钙、磷和镁根本上还使用单试剂方法阐发因而采取一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包含总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用.2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采取此法.（两点法）3．连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等.一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法.4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反响的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法.二、阐发参数设置阐发仪的一些通用操纵步调如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不克不及修改.各类测定项目的阐发参数（analysisparamete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化阐发仪为开放式，用户可以更改这些参数.生化阐发仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定阐发参数.因此必须理解各参数的确切意义.一、阐发参数介绍（一）必选阐发参数这类参数是阐发仪检测的前提条件，没有这些参数无法进行检测.1．试验名称试验名称（test code）是指测定项目的标示符，常以项目的英文缩写来暗示.2．办法类型（也称反响模式）办法类型（assay）有终点法、两点法、连续监测法等，按照被检物质的检测办法原理选择其中一种反响类型.3．反响温度一般有30℃、37℃可供选择，通常固定为37℃. 4．主波长主波长（primary wavelength）是指定一个与被测物质反响产品的光吸收有关的波长.5．次波长次波长（secondary wavelength）是在使用双波长时，要指定一个与主波长、搅扰物质光吸收有关的波长. 6．反响标的目的反响标的目的（response direction）有正向反响和负向反响两种，吸光度增加为正向反响，吸光度下降为负向反响.7．样品量样品量（sampling volum）一般是2μl～35μμμl.可设置常量、减量和增量.8．第一试剂量第一试剂量（first regengt volum）一般是20～300μl，以1μl步进.9．第二试剂量第二试剂量（second regengt volum）一般也是20～300μl，以1μl步进.10．总反响容量总反响容量（total reacting volum）在不合的阐发仪有一个不合的规则规模，一般是180～350μl，个体仪器能削减至120μl.总反响容量太少无法进行吸光度测定. 11．孵育时间孵育时间（incubate time）在终点法是样品与试剂混匀开始至反响终点为止的时间，在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间. 12．延迟时间延迟时间（delay time）在连续监测法中样品与反响试剂（第二试剂）混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间.13．连续监测时间连续监测时间（continuous monitoring time）在延迟时间之后即开始，一般为60～120s，良多于4个吸光度检测点（3个吸光度变更值）.14．校准液个数及浓度校准曲线线性好并通过坐标零点的，可采取一个校准液（calibrator）；线性好但欠亨过坐标零点，应使用两个校准液；对于校准曲线呈非线性者，必须使用两个以上校准液.每一个校准液都要有一个适合的浓度.15．校准K值或理论K值通过校准得到的K值为校准K值（calibrate coefficient）或由计较得出的K值为理论K值. 16．线性规模即办法的线性规模（linearity range），超出此规模应增加样品量或削减样品量重测.与试剂/样品比值有关. 17．小数点位数检测结果的小数点位数（decimal point digit）.（二）备选阐发参数这类阐发参数与检测结果的准确性有关，一般来说不设置这类阐发参数，阐发仪也能检测出结果，但若样品中待测物浓度太初等，检测结果可能禁绝确.1．样品预稀释设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值，便可在阐发前自动对样品进行高倍稀释.2．底物耗尽值底物耗尽值（substrate exhaust limit）在负反响的酶活性测定中，可设置此参数，以规则一个吸光度下降限.若低于此限时底物已太少，缺乏以维持零级反响而导致检测结果禁绝确.3．前区查抄免疫比浊法中应用，以判断是否有抗原多余.将终点法最后两个吸光度值的不同（ΔA）设置一个限值，如果后一点的吸光度比前一点低，暗示已有抗原多余，应稀释样品后重测.4．试剂空白吸光度规模超出此设定规模暗示试剂已蜕变，应改换及格试剂.5．试剂空白速率连续监测法中使用，是试剂自己在监测进程中没有化学反响时的变更速率.6．办法学抵偿系数用于校准不合阐发办法间测定结果的一致性，有斜率和截距两个参数.7．参考值规模对超出此规模的测定结果，仪器会打印出提示.（三）某些参数的特殊意义1．最小样品量最小样品量是指阐发仪进样针能在规则的误差规模内吸取的最小样品量.一般阐发仪的最小样品量是2μμl的.在样品含高浓度代谢产品或高活性酶浓度的情况下往往需采取阐发仪的最小样品量作为减量参数，从而使阐发仪检测规模（与线性规模不合）的上限得以扩大.2．最大试剂量办法灵敏度很高而线性上限低的检测项目，如血清白蛋白的溴甲酚氯法测定，以往手工法操纵时样品量10μl，试剂量4ml，这样试剂量/样品量比例（R/S）为200，线性上限则为60g/L.此法移植到阐发仪上后，R/S却很难达到200，致使线性上限变低.因此对这类检测项目最大试剂量很是重要.3．弹性速率在酶活性测定中，当酶活性太高，在连续监测期中已不呈线性反响时，有些仪器具有弹性速率（flexrate）功效，能自动选择反响曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计较结果，使酶活性测定的线性规模得以扩大.如AST可从1000U/L扩展至4000U/L，从而削减稀释及重测次数、下降成本.4．试剂空白速率当样品中存在胆红素时，胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负搅扰.因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光吸收，并且胆红素在碱性情况中可被氧化转变，因而在肌酐反响进程中胆红素的光吸收呈下降趋势.若在参加第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率，因为此段中苦味酸尚未与肌酐反响，而胆红素在第一试剂的碱性情况中已同样被氧化转变，因而以第二试剂参加后的速率变更，减去试剂空白速率变更，便可消除胆红素的负搅扰，见图7-8.二、单波长和双波长方法（一）概念采取一个波长检测物质的光吸收强度的方法称为单波长(mono-wavelength)方法.当反响液中含有一种组分，或在混杂反响液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时，可以选用.在吸光度检测中，使用一个主波长和一个次波长的称双波长方法.当反响液中存在搅扰物的较大吸收、从而影响测定结果的准确性时，采取双波长方法更好.（二）双波长的作用双波长(di-wavelength)测定优点是①消除噪音搅扰;②削减杂散光影响;③削减样品自己光吸收的搅扰.从光源，到比色杯、单色器、检测器的整个光路系统中，均存在着随时间产生变更的不稳定的检测信号，即噪音，而双波长检测是同时进行的，两种波长检测产生的噪音根本上相同，因而能消除噪音搅扰.当样品中存在非化学反响的搅扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会产生非特异性的光吸收，而搅扰测定结果的准确性.采取双波长方法测定可以部分消除这类搅扰，提高检测的准确性.（三）次波长的确定办法当被测物的主波长确定之后，再选择次波长.如按照甘油三酯等搅扰物吸收光谱特征，选择次波长，使搅扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值，而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较大的差别.一般来说，次波长应大于主波长100nm.以主波长与次波长吸光度差来计较结果.（四）双波长的具体应用对于某些反响速度快且无法设置为两点终点法的阐发项目，尤其是单试剂阐发中，可以利用双波长的方法来部分消除样品自己的光吸收搅扰.目前用单试剂法测定的项目应用双波长的为血清总蛋白（双缩脲法）主波长500nm，次波长576nm；血清白蛋白（溴甲酚氯法）主、次波长辨别为600和700nm；钙（偶氮砷Ⅲ法）主、次波长辨别为 660、770nm；磷（紫外比色法）主、次波长为340、405nm，镁（二甲苯胺蓝法）主、次波长为505和 600nm.三、单试剂和双试剂方法反响进程中只加一次试剂称单试剂方法，加两次试剂便为双试剂方法.目前的生化阐发仪大多可用双试剂方法阐发，其优点是：①可提高试剂的稳定性，多数双试剂混分解单一任务试剂时，其稳定时间缩短；②能设置两点终点法，来消除来自样品自己的光吸收搅扰；③在某些项目检测时能消除非特异性化学反响的搅扰.如血清ALT测定，血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的指示酶（乳酸脱氢酶）起反响，使结果偏高.若先参加缺乏α-酮戊二酸的第一试剂，使其它酮酸与指示酶反响之后再参加含有α-酮戊二酸的第二试剂，启动真正的ALT酶促反响生成丙酮酸，而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反响消耗的NAD＋能真正反应ALT的活性，从而消除以上副反响的影响.四、测定进程的自动监测各类自动生化阐发仪或多或少都具有对测定进程进行各类监测的功效，以便在没有人"监视"化学反响的情况下提高检测的准确性.高级阐发仪的监测功效更强.1．试剂空白监测每种试剂都有一定的空白吸光度规模，试剂空白吸光度的改动往往提示着该试剂的蜕变：如利用Trinder反响为原理的检测试剂会因酚被氧化为醌而变成白色；碱性磷酸酶、γ－谷氨酰转移酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分化出硝基酚或硝基苯胺而变黄；有些试剂久置后变混浊.这些情况均可使空白吸光度升高.丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反响检测项目，其试剂在放置进程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降等.试剂空白的测定办法有两种：①每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度，这种方法适用于先取样品后加试剂的阐发仪.②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度，适用于先加试剂后取样品的阐发仪.2．试剂空白变更速率监测一些酶试剂在反响温度下不稳定，其空白吸光度可随着时间逐渐产生变更，这种变更的主要原因与东西酶或辅酶的纯度有关，且因试剂的组成和生产厂家的不合而不合.这种变更会影响测定结果的准确性，一般使结果偏高.如果设置此项监测，阐发仪在结果计较时会自动减去试剂空白变更速率.在以监测NAD（P）H 削减为指示反响的酶活性测定中，空白速率可监测并消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降；在色素原为底物的酶活性测定中，空白速率可监测并消除底物自身分化造成的吸光度升高.有关空白速率监测在胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐负搅扰消除中的作用，已如前述.3．样品信息监测由于样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果产生非化学反响的搅扰.按照溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，用双波长或多波长检测其性质和程度，一般是测定样品在600nm／570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小来辨别判断样品溶血、脂浊和黄疸程度.然后在结果计较时自动减去这部分搅扰，这将有利于提高阐发结果的可靠性.4．结果可靠性监测（1）终点监测：终点法测定要判断所选的测光点是否到达终点或平衡点.一些阐发仪在所选终点后再选一个测光点，比较这两点吸光度的差别来判断反响是否到达终点.（2）线性期监测：连续监测法选择时间－吸光度反响曲线上的线性期来计较酶活性或被测物浓度，因此仪器要确定此连续监测期是否呈线性.其监测办法为①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归，计较出各点的方差，按照方差值的大小来判断是否呈线性；②取连续监测期开始若干点的变更速率与连续监测期最后若干点的变更速率进行比较，来判断是否为线性期.5．底物消耗的监测在连续监测法测定酶活性时，如果在监测期内吸光度上升或下降超出其底物耗尽值，则说明该样品酶活性很是高，底物将被耗尽，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不成靠.此时不打印结果或打印结果同时也打印出底物耗尽提示，该样品应稀释一定的倍数重新测定.此监测对于采取负反响阐发酶活性的办法甚为重要.见图7-96．办法线性规模监测每种待测物阐发都有一个可测定的浓度或活性规模，样品结果若超出此规模，阐发仪将显示测定结果超出线性规模的提示，多数阐发仪会自动将样品减量或增量重新测定.一、阐发办法分类（一）终点法被测物质在反响进程中完全被转变成产品，即达到反响终点，按照终点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法（end essay）.实际上被测物并没有完全被转变，而只是与产品达到一个动态的化学平衡，因此该法称为平衡法更加恰当.从时间-吸光度曲线来看，到达反响终点或平衡点时，吸光度将不再变更.阐发仪通常在反响终点邻近连续选择两个吸光度值，求出其平均值计较结果，并可按照两点的吸光度差来判断反响是否到达反响终点.终点法参数设置复杂，反响时间一般较长，精密度较好.终点时间的确定：①按照时间-吸光度曲线来确定，如Trinder反响测定尿酸，反响曲线上3～5min时其吸光度已趋向稳定，因而可将5min作为反响终点.②按照被测物反响终点，结合搅扰物的反响情况来确定，如在血清白蛋白的溴甲酚绿法测定中，白蛋白与溴甲酚绿在10s内很快完成反响，之后α球蛋白和β球蛋白与溴甲酚绿产生 "慢反响"，使反响曲线上吸光度在10s后仍持续迟缓上升，持续约达10min，因此终点时间应采取10～30s，而不该选择10min. 1．一点终点法：在反响到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改动时选择一个终点吸光度值，这种办法称为一点终点法（one point end essay），其反响曲线见图7-3.其检测结果的计较公式是：待测物浓度CU=（待测吸光度AU－试剂空白吸光度AB）×K. K为校准系数，详见第五节二操纵办法.2．两点终点法：在被测物反响或指示反响尚未开始时，选择第一个吸光度，在反响到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计较结果，称为两点终点法（two point end essay），其反响曲线见图7-4.计较公式为CU=（待测吸光度A2－待测吸光度A1）×K.该法能有效地消除溶血（hemolysis）、黄疸（icterus）和脂浊（lipo-turbid）等样品自己光吸收（见图7-5）造成的搅扰.在单试剂阐发参加试剂的初期、或双试剂阐发中第二试剂参加之初，若指示反响吸光度尚未明显变更，则可在此时选择第一个吸光度，在指示反响终点时选择第二个吸光度，从而设置成两点终点法.但指示反响初期吸光度无明显变更的化学反响较少，如单试剂方法测定总蛋白、白蛋白、钙、磷、镁等的终点法阐发项目，及双试剂方法测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的终点法阐发项目，因反响初期吸光度已有明显变更，因而均难以用上述方法设置两点终点法.但在双试剂阐发中，如果将第一吸光度选择在第二试剂参加前，此时指示反响一般尚未开始，则能容易设置两点终点法.在此要注意必须将两次读吸光度时不合比色液体积进行校正.目前全自动阐发仪均具有此自动校正功效，不必手工进行校正.（二）固定时间法指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反响初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计较，称为固定时间法（fixed-time essay），反响曲线见图7-6.其计较公式与两点终点法相同，为CU=(A2-A1)×K.有时也称此法为两点法.该阐发办法有助于解决某些反响的非特异性问题.例如：苦味酸法测定肌酐，反响的最初30s内，血清中快反响搅扰物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能与碱性苦味酸反响；在第二个30s时碱性苦味酸主要与肌酐反响，且此段时间－吸光度曲线的线性较好（故也可用连续监测法测定肌酐）；在80～120s及其以后，碱性苦味可与蛋白质以及其它慢反响搅扰物反响.这样选用反响的第二个30s为测定时间，既避免了快反响物质的搅扰，也避免了慢反响物质的影响，使肌酐浓度与吸光度变更呈良好的线性关系，有利于提高阐发的特异性和准确度.（三）连续监测法连续监测法（continuous monitoring essay）又称速率法（rate essay），是在测定酶活性或用酶法测定代谢产品时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变更值（ΔA/min）计较结果，见图7-7A 和B.所谓线性期就是各点吸光度差值相等，如图7-7C所示，图中δ1及δ5值偏小，而δ2＝δ3＝δ4，故A1点至A4点属线性段.此线性期对底物来说属零级反响，期间的ΔA/min 即为酶促反响的初速度，其大小与被测酶活性成正比.连续监测法的优点便是可以确定线性期并计较ΔA/min，按照此值再准确地计较酶活性，因而使自动生化阐发仪在酶活性测定方面显著地优于手工法.连续监测法也可用于测定呈线性反响的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物.酶活性（U/L）＝ΔA/min×理论（或校准）K值，代谢物浓度CU=ΔA/min×校准K值.关于理论K值和校准K值叙述如下：1．理论K值：多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用，因而按照酶活性的国际单位定义得出酶活性的计较公式为：酶活性(U/L)=ΔA/min× ，将此式中以K来暗示，此K值可通过对已知值即指示物质的毫摩尔消光系数（ε）、反响液总容量（TV）、样品容量（SV）和比色杯光径（d）计较后得出，即为理论K值，可作为阐发参数输入到阐发仪中.采取理论K值的前提应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等.但事实上由于各型阐发仪在注射器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差别，可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差.温度的影响有时也很是大，由于反响盘是半流露的，因此随着较冷试剂的参加，反响盘中的温度会逐渐下降，尽管开始测定时反响盘温度已升到37°C，但在某一项目测定进程的开始阶段，温度可能达不到37°C ，甚至仅35°C左右，且反响进程中仍有可能上下动摇，这对于酶学反响来说影响是很大的.如采取37°C时的理论K值，将会使测定结果下降，温度的动摇还会使得结果的重复性下降.当然，若试剂在参加反响杯前经试剂臂内加热装置预温，则根本不影响反响盘温度.由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长、带宽以及加样系统的准确性等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用阐发仪所测的不合，因而有需要取得实际的摩尔吸光系数，然后用来计较的K值称为实测K值.（1）NADH（NADPH）摩尔吸光系数的测定：NADH （NADPH）没有尺度纯制品，并且配成溶液后稳定性又较差，不克不及直接用NADH 或NADPH尺度液来校正仪器，须通过有NAD+(NADP+)介入的反响途径.用已糖激酶(HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)办法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系.葡萄糖有尺度纯制品，又有国度批准文号的葡葡糖尺度液.因此，按照公式A=εbC，已知比色杯光径b和葡萄糖尺度液浓度，测得葡萄糖尺度管的吸光度A后便可计较出NADH（NADPH）的摩尔吸光系数εμL，酶试剂参加量为335μL，比色杯光径为0.7cm，在340nm测得吸光度为0.465，则实测NADH摩尔吸光系数= ＝6424，即在此台阐发仪上340nm波长处测得NADH （NADPH）的摩尔吸光系数为6424，而理论上NADH（NADPH）的ε为6220.（2）"色素原"酶促产品在405nm波长摩尔吸光系数的测定：有许多酶底物为人工分解的"色素原"底物，其自己无色，经酶作用后释放出有色的反响产品，在405nm波长具有吸收峰.最经常使用色素原底物及其产品为: ALP测定以磷酸对硝基苯酚 (4-Nitrophenyl phosphate，4-NPP)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-Nitrophenol，4-NP)，GGT测定以γ-L-谷氨酰对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或γ-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroaniline，4-NA)或对硝基-5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid， ANBA).对硝基苯酚的摩尔吸光系数为18700(405nm)，对硝基苯胺的摩尔吸光系数为9870(405nm)，对硝基-5-氨基苯甲酸的摩尔吸光系数为9490(405nm).下面是对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定办法.试剂：① 4-NP尺度储存液(1Ommo1/L).② 4-NP尺度应用液(2.5mmo1/L，以0.84mol/L AMP缓冲液稀释而成).③底物缓冲液(l5mmol/L 4-NPP配于0.84mol/L AMP-HCL缓冲液中，37℃,pH l0.09土0.02).测定办法：4-NP尺度液参加量为5μL，底物缓冲液参加量为350μL，波长405nm，光径0.7cm，温度37℃，测定得吸光度为A1；另用蒸馏水代替4-NP尺度液，按上述办法测定其。
关于生化中的终点法中的两点法
关于生化中的终点法中的两点法，还有种叫法是固定时间法的一些题新手上路，有哪位大侠能先容先容终点法中的两点法的原理，在生化上怎么往做两点法呀（简单回答）最基本的生化反应方法有三种，其他的都是在此基础演变而来。
1。
速率法，有叫动态法，仪器连续检测生化反应过程中的吸光度变化，目的是得到吸光度变化速率。
酶活性的检测大多用此方法。
检测底物的是下降反应，又叫负反应，例如：ALT AST 等；检测天生物的是上升反应，又叫正反应，ALP。
2。
终点法。
仪器检测生化反应某一时间点的吸光度值，目的得到反应溶液的具体吸光度值。
常见的有GLU，TP ，ALB 等3。
两点法。
仪器检测生化反应两个时间点的吸光度值，第二点减往第一点，得到吸光度的差值，检测底物的差值为负，检测天生物的差值为正，例如，中生试剂的肌酐项目Cr。
生化仪无论半自动或全自动，都有实验参数设置，只要按试剂说明正确设置，再照试剂说明做实验就行了。
使用分光光度计另当别论。
两点法：又称为一级动力学法、固定时间法等，指在一定的反应时间内，反应速度与底物浓度的一次方成正比，即v=k[S]。
由于底物在不断的消耗，因此整个反应速度在不断的减小，表现为吸光度的变化越来越小。
这类反应达到平衡的时间很长，理论上可以在任意时间段进行监测，但由于血清成份复杂，反应刚启动时反应较复杂，杂反应较多，必须经过一段延迟时间才能进进稳定反应期。
两点法不是什么终点法中的两点法,正确地说它应该属于动态法范畴,一种带标准的动态法.新手上路，有哪位大侠能先容先容终点法中的两点法的原理，在生化上怎么往做两点法呀（简单回答）最基本的生化反应方法有三种，其他的都是在此基础演变而来。
1。
速率法，有叫动态法，仪器连续检测生化反应过程中的吸光度变化，目的是得到吸光度变化速率。
酶活性的检测大多用此方法。
检测底物的是下降反应，又叫负反应，例如：ALT AST 等；检测天生物的是上升反应，又叫正反应，ALP。
2。
终点法。
两点法终点法速率法
什么叫两点法、终点法、速率法?两点法:测定酶反应开始后某一时间内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量以求取酶反应初速度的方法.终点法：通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量，以求出酶活力的方法,亦称平衡法。
速率法：是指连续测定(每15秒～1分钟监测一次)酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应的初速度的方法，即连续监测法。
一、常用生化检测项目分析方法举例1．终点法检测常用的有总胆红素(氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法)、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法)、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯(磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇(直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。
以上项目中,除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外,其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。
2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。
（两点法)3．连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。
一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等,也可用连续监测法。
4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。
二、分析参数设置分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。
各种测定项目的分析参数(analysis paramete）大部分也已设计好,存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。
两点法、终点法、速率法
什么叫两点法、终点法、速率法?之邯郸勺丸创作两点法：测定酶反响开始后某一时间内(t1到t2)产品或底物浓度的总变更量以求取酶反响初速度的办法.终点法：通过测定酶反响开始到反响达到平衡时产品或底物浓度总变更量,以求出酶活力的办法,亦称平衡法.速率法：是指连续测定(每15秒~1分钟监测一次)酶反响过程中某一反响产品或底物的浓度随时间的变更来求出酶反响的初速度的办法,即连续监测法.一、经常使用生化检测项目阐发办法举例1．终点法检测经常使用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等.以上项目中,除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方法阐发因而采取一点终点法外,其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法,包含总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用.2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采取此法.（两点法）3．连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法,如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等.一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等,也可用连续监测法.4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反响的项目,多数属免疫比浊法,载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子,以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法.二、阐发参数设置阐发仪的一些通用操纵步调如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等,其程序均已经固化在存储器里,用户不克不及修改.各类测定项目的阐发参数（analysisparamete）大部分也已设计好,存于磁盘中,供用户使用；目前大多数生化阐发仪为开放式,用户可以更改这些参数.生化阐发仪一般另外留一些检测项目的空白通道,由用户自己设定阐发参数.因此必须理解各参数的确切意义.一、阐发参数介绍（一）必选阐发参数这类参数是阐发仪检测的前提条件,没有这些参数无法进行检测. 1．试验名称试验名称（test code）是指测定项目的标示符,常以项目的英文缩写来暗示.2．办法类型（也称反响模式）办法类型（assay）有终点法、两点法、连续监测法等,按照被检物质的检测办法原理选择其中一种反响类型.3．反响温度一般有30℃、37℃可供选择,通常固定为37℃.4．主波长主波长（primary wavelength）是指定一个与被测物质反响产品的光吸收有关的波长.5．次波长次波长（secondary wavelength）是在使用双波长时,要指定一个与主波长、搅扰物质光吸收有关的波长.6．反响标的目的反响标的目的（response direction）有正向反响和负向反响两种,吸光度增加为正向反响,吸光度下降为负向反响.7．样品量样品量（sampling volum）一般是2μl～35μl,以0.1μl步进,个体阐发仪最少能达到1.6μl.可设置常量、减量和增量.8．第一试剂量第一试剂量（first regengt volum）一般是20～300μl,以1μl步进.9．第二试剂量第二试剂量（second regengt volum）一般也是20～300μl,以1μl步进.10．总反响容量总反响容量（total reacting volum）在不合的阐发仪有一个不合的规定规模,一般是180～350μl,个体仪器能减少至120μl.总反响容量太少无法进行吸光度测定.11．孵育时间孵育时间（incubate time）在终点法是样品与试剂混匀开始至反响终点为止的时间,在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间.12．延迟时间延迟时间（delay time）在连续监测法中样品与反响试剂（第二试剂）混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间.13．连续监测时间连续监测时间（continuous monitoring time）在延迟时间之后即开始,一般为60～120s,很多于4个吸光度检测点（3个吸光度变更值）.14．校准液个数及浓度校准曲线线性好并通过坐标零点的,可采取一个校准液（calibrator）；线性好但欠亨过坐标零点,应使用两个校准液；对于校准曲线呈非线性者,必须使用两个以上校准液.每一个校准液都要有一个合适的浓度.15．校准K值或理论K值通过校准得到的K值为校准K值（calibrate coefficient）或由计算得出的K值为理论K值. 16．线性规模即办法的线性规模（linearity range）,超出此规模应增加样品量或减少样品量重测.与试剂/样品比值有关.17．小数点位数检测结果的小数点位数（decimal point digit）.（二）备选阐发参数这类阐发参数与检测结果的准确性有关,一般来说不设置这类阐发参数,阐发仪也能检测出结果,但若样品中待测物浓度太初等,检测结果可能禁绝确.1．样品预稀释设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值,即可在阐发前自动对样品进行高倍稀释.2．底物耗尽值底物耗尽值（substrate exhaust limit）在负反响的酶活性测定中,可设置此参数,以规定一个吸光度下降限.若低于此限时底物已太少,缺乏以维持零级反响而导致检测结果禁绝确. 3．前区检查免疫比浊法中应用,以判断是否有抗原过剩.将终点法最后两个吸光度值的不同（ΔA）设置一个限值,如果后一点的吸光度比前一点低,暗示已有抗原过剩,应稀释样品后重测.4．试剂空白吸光度规模超出此设定规模暗示试剂已蜕变,应改换合格试剂.5．试剂空白速率连续监测法中使用,是试剂自己在监测过程中没有化学反响时的变更速率.6．办法学抵偿系数用于校准不合阐发办法间测定结果的一致性,有斜率和截距两个参数.7．参考值规模对超出此规模的测定结果,仪器会打印出提示.（三）某些参数的特殊意义1．最小样品量最小样品量是指阐发仪进样针能在规定的误差规模内吸取的最小样品量.一般阐发仪的最小样品量是2μl,目前也有小至1.6μl的.在样品含高浓度代谢产品或高活性酶浓度的情况下往往需采取阐发仪的最小样品量作为减量参数,从而使阐发仪检测规模（与线性规模不合）的上限得以扩大.2．最大试剂量办法灵敏度很高而线性上限低的检测项目,如血清白蛋白的溴甲酚氯法测定,以往手工法操纵时样品量10μl,试剂量4ml,这样试剂量/样品量比例（R/S）为200,线性上限则为60g/L.此法移植到阐发仪上后,R/S却很难达到200,致使线性上限变低.因此对这类检测项目最大试剂量很是重要.3．弹性速率在酶活性测定中,当酶活性太高,在连续监测期中已不呈线性反响时,有些仪器具有弹性速率（flexrate）功效,能自动选择反响曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果,使酶活性测定的线性规模得以扩大.如AST可从1000U/L扩展至4000U/L,从而减少稀释及重测次数、降低成本.4．试剂空白速率当样品中存在胆红素时,胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负搅扰.因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光吸收,并且胆红素在碱性环境中可被氧化转变,因而在肌酐反响过程中胆红素的光吸收呈下降趋势.若在加入第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率,因为此段中苦味酸尚未与肌酐反响,而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化转变,因而以第二试剂加入后的速率变更,减去试剂空白速率变更,即可消除胆红素的负搅扰,见图7-8.二、单波长和双波长方法（一）概念采取一个波长检测物质的光吸收强度的方法称为单波长(mono-wavelength)方法.当反响液中含有一种组分,或在混合反响液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时,可以选用.在吸光度检测中,使用一个主波长和一个次波长的称双波长方法.当反响液中存在搅扰物的较大吸收、从而影响测定结果的准确性时,采取双波长方法更好.（二）双波长的作用双波长(di-wavelength)测定优点是①消除噪音搅扰;②减少杂散光影响;③减少样品自己光吸收的搅扰.从光源,到比色杯、单色器、检测器的整个光路系统中,均存在着随时间产生变更的不稳定的检测信号,即噪音,而双波长检测是同时进行的,两种波长检测产生的噪音基本上相同,因而能消除噪音搅扰.当样品中存在非化学反响的搅扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时,会产生非特异性的光吸收,而搅扰测定结果的准确性.采取双波长方法测定可以部分消除这类搅扰,提高检测的准确性.（三）次波长的确定办法当被测物的主波长确定之后,再选择次波长.如按照甘油三酯等搅扰物吸收光谱特征,选择次波长,使搅扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值,而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较大的差别.一般来说,次波长应大于主波长100nm.以主波长与次波长吸光度差来计算结果.（四）双波长的具体应用对于某些反响速度快且无法设置为两点终点法的阐发项目,尤其是单试剂阐发中,可以利用双波长的方法来部分消除样品自己的光吸收搅扰.目前用单试剂法测定的项目应用双波长的为血清总蛋白（双缩脲法）主波长500nm,次波长576nm；血清白蛋白（溴甲酚氯法）主、次波长辨别为600和700nm；钙（偶氮砷Ⅲ法）主、次波长辨别为 660、770nm；磷（紫外比色法）主、次波长为340、405nm,镁（二甲苯胺蓝法）主、次波长为505和 600nm.三、单试剂和双试剂方法反响过程中只加一次试剂称单试剂方法,加两次试剂便为双试剂方法.目前的生化阐发仪大多可用双试剂方法阐发,其优点是：①可提高试剂的稳定性,多数双试剂混合成单一任务试剂时,其稳定时间缩短；②能设置两点终点法,来消除来自样品自己的光吸收搅扰；③在某些项目检测时能消除非特异性化学反响的搅扰.如血清ALT测定,血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的指示酶（乳酸脱氢酶）起反响,使结果偏高.若先加入缺乏α-酮戊二酸的第一试剂,使其它酮酸与指示酶反响之后再加入含有α-酮戊二酸的第二试剂,启动真正的ALT酶促反响生成丙酮酸,而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反响消耗的NAD＋能真正反应ALT的活性,从而消除以上副反响的影响.四、测定过程的自动监测各类自动生化阐发仪或多或少都具有对测定过程进行各类监测的功效,以便在没有人"监督"化学反响的情况下提高检测的准确性.高级阐发仪的监测功效更强.1．试剂空白监测每种试剂都有一定的空白吸光度规模,试剂空白吸光度的改动往往提示着该试剂的蜕变：如利用Trinder反响为原理的检测试剂会因酚被氧化为醌而变成红色；碱性磷酸酶、γ－谷氨酰转移酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分化出硝基酚或硝基苯胺而变黄；有些试剂久置后变浑浊.这些情况均可使空白吸光度升高.丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反响检测项目,其试剂在放置过程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降等.试剂空白的测定办法有两种：①每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度,这种方法适用于先取样品后加试剂的阐发仪.②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度,适用于先加试剂后取样品的阐发仪.2．试剂空白变更速率监测一些酶试剂在反响温度下不稳定,其空白吸光度可随着时间逐渐产生变更,这种变更的主要原因与东西酶或辅酶的纯度有关,且因试剂的组成和生产厂家的不合而不合.这种变更会影响测定结果的准确性,一般使结果偏高.如果设置此项监测,阐发仪在结果计算时会自动减去试剂空白变更速率.在以监测NAD（P）H减少为指示反响的酶活性测定中,空白速率可监测并消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降；在色素原为底物的酶活性测定中,空白速率可监测并消除底物自身分化造成的吸光度升高.有关空白速率监测在胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐负搅扰消除中的作用,已如前述.3．样品信息监测由于样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果产生非化学反响的搅扰.按照溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性,用双波长或多波长检测其性质和程度,一般是测定样品在600nm／570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小来辨别判断样品溶血、脂浊和黄疸程度.然后在结果计算时自动减去这部分搅扰,这将有利于提高阐发结果的可靠性.4．结果可靠性监测（1）终点监测：终点法测定要判断所选的测光点是否到达终点或平衡点.一些阐发仪在所选终点后再选一个测光点,比较这两点吸光度的差别来判断反响是否到达终点.（2）线性期监测：连续监测法选择时间－吸光度反响曲线上的线性期来计算酶活性或被测物浓度,因此仪器要确定此连续监测期是否呈线性.其监测办法为①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归,计算出各点的方差,按照方差值的大小来判断是否呈线性；②取连续监测期开始若干点的变更速率与连续监测期最后若干点的变更速率进行比较,来判断是否为线性期.5．底物消耗的监测在连续监测法测定酶活性时,如果在监测期内吸光度上升或下降超出其底物耗尽值,则说明该样品酶活性很是高,底物将被耗尽,监测期的吸光度将偏离线性,使测定结果不成靠.此时不打印结果或打印结果同时也打印出底物耗尽提示,该样品应稀释一定的倍数重新测定.此监测对于采取负反响阐发酶活性的办法甚为重要.见图7-96．办法线性规模监测每种待测物阐发都有一个可测定的浓度或活性规模,样品结果若超出此规模,阐发仪将显示测定结果超出线性规模的提示,多数阐发仪会自动将样品减量或增量重新测定.一、阐发办法分类（一）终点法被测物质在反响过程中完全被转变成产品,即达到反响终点,按照终点吸光度的大小求出被测物浓度,称为终点法（end essay）.实际上被测物并没有完全被转变,而只是与产品达到一个动态的化学平衡,因此该法称为平衡法更加恰当.从时间-吸光度曲线来看,到达反响终点或平衡点时,吸光度将不再变更.阐发仪通常在反响终点邻近连续选择两个吸光度值,求出其平均值计算结果,并可按照两点的吸光度差来判断反响是否到达反响终点.终点法参数设置简单,反响时间一般较长,精密度较好.终点时间的确定：①按照时间-吸光度曲线来确定,如Trinder反响测定尿酸,反响曲线上3～5min时其吸光度已趋向稳定,因而可将5min作为反响终点.②按照被测物反响终点,结合搅扰物的反响情况来确定,如在血清白蛋白的溴甲酚绿法测定中,白蛋白与溴甲酚绿在10s内很快完成反响,之后α球蛋白和β球蛋白与溴甲酚绿产生 "慢反响",使反响曲线上吸光度在10s后仍继续缓慢上升,持续约达10min,因此终点时间应采取10～30s,而不该选择10min. 1．一点终点法：在反响到达终点,即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改动时选择一个终点吸光度值,这种办法称为一点终点法（one point end essay）,其反响曲线见图7-3.其检测结果的计算公式是：待测物浓度CU=（待测吸光度AU－试剂空白吸光度AB）×K. K为校准系数,详见第五节二操纵办法.2．两点终点法：在被测物反响或指示反响尚未开始时,选择第一个吸光度,在反响到达终点或平衡时选择第二个吸光度,此两点吸光度之差用于计算结果,称为两点终点法（two point endessay）,其反响曲线见图7-4.计算公式为CU=（待测吸光度A2－待测吸光度A1）×K.该法能有效地消除溶血（hemolysis）、黄疸（icterus）和脂浊（lipo-turbid）等样品自己光吸收（见图7-5）造成的搅扰.在单试剂阐发加入试剂的初期、或双试剂阐发中第二试剂加入之初,若指示反响吸光度尚未明显变更,则可在此时选择第一个吸光度,在指示反响终点时选择第二个吸光度,从而设置成两点终点法.但指示反响初期吸光度无明显变更的化学反响较少,如单试剂方法测定总蛋白、白蛋白、钙、磷、镁等的终点法阐发项目,及双试剂方法测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的终点法阐发项目,因反响初期吸光度已有明显变更,因而均难以用上述方法设置两点终点法.但在双试剂阐发中,如果将第一吸光度选择在第二试剂加入前,此时指示反响一般尚未开始,则能容易设置两点终点法.在此要注意必须将两次读吸光度时不合比色液体积进行校正.目前全自动阐发仪均具有此自动校正功效,不必手工进行校正.（二）固定时间法指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点,此两点既非反响初始吸光度亦非终点吸光度,这两点的吸光度差值用于结果计算,称为固定时间法（fixed-time essay）,反响曲线见图7-6.其计算公式与两点终点法相同,为CU=(A2-A1)×K.有时也称此法为两点法.该阐发办法有助于解决某些反响的非特异性问题.例如：苦味酸法测定肌酐,反响的最初30s内,血清中快反响搅扰物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能与碱性苦味酸反响；在第二个30s时碱性苦味酸主要与肌酐反响,且此段时间－吸光度曲线的线性较好（故也可用连续监测法测定肌酐）；在80～120s及其以后,碱性苦味可与蛋白质以及其它慢反响搅扰物反响.这样选用反响的第二个30s为测定时间,既避免了快反响物质的搅扰,也避免了慢反响物质的影响,使肌酐浓度与吸光度变更呈良好的线性关系,有利于提高阐发的特异性和准确度.（三）连续监测法连续监测法（continuous monitoring essay）又称速率法（rate essay）,是在测定酶活性或用酶法测定代谢产品时,连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值,并以此线性期的单位吸光度变更值（ΔA/min）计算结果,见图7-7A和B.所谓线性期就是各点吸光度差值相等,如图7-7C所示,图中δ1及δ5值偏小,而δ2＝δ3＝δ4,故A1点至A4点属线性段.此线性期对底物来说属零级反响,期间的ΔA/min即为酶促反响的初速度,其大小与被测酶活性成正比.连续监测法的优点即是可以确定线性期并计算ΔA/min,按照此值再准确地计算酶活性,因而使自动生化阐发仪在酶活性测定方面显著地优于手工法.连续监测法也可用于测定呈线性反响的代谢物浓度,一般是某些基于酶法测定的代谢物.酶活性（U/L）＝ΔA/min×理论（或校准）K值,代谢物浓度CU=ΔA/min×校准K 值.关于理论K值和校准K值叙述如下：1．理论K值：多用于酶活性测定中,因酶活性尚无公认的校准品可用,因而按照酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：酶活性(U/L)=ΔA/min× ,将此式中以K来暗示,此K值可通过对已知值即指示物质的毫摩尔消光系数（ε）、反响液总容量（TV）、样品容量（SV）和比色杯光径（d）计算后得出,即为理论K值,可作为阐发参数输入到阐发仪中.采取理论K值的前提应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等.但事实上由于各型阐发仪在注射器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差别,可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差.温度的影响有时也很是大,由于反响盘是半流露的,因此随着较冷试剂的加入,反响盘中的温度会逐渐降低,尽管开始测定时反响盘温度已升到37°C,但在某一项目测定过程的开始阶段,温度可能达不到37°C ,甚至仅35°C左右,且反响过程中仍有可能上下动摇,这对于酶学反响来说影响是很大的.如采取37°C时的理论K值,将会使测定结果降低,温度的动摇还会使得结果的重复性降低.当然,若试剂在加入反响杯前经试剂臂内加热装置预温,则基本不影响反响盘温度.由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长、带宽以及加样系统的准确性等的影响,书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用阐发仪所测的不合,因而有需要获得实际的摩尔吸光系数,然后用来计算的K值称为实测K值.（1）NADH（NADPH）摩尔吸光系数的测定：NADH（NADPH）没有尺度纯制品,并且配成溶液后稳定性又较差,不克不及直接用NADH或NADPH尺度液来校正仪器,须通过有NAD+(NADP+)介入的反响途径.用已糖激酶 (HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)办法测定葡萄糖时,葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系.葡萄糖有尺度纯制品,又有国家批准文号的葡葡糖尺度液.因此,按照公式A=εbC,已知比色杯光径b和葡萄糖尺度液浓度,测得葡萄糖尺度管的吸光度A后即可计算出NADH（NADPH）的摩尔吸光系数ε为 A/bC.假设,葡萄糖尺度液浓度为1Ommo1/L(0.01mol/L),尺度液加入量为3.5μL,酶试剂加入量为335μL,比色杯光径为0.7cm,在340nm测得吸光度为0.465,则实测NADH摩尔吸光系数= ＝6424 ,即在此台阐发仪上340nm波长处测得NADH（NADPH）的摩尔吸光系数为6424,而理论上NADH（NADPH）的ε为6220.（2）"色素原"酶促产品在405nm波长摩尔吸光系数的测定：有许多酶底物为人工合成的"色素原"底物,其自己无色,经酶作用后释放出有色的反响产品,在405nm波长具有吸收峰.最经常使用色素原底物及其产品为: ALP测定以磷酸对硝基苯酚 (4-Nitrophenyl phosphate,4-NPP)为底物,经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-Nitrophenol,4-NP),GGT测定以γ-L-谷氨酰对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或γ-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)为底物,经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroaniline,4-NA)或对硝基-5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid, ANBA).对硝基苯酚的摩尔吸光系数为18700(405nm),对硝基苯胺的摩尔吸光系数为9870(405nm),对硝基-5-氨基苯甲酸的摩尔吸光系数为9490(405nm).下面是对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定办法.试剂：① 4-NP尺度储存液(1Ommo1/L).② 4-NP尺度应用液(2.5mmo1/L,以0.84mol/L AMP缓冲液稀释而成).③ 底物缓冲液(l5mmol/L 4-NPP配于0.84mol/L AMP-HCL缓冲液中,37℃,pHl0.09土0.02).测定办法：4-NP尺度液加入量为5μL,底物缓冲液加入量为350μL,波长405nm,光径0.7cm,温度37℃,测定得吸光度为A1；另用蒸馏水代替4-NP尺度液,按上述办法测定其吸光度为A2,4-NP尺度液吸光度ΔA= A1- A2,若测得ΔA为0.460,则实测4-NP摩尔吸光系数＝＝186622．校准K值酶活性校准品经校准操纵后由阐发仪自动计算得出.在进行酶学测定时,如果阐发条件的变更如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏差可同等程度地影响校准物和待测样品,则使用校准品能进行抵偿.一般来说以使用校准K值为好,但必须有两个先决条件：①必须使用配套的试剂；②必须使用配套的高质量的校准品,该校准品应具有溯源性.使用与该阐发仪配套的酶活性校准品也可得到较好的酶活性测定结果.关于酶活性尺度品,欧洲尺度局（BCR）和美国国家尺度技术研究院（NIST）均颁发了人血清基质的酶活性尺度物,但目前尚无公认的尺度（校准）品问世.（四）透射比浊法抗原与相应的抗体结合形成的免疫复合物,在反响液中具有一定的。
两点法、终点法、速率法
什么叫两点法、终点法、速率法?两点法：测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产物或底物浓度的总变化量以求取酶反应初速度的方法。
终点法：通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量，以求出酶活力的方法，亦称平衡法。
速率法：是指连续测定(每15秒~1分钟监测一次)酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应的初速度的方法，即连续监测法。
一、常用生化检测项目分析方法举例1．终点法检测常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。
以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。
2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。
（两点法）3．连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。
一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。
4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。
二、分析参数设置分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。
各种测定项目的分析参数（analysis paramete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。
两点法、终点法、速率法
什么叫两点法、终点法、速率法?两点法：测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产物或底物浓度的总变化量以求取酶反应初速度的方法。
终点法：通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量，以求出酶活力的方法，亦称平衡法。
速率法：是指连续测定(每15秒~1分钟监测一次)酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应的初速度的方法，即连续监测法。
一、常用生化检测项目分析方法举例1．终点法检测常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。
以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。
2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。
（两点法）3．连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。
一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。
4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。
二、分析参数设置分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。
各种测定项目的分析参数（analysis paramete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。
两点法、终点法、速率法
什么叫两点法、终点法、速率法?之迟辟智美创作两点法：测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产物或底物浓度的总变动量以求取酶反应初速度的方法.终点法：通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变动量，以求出酶活力的方法，亦称平衡法.速率法：是指连续测定(每15秒~1分钟监测一次)酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变动来求出酶反应的初速度的方法，即连续监测法.一、经常使用生化检测项目分析方法举例1．终点法检测经常使用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总卵白（双缩脲法）、血清白卵白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂卵白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等.以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采纳一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总卵白、白卵白测定均已有双试剂可用.2．固按时间法苦味酸法测定肌酐采纳此法.（两点法）3．连续监测法对酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等.一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法.4．透射比浊法透射比浊法可用于测定发生浊度反应的项目，大都属免疫比浊法，载脂卵白、免疫球卵白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他卵白质如前白卵白、结合珠卵白、转铁卵白等均可用此法.二、分析参数设置分析仪的一些通用把持步伐如取样、冲刷、吸光度检测、数据处置等，其法式均已经固化在存储器里，用户不能修改.各种测定项目的分析参数（analysisparamete）年夜部份也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前年夜大都生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数.生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定分析参数.因此必需理解各参数简直切意义.一、分析参数介绍（一）必选分析参数这类参数是分析仪检测的前提条件，没有这些参数无法进行检测.1．试验名称试验名称（test code）是指测定项目的标示符，常以项目的英文缩写来暗示.2．方法类型（也称反应模式）方法类型（assay）有终点法、两点法、连续监测法等，根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型.3．反应温度一般有30℃、37℃可供选择，通常固定为37℃. 4．主波长主波长（primary wavelength）是指定一个与被测物质反应产物的光吸收有关的波长.5．次波长次波长（secondary wavelength）是在使用双波长时，要指定一个与主波长、干扰物质光吸收有关的波长. 6．反应方向反应方向（response direction）有正向反应和负向反应两种，吸光度增加为正向反应，吸光度下降为负向反应.7．样品量样品量（sampling volum）一般是2μl～35μμμl.可设置常量、减量和增量.8．第一试剂量第一试剂量（first regengt volum）一般是20～300μl，以1μl步进.9．第二试剂量第二试剂量（second regengt volum）一般也是20～300μl，以1μl步进.10．总反应容量总反应容量（total reacting volum）在分歧的分析仪有一个分歧的规定范围，一般是180～350μl，个别仪器能减少至120μl.总反应容量太少无法进行吸光度测定. 11．孵育时间孵育时间（incubate time）在终点法是样品与试剂混匀开始至反应终点为止的时间，在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间. 12．延迟时间延迟时间（delay time）在连续监测法中样品与反应试剂（第二试剂）混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间.13．连续监测时间连续监测时间（continuous monitoring time）在延迟时间之后即开始，一般为60～120s，很多于4个吸光度检测点（3个吸光度变动值）.14．校准液个数及浓度校准曲线线性好并通过坐标零点的，可采纳一个校准液（calibrator）；线性好但欠亨过坐标零点，应使用两个校准液；对校准曲线呈非线性者，必需使用两个以上校准液.每一个校准液都要有一个合适的浓度. 15．校准K值或理论K值通过校准获得的K值为校准K值（calibrate coefficient）或由计算得出的K值为理论K值. 16．线性范围即方法的线性范围（linearity range），超越此范围应增加样品量或减少样品量重测.与试剂/样品比值有关. 17．小数点位数检测结果的小数点位数（decimal point digit）.（二）备选分析参数这类分析参数与检测结果的准确性有关，一般来说不设置这类分析参数，分析仪也能检测出结果，但如果样品中待测物浓度太高等，检测结果可能禁绝确.1．样品预稀释设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值，即可在分析前自动对样品进行高倍稀释.2．底物耗尽值底物耗尽值（substrate exhaust limit）在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸光度下降限.若低于此限时底物已太少，缺乏以维持零级反应而招致检测结果禁绝确.3．前区检查免疫比浊法中应用，以判断是否有抗原过剩.将终点法最后两个吸光度值的分歧（ΔA）设置一个限值，如果后一点的吸光度比前一点低，暗示已有抗原过剩，应稀释样品后重测.4．试剂空白吸光度范围超越此设定范围暗示试剂已蜕变，应更换合格试剂.5．试剂空白速率连续监测法中使用，是试剂自己在监测过程中没有化学反应时的变动速率.6．方法学赔偿系数用于校准分歧分析方法间测定结果的一致性，有斜率和截距两个参数.7．参考值范围对超越此范围的测定结果，仪器会打印出提示.（三）某些参数的特殊意义1．最小样品量最小样品量是指分析仪进样针能在规定的误差范围内吸取的最小样品量.一般分析仪的最小样品量是2μμl的.在样品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度的情况下往往需采纳分析仪的最小样品量作为减量参数，从而使分析仪检测范围（与线性范围分歧）的上限得以扩年夜. 2．最年夜试剂量方法灵敏度很高而线性上限低的检测项目，如血清白卵白的溴甲酚氯法测定，以往手工法把持时样品量10μl，试剂量4ml，这样试剂量/样品量比例（R/S）为200，线性上限则为60g/L.此法移植到分析仪上后，R/S却很难达到200，致使线性上限变低.因此对这类检测项目最年夜试剂量非常重要.3．弹性速率在酶活性测定中，当酶活性太高，在连续监测期中已不呈线性反应时，有些仪器具有弹性速率（flexrate）功能，能自动选择反应曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果，使酶活性测定的线性范围得以扩年夜.如AST可从1000U/L扩展至4000U/L，从而减少稀释及重测次数、降低本钱.4．试剂空白速率当样品中存在胆红素时，胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰.因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光吸收，而且胆红素在碱性环境中可被氧化转变，因而在肌酐反应过程中胆红素的光吸收呈下降趋势.若在加入第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率，因为此段中苦味酸尚未与肌酐反应，而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化转变，因而以第二试剂加入后的速率变动，减去试剂空白速率变动，即可消除胆红素的负干扰，见图7-8.二、单波长和双波长方式（一）概念采纳一个波长检测物质的光吸收强度的方式称为单波长(mono-wavelength)方式.当反应液中含有一种组分，或在混合反应液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时，可以选用.在吸光度检测中，使用一个主波长和一个次波长的称双波长方式.当反应液中存在干扰物的较年夜吸收、从而影响测定结果的准确性时，采纳双波长方式更好.（二）双波长的作用双波长(di-wavelength)测定优点是①消除噪音干扰;②减少杂散光影响;③减少样品自己光吸收的干扰.从光源，到比色杯、单色器、检测器的整个光路系统中，均存在着随时间发生变动的不稳定的检测信号，即噪音，而双波长检测是同时进行的，两种波长检测发生的噪音基本上相同，因而能消除噪音干扰.当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红卵白、胆红素等时，会发生非特异性的光吸收，而干扰测定结果的准确性.采纳双波长方式测定可以部份消除这类干扰，提高检测的准确性.（三）次波长简直定方法当被测物的主波长确定之后，再选择次波长.如根据甘油三酯等干扰物吸收光谱特征，选择次波长，使干扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值，而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较年夜的不同.一般来说，次波长应年夜于主波长100nm.以主波长与次波长吸光度差来计算结果.（四）双波长的具体应用对某些反应速度快且无法设置为两点终点法的分析项目，尤其是单试剂分析中，可以利用双波长的方式来部份消除样品自己的光吸收干扰.目前用单试剂法测定的项目应用双波长的为血清总卵白（双缩脲法）主波长500nm，次波长576nm；血清白卵白（溴甲酚氯法）主、次波长分别为600和700nm；钙（偶氮砷Ⅲ法）主、次波长分别为 660、770nm；磷（紫外比色法）主、次波长为340、405nm，镁（二甲苯胺蓝法）主、次波长为505和 600nm.三、单试剂和双试剂方式反应过程中只加一次试剂称单试剂方式，加两次试剂便为双试剂方式.目前的生化分析仪年夜多可用双试剂方式分析，其优点是：①可提高试剂的稳定性，大都双试剂混合成单一工作试剂时，其稳按时间缩短；②能设置两点终点法，来消除来自样品自己的光吸收干扰；③在某些项目检测时能消除非特异性化学反应的干扰.如血清ALT测定，血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的指示酶（乳酸脱氢酶）起反应，使结果偏高.若先加入缺乏α-酮戊二酸的第一试剂，使其它酮酸与指示酶反应之后再加入含有α-酮戊二酸的第二试剂，启动真正的ALT酶促反应生成丙酮酸，而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反应消耗的NAD＋能真正反映ALT的活性，从而消除以上副反应的影响.四、测定过程的自动监测各种自动生化分析仪或多或少都具有对测定过程进行各种监测的功能，以便在没有人"监督"化学反应的情况下提高检测的准确性.高档分析仪的监测功能更强.1．试剂空白监测每种试剂都有一定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的蜕变：如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因酚被氧化为醌而酿成红色；碱性磷酸酶、γ－谷氨酰转移酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或硝基苯胺而变黄；有些试剂久置后变浑浊.这些情况均可使空白吸光度升高.丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应检测项目，其试剂在放置过程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降等.试剂空白的测定方法有两种：①每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度，这种方式适用于先取样品后加试剂的分析仪.②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度，适用于先加试剂后取样品的分析仪.2．试剂空白变动速率监测一些酶试剂在反应温度下不稳定，其空白吸光度可随着时间逐渐发生变动，这种变动的主要原因与工具酶或辅酶的纯度有关，且因试剂的组成和生产厂家的分歧而分歧.这种变动会影响测定结果的准确性，一般使结果偏高.如果设置此项监测，分析仪在结果计算时会自动减去试剂空白变动速率.在以监测NAD（P）H 减少为指示反应的酶活性测定中，空白速率可监测并消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降；在色素原为底物的酶活性测定中，空白速率可监测并消除底物自身分解造成的吸光度升高.有关空白速率监测在胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐负干扰消除中的作用，已如前述.3．样品信息监测由于样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果发生非化学反应的干扰.根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，用双波长或多波长检测其性质和水平，一般是测定样品在600nm／570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的年夜小来分别判断样品溶血、脂浊和黄疸水平.然后在结果计算时自动减去这部份干扰，这将有利于提高分析结果的可靠性.4．结果可靠性监测（1）终点监测：终点法测定要判断所选的测光点是否达到终点或平衡点.一些分析仪在所选终点后再选一个测光点，比力这两点吸光度的不同来判断反应是否达到终点.（2）线性期监测：连续监测法选择时间－吸光度反应曲线上的线性期来计算酶活性或被测物浓度，因此仪器要确定此连续监测期是否呈线性.其监测方法为①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归，计算出各点的方差，根据方差值的年夜小来判断是否呈线性；②取连续监测期开始若干点的变动速率与连续监测期最后若干点的变动速率进行比力，来判断是否为线性期.5．底物消耗的监测在连续监测法测定酶活性时，如果在监测期内吸光度上升或下降超越其底物耗尽值，则说明该样品酶活性非常高，底物将被耗尽，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不成靠.此时不打印结果或打印结果同时也打印出底物耗尽提示，该样品应稀释一定的倍数重新测定.此监测对采纳负反应分析酶活性的方法甚为重要.见图7-9 6．方法线性范围监测每种待测物分析都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果若超越此范围，分析仪将显示测定结果超越线性范围的提示，大都分析仪会自动将样品减量或增量重新测定.一、分析方法分类（一）终点法被测物质在反应过程中完全被转酿成产物，即达到反应终点，根据终点吸光度的年夜小求出被测物浓度，称为终点法（end essay）.实际上被测物并没有完全被转变，而只是与产物达到一个静态的化学平衡，因此该法称为平衡法更为恰当.从时间-吸光度曲线来看，达到反应终点或平衡点时，吸光度将不再变动.分析仪通常在反应终点附近连续选择两个吸光度值，求出其平均值计算结果，并可根据两点的吸光度差来判断反应是否达到反应终点.终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好.终点时间简直定：①根据时间-吸光度曲线来确定，如Trinder反应测定尿酸，反应曲线上3～5min时其吸光度已趋向稳定，因而可将5min作为反应终点.②根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定，如在血清白卵白的溴甲酚绿法测定中，白卵白与溴甲酚绿在10s内很快完成反应，之后α球卵白和β球卵白与溴甲酚绿发生 "慢反应"，使反应曲线上吸光度在10s后仍继续缓慢上升，继续约达10min，因此终点时间应采纳10～30s，而不应选择10min. 1．一点终点法：在反应达到终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，这种方法称为一点终点法（one point end essay），其反应曲线见图7-3.其检测结果的计算公式是：待测物浓度CU=（待测吸光度AU－试剂空白吸光度AB）×K. K为校准系数，详见第五节二把持方法.2．两点终点法：在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应达到终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果，称为两点终点法（two point end essay），其反应曲线见图7-4.计算公式为CU=（待测吸光度A2－待测吸光度A1）×K.该法能有效地消除溶血（hemolysis）、黄疸（icterus）和脂浊（lipo-turbid）等样品自己光吸收（见图7-5）造成的干扰.在单试剂分析加入试剂的早期、或双试剂分析中第二试剂加入之初，若指示反应吸光度尚未明显变动，则可在此时选择第一个吸光度，在指示反应终点时选择第二个吸光度，从而设置成两点终点法.但指示反应早期吸光度无明显变动的化学反应较少，如单试剂方式测定总卵白、白卵白、钙、磷、镁等的终点法分析项目，及双试剂方式测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的终点法分析项目，因反应早期吸光度已有明显变动，因而均难以用上述方式设置两点终点法.但在双试剂分析中，如果将第一吸光度选择在第二试剂加入前，此时指示反应一般尚未开始，则能容易设置两点终点法.在此要注意必需将两次读吸光度时分歧比色液体积进行校正.目前全自动分析仪均具有此自动校正功能，不用手工进行校正.（二）固按时间法指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算，称为固按时间法（fixed-time essay），反应曲线见图7-6.其计算公式与两点终点法相同，为CU=(A2-A1)×K.有时也称此法为两点法.该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题.例如：苦味酸法测定肌酐，反应的最初30s内，血清中快反应干扰物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能与碱性苦味酸反应；在第二个30s时碱性苦味酸主要与肌酐反应，且此段时间－吸光度曲线的线性较好（故也可用连续监测法测定肌酐）；在80～120s及其以后，碱性苦味可与卵白质以及其它慢反应干扰物反应.这样选用反应的第二个30s为测按时间，既防止了快反应物质的干扰，也防止了慢反应物质的影响，使肌酐浓度与吸光度变动呈良好的线性关系，有利于提高分析的特异性和准确度.（三）连续监测法连续监测法（continuous monitoring essay）又称速率法（rate essay），是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以此线性期的单元吸光度变动值（ΔA/min）计算结果，见图7-7A 和B.所谓线性期就是各点吸光度差值相等，如图7-7C所示，图中δ1及δ5值偏小，而δ2＝δ3＝δ4，故A1点至A4点属线性段.此线性期对底物来说属零级反应，期间的ΔA/min 即为酶促反应的初速度，其年夜小与被测酶活性成正比.连续监测法的优点即是可以确定线性期并计算ΔA/min，根据此值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法.连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物.酶活性（U/L）＝ΔA/min×理论（或校准）K值，代谢物浓度CU=ΔA/min×校准K值.关于理论K值和校准K值叙述如下：1．理论K值：多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用，因而根据酶活性的国际单元界说得出酶活性的计算公式为：酶活性(U/L)=ΔA/min× ，将此式中以K来暗示，此K值可通过对已知值即指示物质的毫摩尔消光系数（ε）、反应液总容量（TV）、样品容量（SV）和比色杯光径（d）计算后得出，即为理论K值，可作为分析参数输入到分析仪中.采纳理论K值的前提应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等.但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进机电精度、滤光片带宽等方面的不同，可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差.温度的影响有时也非常年夜，由于反应盘是半流露的，因此随着较冷试剂的加入，反应盘中的温度会逐渐降低，尽管开始测按时反应盘温度已升到37°C，但在某一项目测定过程的开始阶段，温度可能达不到37°C ，甚至仅35°C左右，且反应过程中仍有可能上下摆荡，这对酶学反应来说影响是很年夜的.如采纳37°C时的理论K值，将会使测定结果降低，温度的摆荡还会使得结果的重复性降低.固然，若试剂在加入反应杯前经试剂臂内加热装置预温，则基本不影响反应盘温度.由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长、带宽以及加样系统的准确性等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的分歧，因而有需要获得实际的摩尔吸光系数，然后用来计算的K值称为实测K值.（1）NADH（NADPH）摩尔吸光系数的测定：NADH （NADPH）没有标准纯制品，而且配成溶液后稳定性又较差，不能直接用NADH 或NADPH标准液来校正仪器，须通过有NAD+(NADP+)介入的反应途径.用已糖激酶 (HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系.葡萄糖有标准纯制品，又有国家批准文号的葡葡糖标准液.因此，根据公式A=εbC，已知比色杯光径b和葡萄糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度A后即可计算出NADH（NADPH）的摩尔吸光系数εμL，酶试剂加入量为335μL，比色杯光径为0.7cm，在340nm测得吸光度为0.465，则实测NADH摩尔吸光系数= ＝6424，即在此台分析仪上340nm波长处测得NADH （NADPH）的摩尔吸光系数为6424，而理论上NADH （NADPH）的ε为6220.（2）"色素原"酶促产物在405nm波长摩尔吸光系数的测定：有许多酶底物为人工合成的"色素原"底物，其自己无色，经酶作用后释放出有色的反应产物，在405nm波长具有吸收峰.最经常使用色素原底物及其产物为: ALP测定以磷酸对硝基苯酚 (4-Nitrophenyl phosphate，4-NPP)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-Nitrophenol，4-NP)，GGT测定以γ-L-谷氨酰对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或γ-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroaniline，4-NA)或对硝基-5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid， ANBA).对硝基苯酚的摩尔吸光系数为18700(405nm)，对硝基苯胺的摩尔吸光系数为9870(405nm)，对硝基-5-氨基苯甲酸的摩尔吸光系数为9490(405nm).下面是对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定方法.试剂：① 4-NP标准贮存液(1Ommo1/L).② 4-NP标准应用液(2.5mmo1/L，以0.84mol/L AMP缓冲液稀释而成).③底物缓冲液(l5mmol/L 4-NPP配于0.84mol/L AMP-HCL缓冲液中，37℃,pH l0.09土0.02).测定方法：4-NP标准液加入量为5μL，底物缓冲液加入量为350μL，波长405nm，光径0.7cm，温度37℃，测定得吸光度为A1；另用蒸馏水取代4-NP标准液，按上述方法测定其吸光度为A2，4-NP标准液吸光度ΔA= A1- A2，若测得ΔA 为0.460，则。
两点法、终点法、速率法
什么叫两点法、终点法、速率法?之马矢奏春创作两点法：测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产物或底物浓度的总变动量以求取酶反应初速度的方法.终点法：通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变动量, 以求出酶活力的方法, 亦称平衡法.速率法：是指连续测定(每15秒~1分钟监测一次)酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变动来求出酶反应的初速度的方法, 即连续监测法.一、经常使用生化检测项目分析方法举例1．终点法检测经常使用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总卵白（双缩脲法）、血清白卵白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂卵白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等.以上项目中, 除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采纳一点终点法外, 其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法, 包括总卵白、白卵白测定均已有双试剂可用.2．固按时间法苦味酸法测定肌酐采纳此法.（两点法）3．连续监测法对酶活性测定一般应选用连续监测法, 如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等.一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等, 也可用连续监测法.4．透射比浊法透射比浊法可用于测定发生浊度反应的项目, 大都属免疫比浊法, 载脂卵白、免疫球卵白、补体、抗"O"、类风湿因子, 以及血清中的其他卵白质如前白卵白、结合珠卵白、转铁卵白等均可用此法.二、分析参数设置分析仪的一些通用把持步伐如取样、冲刷、吸光度检测、数据处置等, 其法式均已经固化在存储器里, 用户不能修改.各种测定项目的分析参数（analysisparamete）年夜部份也已设计好, 存于磁盘中, 供用户使用；目前年夜大都生化分析仪为开放式, 用户可以更改这些参数.生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道, 由用户自己设定分析参数.因此必需理解各参数简直切意义.一、分析参数介绍（一）必选分析参数这类参数是分析仪检测的前提条件, 没有这些参数无法进行检测. 1．试验名称试验名称（test code）是指测定项目的标示符, 常以项目的英文缩写来暗示.2．方法类型（也称反应模式）方法类型（assay）有终点法、两点法、连续监测法等, 根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型.3．反应温度一般有30℃、37℃可供选择, 通常固定为37℃. 4．主波长主波长（primary wavelength）是指定一个与被测物质反应产物的光吸收有关的波长.5．次波长次波长（secondary wavelength）是在使用双波长时, 要指定一个与主波长、干扰物质光吸收有关的波长.6．反应方向反应方向（response direction）有正向反应和负向反应两种, 吸光度增加为正向反应, 吸光度下降为负向反应. 7．样品量样品量（sampling volum）一般是2μl～35μl, 以0.1μl步进, 个别分析仪最少能达到1.6μl.可设置常量、减量和增量.8．第一试剂量第一试剂量（first regengt volum）一般是20～300μl, 以1μl步进.9．第二试剂量第二试剂量（second regengt volum）一般也是20～300μl, 以1μl步进.10．总反应容量总反应容量（total reacting volum）在分歧的分析仪有一个分歧的规定范围, 一般是180～350μl, 个别仪器能减少至120μl.总反应容量太少无法进行吸光度测定.11．孵育时间孵育时间（incubate time）在终点法是样品与试剂混匀开始至反应终点为止的时间, 在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间.12．延迟时间延迟时间（delay time）在连续监测法中样品与反应试剂（第二试剂）混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间.13．连续监测时间连续监测时间（continuous monitoring time）在延迟时间之后即开始, 一般为60～120s, 很多于4个吸光度检测点（3个吸光度变动值）.14．校准液个数及浓度校准曲线线性好并通过坐标零点的, 可采纳一个校准液（calibrator）；线性好但欠亨过坐标零点, 应使用两个校准液；对校准曲线呈非线性者, 必需使用两个以上校准液.每一个校准液都要有一个合适的浓度.15．校准K值或理论K值通过校准获得的K值为校准K值（calibrate coefficient）或由计算得出的K值为理论K值. 16．线性范围即方法的线性范围（linearity range）, 超越此范围应增加样品量或减少样品量重测.与试剂/样品比值有关.17．小数点位数检测结果的小数点位数（decimal point digit）.（二）备选分析参数这类分析参数与检测结果的准确性有关, 一般来说不设置这类分析参数, 分析仪也能检测出结果, 但如果样品中待测物浓度太高等, 检测结果可能禁绝确.1．样品预稀释设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值, 即可在分析前自动对样品进行高倍稀释.2．底物耗尽值底物耗尽值（substrate exhaust limit）在负反应的酶活性测定中, 可设置此参数, 以规定一个吸光度下降限.若低于此限时底物已太少, 缺乏以维持零级反应而招致检测结果禁绝确.3．前区检查免疫比浊法中应用, 以判断是否有抗原过剩.将终点法最后两个吸光度值的分歧（ΔA）设置一个限值, 如果后一点的吸光度比前一点低, 暗示已有抗原过剩, 应稀释样品后重测. 4．试剂空白吸光度范围超越此设定范围暗示试剂已蜕变, 应更换合格试剂.5．试剂空白速率连续监测法中使用, 是试剂自己在监测过程中没有化学反应时的变动速率.6．方法学赔偿系数用于校准分歧分析方法间测定结果的一致性, 有斜率和截距两个参数.7．参考值范围对超越此范围的测定结果, 仪器会打印出提示.（三）某些参数的特殊意义1．最小样品量最小样品量是指分析仪进样针能在规定的误差范围内吸取的最小样品量.一般分析仪的最小样品量是2μl, 目前也有小至1.6μl的.在样品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度的情况下往往需采纳分析仪的最小样品量作为减量参数, 从而使分析仪检测范围（与线性范围分歧）的上限得以扩年夜.2．最年夜试剂量方法灵敏度很高而线性上限低的检测项目, 如血清白卵白的溴甲酚氯法测定, 以往手工法把持时样品量10μl, 试剂量4ml, 这样试剂量/样品量比例（R/S）为200, 线性上限则为60g/L.此法移植到分析仪上后, R/S却很难达到200, 致使线性上限变低.因此对这类检测项目最年夜试剂量非常重要.3．弹性速率在酶活性测定中, 当酶活性太高, 在连续监测期中已不呈线性反应时, 有些仪器具有弹性速率（flexrate）功能, 能自动选择反应曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果, 使酶活性测定的线性范围得以扩年夜.如AST可从1000U/L扩展至4000U/L, 从而减少稀释及重测次数、降低本钱.4．试剂空白速率当样品中存在胆红素时, 胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰.因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光吸收, 而且胆红素在碱性环境中可被氧化转变,因而在肌酐反应过程中胆红素的光吸收呈下降趋势.若在加入第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率, 因为此段中苦味酸尚未与肌酐反应, 而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化转变, 因而以第二试剂加入后的速率变动, 减去试剂空白速率变动, 即可消除胆红素的负干扰, 见图7-8.二、单波长和双波长方式（一）概念采纳一个波长检测物质的光吸收强度的方式称为单波长(mono-wavelength)方式.当反应液中含有一种组分, 或在混合反应液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时, 可以选用.在吸光度检测中, 使用一个主波长和一个次波长的称双波长方式.当反应液中存在干扰物的较年夜吸收、从而影响测定结果的准确性时, 采纳双波长方式更好.（二）双波长的作用双波长(di-wavelength)测定优点是①消除噪音干扰;②减少杂散光影响;③减少样品自己光吸收的干扰.从光源, 到比色杯、单色器、检测器的整个光路系统中, 均存在着随时间发生变动的不稳定的检测信号, 即噪音, 而双波长检测是同时进行的, 两种波长检测发生的噪音基本上相同, 因而能消除噪音干扰.当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红卵白、胆红素等时, 会发生非特异性的光吸收, 而干扰测定结果的准确性.采纳双波长方式测定可以部份消除这类干扰, 提高检测的准确性.（三）次波长简直定方法当被测物的主波长确定之后, 再选择次波长.如根据甘油三酯等干扰物吸收光谱特征, 选择次波长, 使干扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值, 而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较年夜的不同.一般来说, 次波长应年夜于主波长100nm.以主波长与次波长吸光度差来计算结果.（四）双波长的具体应用对某些反应速度快且无法设置为两点终点法的分析项目, 尤其是单试剂分析中, 可以利用双波长的方式来部份消除样品自己的光吸收干扰.目前用单试剂法测定的项目应用双波长的为血清总卵白（双缩脲法）主波长500nm, 次波长576nm；血清白卵白（溴甲酚氯法）主、次波长分别为600和700nm；钙（偶氮砷Ⅲ法）主、次波长分别为 660、770nm；磷（紫外比色法）主、次波长为340、405nm, 镁（二甲苯胺蓝法）主、次波长为505和 600nm.三、单试剂和双试剂方式反应过程中只加一次试剂称单试剂方式, 加两次试剂便为双试剂方式.目前的生化分析仪年夜多可用双试剂方式分析, 其优点是：①可提高试剂的稳定性, 大都双试剂混合成单一工作试剂时, 其稳按时间缩短；②能设置两点终点法, 来消除来自样品自己的光吸收干扰；③在某些项目检测时能消除非特异性化学反应的干扰.如血清ALT测定, 血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的指示酶（乳酸脱氢酶）起反应, 使结果偏高.若先加入缺乏α-酮戊二酸的第一试剂, 使其它酮酸与指示酶反应之后再加入含有α-酮戊二酸的第二试剂, 启动真正的ALT酶促反应生成丙酮酸, 而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反应消耗的NAD＋能真正反映ALT 的活性, 从而消除以上副反应的影响.四、测定过程的自动监测各种自动生化分析仪或多或少都具有对测定过程进行各种监测的功能, 以便在没有人"监督"化学反应的情况下提高检测的准确性.高档分析仪的监测功能更强.1．试剂空白监测每种试剂都有一定的空白吸光度范围, 试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的蜕变：如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因酚被氧化为醌而酿成红色；碱性磷酸酶、γ－谷氨酰转移酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或硝基苯胺而变黄；有些试剂久置后变浑浊.这些情况均可使空白吸光度升高.丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应检测项目, 其试剂在放置过程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降等.试剂空白的测定方法有两种：①每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度, 这种方式适用于先取样品后加试剂的分析仪.②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度, 适用于先加试剂后取样品的分析仪.2．试剂空白变动速率监测一些酶试剂在反应温度下不稳定, 其空白吸光度可随着时间逐渐发生变动, 这种变动的主要原因与工具酶或辅酶的纯度有关, 且因试剂的组成和生产厂家的分歧而分歧.这种变动会影响测定结果的准确性, 一般使结果偏高.如果设置此项监测, 分析仪在结果计算时会自动减去试剂空白变动速率.在以监测NAD（P）H减少为指示反应的酶活性测定中, 空白速率可监测并消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降；在色素原为底物的酶活性测定中, 空白速率可监测并消除底物自身分解造成的吸光度升高.有关空白速率监测在胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐负干扰消除中的作用, 已如前述.3．样品信息监测由于样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果发生非化学反应的干扰.根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性, 用双波长或多波长检测其性质和水平, 一般是测定样品在600nm／570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的年夜小来分别判断样品溶血、脂浊和黄疸水平.然后在结果计算时自动减去这部份干扰, 这将有利于提高分析结果的可靠性.4．结果可靠性监测（1）终点监测：终点法测定要判断所选的测光点是否达到终点或平衡点.一些分析仪在所选终点后再选一个测光点, 比力这两点吸光度的不同来判断反应是否达到终点.（2）线性期监测：连续监测法选择时间－吸光度反应曲线上的线性期来计算酶活性或被测物浓度, 因此仪器要确定此连续监测期是否呈线性.其监测方法为①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归, 计算出各点的方差, 根据方差值的年夜小来判断是否呈线性；②取连续监测期开始若干点的变动速率与连续监测期最后若干点的变动速率进行比力, 来判断是否为线性期.5．底物消耗的监测在连续监测法测定酶活性时, 如果在监测期内吸光度上升或下降超越其底物耗尽值, 则说明该样品酶活性非常高, 底物将被耗尽, 监测期的吸光度将偏离线性, 使测定结果不成靠.此时不打印结果或打印结果同时也打印出底物耗尽提示, 该样品应稀释一定的倍数重新测定.此监测对采纳负反应分析酶活性的方法甚为重要.见图7-96．方法线性范围监测每种待测物分析都有一个可测定的浓度或活性范围, 样品结果若超越此范围, 分析仪将显示测定结果超越线性范围的提示, 大都分析仪会自动将样品减量或增量重新测定.一、分析方法分类（一）终点法被测物质在反应过程中完全被转酿成产物, 即达到反应终点, 根据终点吸光度的年夜小求出被测物浓度, 称为终点法（end essay）.实际上被测物并没有完全被转变, 而只是与产物达到一个静态的化学平衡, 因此该法称为平衡法更为恰当.从时间-吸光度曲线来看, 达到反应终点或平衡点时, 吸光度将不再变动.分析仪通常在反应终点附近连续选择两个吸光度值, 求出其平均值计算结果, 并可根据两点的吸光度差来判断反应是否达到反应终点.终点法参数设置简单, 反应时间一般较长, 精密度较好.终点时间简直定：①根据时间-吸光度曲线来确定, 如Trinder反应测定尿酸, 反应曲线上3～5min时其吸光度已趋向稳定, 因而可将5min作为反应终点.②根据被测物反应终点, 结合干扰物的反应情况来确定, 如在血清白卵白的溴甲酚绿法测定中, 白卵白与溴甲酚绿在10s内很快完成反应, 之后α球卵白和β球卵白与溴甲酚绿发生 "慢反应", 使反应曲线上吸光度在10s后仍继续缓慢上升, 继续约达10min, 因此终点时间应采纳10～30s, 而不应选择10min.1．一点终点法：在反应达到终点, 即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值, 这种方法称为一点终点法（one point end essay）, 其反应曲线见图7-3.其检测结果的计算公式是：待测物浓度CU=（待测吸光度AU－试剂空白吸光度AB）×K. K为校准系数, 详见第五节二把持方法.2．两点终点法：在被测物反应或指示反应尚未开始时, 选择第一个吸光度, 在反应达到终点或平衡时选择第二个吸光度, 此两点吸光度之差用于计算结果, 称为两点终点法（two point end essay）, 其反应曲线见图7-4.计算公式为CU=（待测吸光度A2－待测吸光度A1）×K.该法能有效地消除溶血（hemolysis）、黄疸（icterus）和脂浊（lipo-turbid）等样品自己光吸收（见图7-5）造成的干扰.在单试剂分析加入试剂的早期、或双试剂分析中第二试剂加入之初, 若指示反应吸光度尚未明显变动, 则可在此时选择第一个吸光度, 在指示反应终点时选择第二个吸光度,从而设置成两点终点法.但指示反应早期吸光度无明显变动的化学反应较少, 如单试剂方式测定总卵白、白卵白、钙、磷、镁等的终点法分析项目, 及双试剂方式测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的终点法分析项目, 因反应早期吸光度已有明显变动, 因而均难以用上述方式设置两点终点法.但在双试剂分析中, 如果将第一吸光度选择在第二试剂加入前, 此时指示反应一般尚未开始,则能容易设置两点终点法.在此要注意必需将两次读吸光度时分歧比色液体积进行校正.目前全自动分析仪均具有此自动校正功能, 不用手工进行校正.（二）固按时间法指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点, 此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度, 这两点的吸光度差值用于结果计算, 称为固按时间法（fixed-time essay）, 反应曲线见图7-6.其计算公式与两点终点法相同, 为CU=(A2-A1)×K.有时也称此法为两点法.该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题.例如：苦味酸法测定肌酐, 反应的最初30s内, 血清中快反应干扰物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能与碱性苦味酸反应；在第二个30s时碱性苦味酸主要与肌酐反应, 且此段时间－吸光度曲线的线性较好（故也可用连续监测法测定肌酐）；在80～120s及其以后, 碱性苦味可与卵白质以及其它慢反应干扰物反应.这样选用反应的第二个30s为测按时间, 既防止了快反应物质的干扰, 也防止了慢反应物质的影响, 使肌酐浓度与吸光度变动呈良好的线性关系, 有利于提高分析的特异性和准确度.（三）连续监测法连续监测法（continuous monitoring essay）又称速率法（rate essay）, 是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时, 连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值, 并以此线性期的单元吸光度变动值（ΔA/min）计算结果, 见图7-7A和B.所谓线性期就是各点吸光度差值相等, 如图7-7C所示, 图中δ1及δ5值偏小, 而δ2＝δ3＝δ4, 故A1点至A4点属线性段.此线性期对底物来说属零级反应, 期间的ΔA/min即为酶促反应的初速度, 其年夜小与被测酶活性成正比.连续监测法的优点即是可以确定线性期并计算ΔA/min, 根据此值再准确地计算酶活性, 因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法.连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度, 一般是某些基于酶法测定的代谢物.酶活性（U/L）＝ΔA/min×理论（或校准）K值, 代谢物浓度CU=ΔA/min×校准K值.关于理论K值和校准K值叙述如下：1．理论K值：多用于酶活性测定中, 因酶活性尚无公认的校准品可用, 因而根据酶活性的国际单元界说得出酶活性的计算公式为：酶活性(U/L)=ΔA/min× , 将此式中以K来暗示, 此K值可通过对已知值即指示物质的毫摩尔消光系数（ε）、反应液总容量（TV）、样品容量（SV）和比色杯光径（d）计算后得出, 即为理论K值, 可作为分析参数输入到分析仪中.采纳理论K值的前提应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等.但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进机电精度、滤光片带宽等方面的不同, 可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差.温度的影响有时也非常年夜, 由于反应盘是半流露的, 因此随着较冷试剂的加入, 反应盘中的温度会逐渐降低, 尽管开始测按时反应盘温度已升到37°C, 但在某一项目测定过程的开始阶段, 温度可能达不到37°C , 甚至仅35°C左右, 且反应过程中仍有可能上下摆荡, 这对酶学反应来说影响是很年夜的.如采纳37°C时的理论K值, 将会使测定结果降低, 温度的摆荡还会使得结果的重复性降低.固然, 若试剂在加入反应杯前经试剂臂内加热装置预温, 则基本不影响反应盘温度.由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长、带宽以及加样系统的准确性等的影响, 书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的分歧, 因而有需要获得实际的摩尔吸光系数, 然后用来计算的K值称为实测K值.（1）NADH（NADPH）摩尔吸光系数的测定：NADH（NADPH）没有标准纯制品, 而且配成溶液后稳定性又较差, 不能直接用NADH 或NADPH标准液来校正仪器, 须通过有NAD+(NADP+)介入的反应途径.用已糖激酶 (HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖时, 葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系.葡萄糖有标准纯制品, 又有国家批准文号的葡葡糖标准液.因此, 根据公式A=εbC, 已知比色杯光径b和葡萄糖标准液浓度, 测得葡萄糖标准管的吸光度A后即可计算出NADH（NADPH）的摩尔吸光系数ε为 A/bC.假设,葡萄糖标准液浓度为1Ommo1/L(0.01mol/L), 标准液加入量为3.5μL, 酶试剂加入量为335μL, 比色杯光径为0.7cm, 在340nm测得吸光度为0.465, 则实测NADH摩尔吸光系数= ＝6424 , 即在此台分析仪上340nm波长处测得NADH（NADPH）的摩尔吸光系数为6424, 而理论上NADH（NADPH）的ε为6220.（2）"色素原"酶促产物在405nm波长摩尔吸光系数的测定：有许多酶底物为人工合成的"色素原"底物, 其自己无色, 经酶作用后释放出有色的反应产物, 在405nm波长具有吸收峰.最经常使用色素原底物及其产物为: ALP测定以磷酸对硝基苯酚 (4-Nitrophenyl phosphate, 4-NPP)为底物, 经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-Nitrophenol, 4-NP), GGT测定以γ-L-谷氨酰对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或γ-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)为底物, 经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroaniline, 4-NA)或对硝基-5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid, ANBA).对硝基苯酚的摩尔吸光系数为18700(405nm), 对硝基苯胺的摩尔吸光系数为9870(405nm), 对硝基-5-氨基苯甲酸的摩尔吸光系数为9490(405nm).下面是对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定方法.试剂：① 4-NP标准贮存液(1Ommo1/L).② 4-NP标准应用液(2.5mmo1/L, 以0.84mol/L AMP缓冲液稀释而成).③ 底物缓冲液(l5mmol/L 4-NPP配于0.84mol/L AMP-HCL缓冲液中, 37℃,pHl0.09土0.02).测定方法：4-NP标准液加入量为5μL, 底物缓冲液加入量为350μL, 波长405nm, 光径0.7cm, 温度37℃, 测定得吸光度为A1；另用蒸馏水取代4-NP标准液, 按上述方法测定其吸光度为A2, 4-NP标准液吸光度ΔA= A1- A2, 若测得ΔA为0.460, 则实测4-NP摩尔吸光系数＝＝186622．校准K值酶活性校准品经校准把持后由分析仪自动计算得出.在进行酶学测按时, 如果分析条件的变动如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏差可同等水平地影响校准物和待测样品, 则使用校准品能进行赔偿.一般来说以使用校准K值为好, 但必需有两个先决条件：①必需使用配套的试剂；②必需使用配套的高质量的校准品, 该校准品应具有溯源性.使用与该分析仪配套的酶活性校准品也可获得较好的酶活性测定结果.关于酶活性标准品, 欧洲标准局（BCR）和美国国家标准技术研究院（NIST）均发表了人血清基质的酶活性标准物, 但目前尚无公认的标准（校准）品问世.（四）透射比浊法。
两点法、终点法、速率法
什么叫两点法、终点法、速率法?两点法：测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产物或底物浓度的总变化量以求取酶反应初速度的方法。
终点法：通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量，以求出酶活力的方法，亦称平衡法。
速率法：是指连续测定(每15秒~1分钟监测一次)酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应的初速度的方法，即连续监测法。
一、常用生化检测项目分析方法举例1．终点法检测常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。
以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。
2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。
（两点法）3．连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。
一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。
4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。
二、分析参数设置分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。
各种测定项目的分析参数（analysis paramete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。
两点法、终点法、速率法之欧阳理创编
什么叫两点法、终点法、速率法?两点法：测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产物或底物浓度的总变化量以求取酶反应初速度的方法。
终点法：通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量，以求出酶活力的方法，亦称平衡法。
速率法：是指连续测定(每15秒~1分钟监测一次)酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应的初速度的方法，即连续监测法。
一、常用生化检测项目分析方法举例1．终点法检测常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。
以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。
2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。
（两点法）3．连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。
一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。
4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。
二、分析参数设置分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。
各种测定项目的分析参数（analysisparamete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。
终点法 速率法 二点法
终点法速率法二点法*终点法具有不同分子结构的物质，对光谱有选择吸收的特性，吸收光谱的可在可见光区域也可在紫外或红外光区域。
若利用物质对可见光谱的选择吸收作定量分析，此时主要表现为颜色的变化，称为比色分析法；若利用物质对紫外或红外光区域的选择吸收作定量分析，称为吸收分光光度法。
比色分析法和吸收分光光度法灵敏度高，选择性好，操作方便，已广泛用于临床生化分析，临床诊断试剂盒基本上都采用这二种方法。
其基本原理是被测物的吸光特性符合Lambert-Beer定律：Ａ=abc其中Ａ为吸光度，a为吸光系数或消光系数；b为光径，即光线通过的溶液的厚度，与比色皿有关，c为吸光物质在溶液中的浓度。
在选定了试剂和仪器后，式中a和b是固定的，所以溶液中待测物质的浓度与溶液吸光度的变化成正比。
当反应到一定时间时，吸光度不再发生变化，我们称这一点为反应终点。
在终点法实验中，用以知浓度的标准液与待测标本同时测定，通过待测样品的吸光度（A样）与标准品吸光度（A标）的比较，根据朗-比定律，可以计算出待测样品的浓度值（c样），计算公式如下：C测定＝A样品／A标准＊C 标准*酶促反应的动力学酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素。
其基本原理为一数学公式，称为米氏公式：v=Vmax*[S]/(Km+[S])式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[S]为底物浓度，v为酶反应速度。
Km是当酶反应速度达最大反应速度半时的底物浓度，是酶的重要的特征性物理常数，只与酶的性质有关，而与浓度无关。
米氏公式表明了底物浓度与酶反应速度间的定量关系，底物浓度是决定反应速度最重要的因素之一。
加入样品开始反应后，有几秒至几分钟的延滞期（其长短视所测对象及实验条件而定）0－T1，随后即为底物或产物变化与时间成直线的线性期T1－T2，速度是恒定的，即为酶促反应的初速度。
在此期间，因[S]很高，下降量甚微，反应速度不受[S]的影响，故此时的反应为零级反应，（线性反应时间的长短也与所测对象及实验条件有关）。
两点法、终点法、速率法
什么叫两点法.终点法.速度法? 【1 】两点法：测定酶反响开端后某一时光内(t1到t2)产品或底物浓度的总变更量以求取酶反响初速度的办法.终点法：经由过程测定酶反响开端到反响达到均衡时产品或底物浓度总变更量,以求出酶活气的办法,亦称均衡法.速度法：是指中断测定(每15秒~1分钟监测一次)酶反响进程中某一反响产品或底物的浓度随时光的变更来求出酶反响的初速度的办法,即中断监测法.一.经常运用生化检测项目剖析办法举例1．终点法检测经常运用的有总胆红素（氧化法或重氮法）.联合胆红素（氧化法或重氮法）.血清总蛋白（双缩脲法）.血清白蛋白（溴甲酚氯法）.总胆汁酸（酶法）.葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）.尿酸（尿酸酶法）.总胆固醇（胆固醇氧化酶法）.甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）.高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）.钙（偶氮砷Ⅲ法）.磷（紫外法）.镁（二甲苯胺蓝法）等.以上项目中,除钙.磷和镁根本上还运用单试剂方法剖析因而采取一点终点法外,其它测定项目都可运用双试剂故能选用两点终点法,包含总蛋白.白蛋白测定均已有双试剂可用.2．固准时光法苦味酸法测定肌酐采取此法.（两点法）3．中断监测法对于酶活性测定一般应选用中断监测法,如丙氨酸氨基转移酶.天冬氨酸氨基转移酶.乳酸脱氢酶.碱性磷酸酶.γ谷氨氨酰基转移酶.淀粉酶和肌酸激酶等.一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖.脲酶偶联法测定尿素等,也可用中断监测法.4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反响的项目,多半属免疫比浊法,载脂蛋白.免疫球蛋白.补体.抗"O".类风湿因子,以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白.联合珠蛋白.转铁蛋白等均可用此法.二.剖析参数设置剖析仪的一些通用操纵步调如取样.冲洗.吸光度检测.数据处理等,其程序均已经固化在存储器里,用户不克不及修正.各类测定项目标剖析参数（analysisparamete）大部分也已设计好,存于磁盘中,供用户运用;今朝大多半生化剖析仪为凋谢式,用户可以更改这些参数.生化剖析仪一般别的留一些检测项目标空白通道,由用户本身设定剖析参数.是以必须懂得各参数的确实意义.一.剖析参数介绍（一）必选剖析参数这类参数是剖析仪检测的前提前提,没有这些参数无法进行检测.1．实验名称实验名称（test code）是指测定项目标标示符,常以项目标英文缩写来暗示. 2．办法类型（也称反响模式）办法类型（assay）有终点法.两点法.中断监测法等,依据被检物资的检测办法道理选择个中一种反响类型.3．反响温度一般有30℃.37℃可供选择,平日固定为37℃.4．主波长主波长（primary wavelength）是指定一个与被测物资反响产品的光接收有关的波长.5．次波长次波长（secondary wavelength）是在运用双波长时,要指定一个与主波长.干扰物资光接收有关的波长.6．反响偏向反响偏向（response direction）有正向反响和负向反响两种,吸光度增长为正向反响,吸光度降低为负向反响.7．样品量样品量（sampling volum）一般是2μl～35μl,以0.1μl步进,个体剖析仪起码能达到1.6μl.可设置常量.减量和增量.8．第一试剂量第一试剂量（first regengt volum）一般是20～300μl,以1μl步进.9．第二试剂量第二试剂量（second regengt volum）一般也是20～300μl,以1μl步进.10．总反响容量总反响容量（total reacting volum）在不合的剖析仪有一个不合的划定规模,一般是180～350μl,个体仪器能削减至120μl.总反响容量太少无法进行吸光度测定.11．孵育时光孵育时光（incubate time）在终点法是样品与试剂混匀开端至反响终点为止的时光,在两点法是第一个吸光度选择点开端至第二个吸光度选择点为止的时光.12．延迟时光延迟时光（delay time）在中断监测法中样品与反响试剂（第二试剂）混匀开端至中断监测期第一个吸光度选择点之间的时光.13．中断监测时光中断监测时光（continuous monitoring time）在延迟时光之后即开端,一般为60～120s,很多于4个吸光度检测点（3个吸光度变更值）.14．校准液个数及浓度校准曲线线性好并经由过程坐标零点的,可采取一个校准液（calibrator）;线性好但不经由过程坐标零点,应运用两个校准液;对于校准曲线呈非线性者,必须运用两个以上校准液.每一个校准液都要有一个适合的浓度.15．校准K值或理论K值经由过程校准得到的K值为校准K值（calibrate coefficient）或由盘算得出的K值为理论K值.16．线性规模即办法的线性规模（linearity range）,超出此规模应增长样品量或削减样品量重测.与试剂/样品比值有关.17．小数点位数检测成果的小数点位数（decimal point digit）.（二）备选剖析参数这类剖析参数与检测成果的精确性有关,一般来说不设置这类剖析参数,剖析仪也能检测出成果,但若样品中待测物浓度太高级,检测成果可能不精确.1．样品预稀释设置样品量.稀释剂量和稀释后样品量三个数值,即可在剖析前主动对样品进行高倍稀释.2．底物耗尽值底物耗尽值（substrate exhaust limit）在负反响的酶活性测定中,可设置此参数,以划定一个吸光度降低限.若低于此限时底物已太少,缺少以保持零级反响而导致检测成果不精确.3．前区检讨免疫比浊法中运用,以断定是否有抗原多余.将终点法最后两个吸光度值的不同（ΔA）设置一个限值,假如后一点的吸光度比前一点低,暗示已有抗原多余,应稀释样品后重测.4．试剂空白吸光度规模超出此设定规模暗示试剂已演变,应改换及格试剂.5．试剂空白速度中断监测法中运用,是试剂本身在监测进程中没有化学反响时的变更速度. 6．办法学抵偿系数用于校准不合剖析办法间测定成果的一致性,有斜率和截距两个参数. 7．参考值规模对超出此规模的测定成果,仪器会打印出提醒.（三）某些参数的特别意义1．最小样品量最小样品量是指剖析仪进样针能在划定的误差规模内汲取的最小样品量.一般剖析仪的最小样品量是2μl,今朝也有小至1.6μl的.在样品含高浓度代谢产品或高活性酶浓度的情形下往往需采取剖析仪的最小样品量作为减量参数,从而使剖析仪检测规模（与线性规模不合）的上限得以扩大.2．最大试剂量办法敏锐度很高而线性上限低的检测项目,如血清白蛋白的溴甲酚氯法测定,以往手工法操纵时样品量10μl,试剂量4ml,如许试剂量/样品量比例（R/S）为200,线性上限则为60g/L.此法移植到剖析仪上后,R/S却很难达到200,致使线性上限变低.是以对这类检测项目最大试剂量异常重要.3．弹性速度在酶活性测定中,当酶活性太高,在中断监测期中已不呈线性反响时,有些仪器具有弹性速度（flexrate）功效,能主动选择反响曲线上中断监测期中仍呈线性的吸光度数据盘算成果,使酶活性测定的线性规模得以扩大.如AST可从1000U/L扩大至4000U/L,从而削减稀释及重测次数.降低成本.4．试剂空白速度当样品中消失胆红素时,胆红素对碱性苦味酸速度法或两点法测定肌酐有负干扰.因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光接收,并且胆红素在碱性情形中可被氧化改变,因而在肌酐反响进程中胆红素的光接收呈降低趋势.若在参加第一试剂后一段时光内设置试剂空白速度,因为此段中苦味酸尚未与肌酐反响,而胆红素在第一试剂的碱性情形中已同样被氧化改变,因而以第二试剂参加后的速度变更,减去试剂空白速度变更,即可清除胆红素的负干扰,见图7-8.二.单波长和双波长方法（一）概念采取一个波长检测物资的光接收强度的方法称为单波长(mono-wavelength)方法.当反响液中含有一种组分,或在混杂反响液中待测组分的接收峰与其它共存物资的接收波长无重叠时,可以选用.在吸光度检测中,运用一个主波长和一个次波长的称双波长方法.当反响液中消失干扰物的较大接收.从而影响测定成果的精确性时,采取双波长方法更好.（二）双波长的感化双波长(di-wavelength)测定长处是①清除噪音干扰;②削减杂散光影响;③削减样品本身光接收的干扰.从光源,到比色杯.单色器.检测器的全部光路体系中,均消失着随时光产生变更的不稳固的检测旌旗灯号,即噪音,而双波长检测是同时进行的,两种波长检测产生的噪音根本上雷同,因而能清除噪音干扰.当样品中消失非化学反响的干扰物如甘油三酯.血红蛋白.胆红素等时,会产生非特异性的光接收,而干扰测定成果的精确性.采取双波长方法测定可以部分清除这类干扰,进步检测的精确性.（三）次波长的肯定办法当被测物的主波长肯定之后,再选择次波长.如依据甘油三酯等干扰物接收光谱特点,选择次波长,使干扰物在主.次波长处有尽可能雷同的光接收值,而被测物在主.次波长处的光接收值应有较大的差别.一般来说,次波长应大于主波长100nm.以主波长与次波长吸光度差来盘算成果.（四）双波长的具体运用对于某些反响速度快且无法设置为两点终点法的剖析项目,尤其是单试剂剖析中,可以运用双波长的方法来部分清除样品本身的光接收干扰.今朝用单试剂法测定的项目运用双波长的为血清总蛋白（双缩脲法）主波长500nm,次波长576nm;血清白蛋白（溴甲酚氯法）主.次波长分离为600和700nm;钙（偶氮砷Ⅲ法）主.次波长分离为 660.770nm;磷（紫外比色法）主.次波长为340.405nm,镁（二甲苯胺蓝法）主.次波长为505和 600nm.三.单试剂和双试剂方法反响进程中只加一次试剂称单试剂方法,加两次试剂便为双试剂方法.今朝的生化剖析仪大多可用双试剂方法剖析,其长处是：①可进步试剂的稳固性,多半双试剂混杂成单一工作试剂时,其稳准时光缩短;②能设置两点终点法,来清除来自样品本身的光接收干扰;③在某些项目检测时能清除非特异性化学反响的干扰.如血清ALT测定,血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的指导酶（乳酸脱氢酶）起反响,使成果偏高.若先参加缺少α-酮戊二酸的第一试剂,使其它酮酸与指导酶反响之后再参加含有α-酮戊二酸的第二试剂,启动真正的ALT 酶促反响生成丙酮酸,而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反响消费的NAD＋能真正反应ALT的活性,从而清除以上副反响的影响.四.测定进程的主动监测各类主动生化剖析仪或多或少都具有对测定进程进行各类监测的功效,以便在没有人"监视"化学反响的情形下进步检测的精确性.高级剖析仪的监测功效更强.1．试剂空白监测每种试剂都有必定的空白吸光度规模,试剂空白吸光度的改变往往提醒着该试剂的演变：如运用Trinder反响为道理的检测试剂会因酚被氧化为醌而变成红色;碱性磷酸酶.γ－谷氨酰转移酶.淀粉酶等检测试剂会因基质分化出硝基酚或硝基苯胺而变黄;有些试剂久置后变污浊.这些情形均可使空白吸光度升高.丙氨酸氨基转移酶.天冬氨酸氨基转移酶等负反响检测项目,其试剂在放置进程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而降低等.试剂空白的测定办法有两种：①每瓶试剂在运用前经由过程对试剂空白校准来肯定试剂空白吸光度,这种方法实用于先取样品后加试剂的剖析仪.②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度,实用于先加试剂后取样品的剖析仪.2．试剂空白变更速度监测一些酶试剂在反响温度下不稳固,其空白吸光度可跟着时光逐渐产生变更,这种变更的重要原因与对象酶或辅酶的纯度有关,且因试剂的构成和临盆厂家的不合而不合.这种变更会影响测定成果的精确性,一般使成果偏高.假如设置此项监测,剖析仪在成果盘算时会主动减去试剂空白变更速度.在以监测NAD（P）H削减为指导反响的酶活性测定中,空白速度可监测并清除由NADH自身氧化所造成的吸光度降低;在色素原为底物的酶活性测定中,空白速度可监测并清除底物自成分化造成的吸光度升高.有关空白速度监测在胆红素对碱性苦味酸速度法测定肌酐负干扰清除中的感化,已如前述.3．样品信息监测因为样品的溶血.脂浊.黄疸会对测定成果产生非化学反响的干扰.依据溶血.脂浊.黄疸的光谱接收特点,用双波长或多波长检测其性质和程度,一般是测定样品在600nm／570nm.700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小来分离断定样品溶血.脂浊和黄疸程度.然后在成果盘算时主动减去这部分干扰,这将有利于进步剖析成果的靠得住性.4．成果靠得住性监测（1）终点监测：终点法测定要断定所选的测光点是否到达终点或均衡点.一些剖析仪在所选终点后再选一个测光点,比较这两点吸光度的差别来断定反响是否到达终点.（2）线性期监测：中断监测法选择时光－吸光度反响曲线上的线性期来盘算酶活性或被测物浓度,是以仪器要肯定此中断监测期是否呈线性.其监测办法为①将中断监测到的各吸光度值进行线性回归,盘算出各点的方差,依据方差值的大小来断定是否呈线性;②取中断监测期开端若干点的变更速度与中断监测期最后若干点的变更速度进行比较,来断定是否为线性期. 5．底物消费的监测在中断监测法测定酶活性时,假如在监测期内吸光度上升或降低超出其底物耗尽值,则解释该样品酶活性异常高,底物将被耗尽,监测期的吸光度将偏离线性,使测定成果不成靠.此时不打印成果或打印成果同时也打印出底物耗尽提醒,该样品应稀释必定的倍数从新测定.此监测对于采取负反响剖析酶活性的办法甚为重要.见图7-96．办法线性规模监测每种待测物剖析都有一个可测定的浓度或活性规模,样品成果若超出此规模,剖析仪将显示测定成果超出线性规模的提醒,多半剖析仪会主动将样品减量或增量从新测定.一.剖析办法分类（一）终点法被测物资在反响进程中完整被改变成产品,即达到反响终点,依据终点吸光度的大小求出被测物浓度,称为终点法（end essay）.现实上被测物并没有完整被改变,而只是与产品达到一个动态的化学均衡,是以该法称为均衡法更为适当.从时光-吸光度曲线来看,到达反响终点或均衡点时,吸光度将不再变更.剖析仪平日在反响终点邻近中断选择两个吸光度值,求出其平均值盘算成果,并可依据两点的吸光度差来断定反响是否到达反响终点.终点法参数设置简略,反响时光一般较长,周详度较好.终点时光的肯定：①依据时光-吸光度曲线来肯定,如Trinder反响测定尿酸,反响曲线上3～5min时其吸光度已趋势稳固,因而可将5min作为反响终点.②依据被测物反响终点,联合干扰物的反响情形来肯定,如在血清白蛋白的溴甲酚绿法测定中,白蛋白与溴甲酚绿在10s内很快完成反响,之后α球蛋白和β球蛋白与溴甲酚绿产生 "慢反响",使反响曲线上吸光度在10s后仍中断迟缓上升,中断约达10min,是以终点时光应采取10～30s,而不该选择10min.1．一点终点法：在反响到达终点,即在时光-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值,这种办法称为一点终点法（one point end essay）,其反响曲线见图7-3.其检测成果的盘算公式是：待测物浓度CU=（待测吸光度AU－试剂空白吸光度AB）×K. K为校准系数,详见第五节二操纵办法.2．两点终点法：在被测物反响或指导反响尚未开端时,选择第一个吸光度,在反响到达终点或均衡时选择第二个吸光度,此两点吸光度之差用于盘算成果,称为两点终点法（two point end essay）,其反响曲线见图7-4.盘算公式为CU=（待测吸光度A2－待测吸光度A1）×K.该法能有用地清除溶血（hemolysis）.黄疸（icterus）和脂浊（lipo-turbid）等样品本身光接收（见图7-5）造成的干扰.在单试剂剖析参加试剂的初期.或双试剂剖析中第二试剂参加之初,若指导反响吸光度尚未明显变更,则可在此时选择第一个吸光度,在指导反响终点时选择第二个吸光度,从而设置成两点终点法.但指导反响初期吸光度无明显变更的化学反响较少,如单试剂方法测定总蛋白.白蛋白.钙.磷.镁等的终点法剖析项目,及双试剂方法测定葡萄糖.总胆固醇.甘油三酯等的终点法剖析项目,因反响初期吸光度已有明显变更,因而均难以用上述方法设置两点终点法.但在双试剂剖析中,假如将第一吸光度选择在第二试剂参加前,此时指导反响一般尚未开端,则能轻易设置两点终点法.在此要留意必须将两次读吸光度时不合比色液体积进行校订.今朝全主动剖析仪均具有此主动校订功效,不必手工进行校订.（二）固准时光法指在时光-吸光度曲线上选择两个测光点,此两点既非反响初始吸光度亦非终点吸光度,这两点的吸光度差值用于成果盘算,称为固准时光法（fixed-time essay）,反响曲线见图7-6.其盘算公式与两点终点法雷同,为CU=(A2-A1)×K.有时也称此法为两点法.该剖析办法有助于解决某些反响的非特异性问题.例如：苦味酸法测定肌酐,反响的最初30s 内,血清中快反响干扰物（如微生物.丙酮酸.乙酰乙酸等）能与碱性苦味酸反响;在第二个30s 时碱性苦味酸重要与肌酐反响,且此段时光－吸光度曲线的线性较好（故也可用中断监测法测定肌酐）;在80～120s及其今后,碱性苦味可与蛋白质以及其它慢反响干扰物反响.如许选用反响的第二个30s为测准时光,既防止了快反响物资的干扰,也防止了慢反响物资的影响,使肌酐浓度与吸光度变更呈优越的线性关系,有利于进步剖析的特异性和精确度.（三）中断监测法中断监测法（continuous monitoring essay）又称速度法（rate essay）,是在测定酶活性或用酶法测定代谢产品时,中断拔取时光-吸光度曲线中线性期的吸光度值,并以此线性期的单位吸光度变更值（ΔA/min）盘算成果,见图7-7A和B.所谓线性期就是各点吸光度差值相等,如图7-7C所示,图中δ1及δ5值偏小,而δ2＝δ3＝δ4,故A1点至A4点属线性段.此线性期对底物来说属零级反响,时代的ΔA/min即为酶促反响的初速度,其大小与被测酶活性成正比.中断监测法的长处等于可以肯定线性期并盘算ΔA/min,依据此值再精确地盘算酶活性,因而使主动生化剖析仪在酶活性测定方面明显地优于手工法.中断监测法也可用于测定呈线性反响的代谢物浓度,一般是某些基于酶法测定的代谢物.酶活性（U/L）＝ΔA/min×理论（或校准）K 值,代谢物浓度CU=ΔA/min×校准K值.关于理论K值和校准K值论述如下：1．理论K值：多用于酶活性测定中,因酶活性尚无公认的校准品可用,因而依据酶活性的国际单位界说得出酶活性的盘算公式为：酶活性(U/L)=ΔA/min× ,将此式中以K来暗示,此K值可经由过程对已知值即指导物资的毫摩尔消光系数（ε）.反响液总容量（TV）.样品容量（SV）和比色杯光径（d）盘算后得出,即为理论K值,可作为剖析参数输入到剖析仪中.采取理论K值的前提应该是样品和试剂的加量精确.比色杯光径精确.温度掌握精确以及波长精确等.但事实上因为各型剖析仪在打针器容积步进电机精度.滤光片带宽等方面的差别,可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的误差.温度的影响有时也异常大,因为反响盘是半吐露的,是以跟着较冷试剂的参加,反响盘中的温度会逐渐降低,尽管开端测准时反响盘温度已升到37°C,但在某一项目测定进程的开端阶段,温度可能达不到37°C ,甚至仅35°C阁下,且反响进程中仍有可能高低摇动,这对于酶学反响来说影响是很大的.如采取37°C时的理论K值,将会使测定成果降低,温度的摇动还会使得成果的反复性降低.当然,若试剂在参加反响杯前经试剂臂内加热装配预温,则根本不影响反响盘温度.因为摩尔吸光系数受比色杯光径.波长.带宽以及加样体系的精确性等的影响,书本上或试剂厂家供给的理论摩尔吸光系数可能与现实所用剖析仪所测的不合,因而有须要获得现实的摩尔吸光系数,然后用来盘算的K值称为实测K值.（1）NADH（NADPH）摩尔吸光系数的测定：NADH（NADPH）没有尺度纯成品,并且配成溶液后稳固性又较差,不克不及直接用NADH 或NADPH尺度液来校订仪器,须经由过程有NAD+(NADP+)介入的反响门路.用已糖激酶 (HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)办法测定葡萄糖时,葡萄糖的消费与NADH的生成呈等摩尔关系.葡萄糖有尺度纯成品,又有国度同意文号的葡葡糖尺度液.是以,依据公式A=εbC,已知比色杯光径b和葡萄糖尺度液浓度,测得葡萄糖尺度管的吸光度A后即可盘算出NADH（NADPH）的摩尔吸光系数ε为 A/bC.假设,葡萄糖尺度液浓度为1Ommo1/L(0.01mol/L),尺度液参加量为3.5μL,酶试剂参加量为335μL,比色杯光径为0.7cm,在340nm测得吸光度为0.465,则实测NADH摩尔吸光系数= ＝6424,即在此台剖析仪上340nm波长处测得NADH（NADPH）的摩尔吸光系数为6424,而理论上NADH （NADPH）的ε为6220.（2）"色素原"酶促产品在405nm波长摩尔吸光系数的测定：有很多酶底物为人工合成的"色素原"底物,其本身无色,经酶感化后释放出有色的反响产品,在405nm波长具有接收峰.最经常运用色素原底物及其产品为: ALP测定以磷酸对硝基苯酚 (4-Nitrophenyl phosphate,4-NPP)为底物,经酶感化后释放出黄色的对硝基苯酚(4-Nitrophenol,4-NP),GGT测定以γ-L-谷氨酰对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或γ-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)为底物,经酶感化后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroaniline,4-NA)或对硝基-5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid, ANBA).对硝基苯酚的摩尔吸光系数为18700(405nm),对硝基苯胺的摩尔吸光系数为9870(405nm),对硝基-5-氨基苯甲酸的摩尔吸光系数为9490(405nm).下面是对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定办法.试剂：① 4-NP尺度储存液(1Ommo1/L).② 4-NP尺度运用液(2.5mmo1/L,以0.84mol/L AMP 缓冲液稀释而成).③底物缓冲液(l5mmol/L 4-NPP配于0.84mol/L AMP-HCL缓冲液中,37℃,pH l0.09土0.02).测定办法：4-NP尺度液参加量为5μL,底物缓冲液参加量为350μL,波长405nm,光径0.7cm,温度37℃,测定得吸光度为A1;另用蒸馏水代替4-NP尺度液,按上述办法测定其吸光度为A2,4-NP尺度液吸光度ΔA= A1- A2,若测得ΔA为0.460,则实测4-NP摩尔吸光系数＝＝186622．校准K值酶活性校准品经校准操纵后由剖析仪主动盘算得出.在进行酶学测准时,假如剖析前提的变更如温度.样品试剂加量和吸光度检测误差可一致程度地影响校准物和待测样品,则运用校准品能进行抵偿.一般来说以运用校准K值为好,但必须有两个先决前提：①必须运用配套的试剂;②必须运用配套的高质量的校准品,该校准品应具有溯源性.运用与该剖。
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终点法速率法二点法
* 终点法具有不同分子结构的物质，对光谱有选择吸收的特性，吸收光谱的可在可见光区域也可在紫外或红外光区域。
若利用物质对可见光谱的选择吸收作定量分析，此时主要表现为颜色的变化，称为比色分析法；若利用物质对紫外或红外光区域的选择吸收作定量分析，称为吸收分光光度法。
比色分析法和吸收分光光度法灵敏度高，选择性好，操作方便，已广泛用于临床生化分析，临床诊断试剂盒基本上都采用这二种方法。
其基本原理是被测物的吸光特性符合Lambert-Beer定律：
Ａ=abc
其中Ａ为吸光度，a为吸光系数或消光系数；b为光径，即光线通过的溶液的厚度，与比色皿有关，c为吸光物质在溶液中的浓度。
在选定了试剂和仪器后，式中a和b是固定的，所以溶液中待测物质的浓度与溶液吸光度的变化成正比。
当反应到一定时间时，吸光度不再发生变化，我们称这一点为反应终点。
在终点法实验中，用以知浓度的标准液与待测标本同时测定，通过待测样品的吸光度（A样）与标准品吸光度（A标）的比较，根据朗-比定律，可以计算出待测样品的浓度值（c样），计算公式如下：C测定＝A样品／A标准＊C标准* 酶促反应的动力学
酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素。
其基本原理为一数学公式，称为米氏公
式：v=Vmax*[S]/(Km+[S])
式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[S]为底物浓度，v为酶反应速度。
Km是当酶反应速度达最大反应速度半时的底物浓度，是酶的重要的特征性物理常数，只与酶的性质有关，而与浓度无关。
米氏公式表明了底物浓度与酶反应速度间的定量关系，底物浓度是决定反应速度最重要的因素之一。
加入样品开始反应后，有几秒至几分钟的延滞期（其长短视所测对象及实验条件而定）0－T1，随后即为底物或产物变化与时间成直线的线性期T1－T2，速度是恒定的，即为酶促反应的初速度。
在此期间，因[S]很高，下降量甚微，反应速度不受[S]的影响，故此时的反应为零级反应，（线性反应时间的长短也与所测对象及实验条件有关）。
最后因多种因素，反应进入混合反应期。
酶测定的动力学方法：酶活性测定法是酶浓度的间接测定法。
只有当酶所催化的反应速度与酶浓度成正比而不受其他因素影响时，才能根据酶所催化的反应快慢来表示酶浓度的大小，这就是所谓的酶活性的最适条件，只有在此条件下测得酶活的大小才能真实代表酶含量的多少。
根据米氏公式，为使酶反应初速度基本上接近Vmax,要求底物浓度[S]》Km，此时v与[E]成正比，[E]表示酶浓度。
此时的米氏公式可变为：v=k[E]=Vmax,这就是动力学测定酶浓度的依据所在。
* 二点法（两点固定时间法）
先让酶与底物固定作用一段时间后，再测定底物的消耗量或产物的生成量。
用二点法时，同样应选用酶反应的线性期进行测定，同时还应确定该法能测定酶活性的最高限度，对于超过此限的样品，应采用缩短反应时间或减少样品用量的办法进行测定。
但二点法的缺点是无法了解整个反应过程是否在线性期。
* 速率法在酶反应的最适条件下，连续监测不同反应时间内底物或产物含量的变化，从而计算出酶反应的初速度，即酶活性的高低。
通过酶偶联体系测定酶活性是目前最为广泛应用的方法，即在反应体系中加入其他酶与被测酶偶联起来，常把外加的最后一个偶联酶称为指示酶，其他的外加酶为辅助酶。
使用最多的是需要辅酶Ⅰ、Ⅱ的氧化还原酶类，因为还原型辅酶Ⅰ（NADH）及还原型辅酶Ⅱ（NADPH）在340nm有强烈的光吸收，因而可通过测量340nm处吸光度值的变化来监测NADH及NAD＋的含量变化，从而获得测定酶的酶活。
另一种连续监测法是用“色素原”底物，即底物本身无色，经酶作用后成为有色物，从而可通过监测生成物含量的变化间接得到测定酶的酶活。
在前一种方法中，如广泛应用的ALT（GPT）、AST（GOT）的速率法测定，后一种方法中有ALP的AMP法测定。