终点法 速率法 二点法

终点法速率法二点法

* 终点法具有不同分子结构的物质，对光谱有选择吸收的特性，吸收光谱的可在可见光区域也可在紫外或红外光区域。若利用物质对可见光谱的选择吸收作定量分析，此时主要表现为颜色的变化，称为比色分析法；若利用物质对紫外或红外光区域的选择吸收作定量分析，称为吸收分光光度法。比色分析法和吸收分光光度法灵敏度高，选择性好，操作方便，已广泛用于临床生化分析，临床诊断试剂盒基本上都采用这二种方法。

其基本原理是被测物的吸光特性符合Lambert-Beer定律：

Ａ=abc

其中Ａ为吸光度，a为吸光系数或消光系数；b为光径，即光线通过的溶液的厚度，与比色皿有关，c为吸光物质在溶液中的浓度。

在选定了试剂和仪器后，式中a和b是固定的，所以溶液中待测物质的浓度与溶液吸光度的变化成正比。当反应到一定时间时，吸光度不再发生变化，我们称这一点为反应终点。

在终点法实验中，用以知浓度的标准液与待测标本同时测定，通过待测样品的吸光度（A样）与标准品吸光度（A标）的比较，根据朗-比定律，可以计算出待测样品的浓度值（c样），计算公式如下：C测定＝A样品／A标准＊C标准* 酶促反应的动力学

酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素。其基本原理为一数学公式，称为米氏公

式：v=Vmax*[S]/(Km+[S])

式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[S]为底物浓度，v为酶反应速度。Km是当酶反应速度达最大反应速度半时的底物浓度，是酶的重要的特征性物理常数，只与酶的性质有关，而与浓度无关。

米氏公式表明了底物浓度与酶反应速度间的定量关系，底物浓度是决定反应速度最重要的因素之一。

加入样品开始反应后，有几秒至几分钟的延滞期（其长短视所测对象及实验条件而定）0－T1，随后即为底物或产物变化与时间成直线的线性期T1－T2，速度是恒定的，即为酶促反应的初速度。在此期间，因[S]很高，下降量甚微，反应速度不受[S]的影响，故此时的反应为零级反应，（线性反应时间的长短也与所测对象及实验条件有关）。最后因多种因素，反应进入混合反应期。

酶测定的动力学方法：酶活性测定法是酶浓度的间接测定法。只有当酶所催化的反应速度与酶浓度成正比而不受其他因素影响时，才能根据酶所催化的反应快慢来表示酶浓度的大小，这就是所谓的酶活性的最适条件，只有在此条件下测得酶活的大小才能真实代表酶含量的多少。根据米氏公式，为使酶反应初速度基本上接近Vmax,要求底物浓度[S]》Km，此时v与[E]成正比，[E]表示酶浓度。此时的米氏公式可变为：v=k[E]=Vmax,这就是动力学测定酶浓度的依据所在。

* 二点法（两点固定时间法）

先让酶与底物固定作用一段时间后，再测定底物的消耗量或产物的生成量。用二点法时，同样应选用酶反应的线性期进行测定，同时还应确定该法能测定酶活性的最高限度，对于超过此限的样品，应采用缩短反应时间或减少样品用量的办法进行测定。

但二点法的缺点是无法了解整个反应过程是否在线性期。

* 速率法在酶反应的最适条件下，连续监测不同反应时间内底物或产物含量的变化，从而计算出酶反应的初速度，即酶活性的高低。

通过酶偶联体系测定酶活性是目前最为广泛应用的方法，即在反应体系中加入其他酶与被测酶偶联起来，常把外加的最后一个偶联酶称为指示酶，其他的外加酶为辅助酶。使用最多的是需要辅酶Ⅰ、Ⅱ的氧化还原酶类，因为还原型辅酶Ⅰ（NADH）及还原型辅酶Ⅱ（NADPH）在340nm有强烈的光吸收，因而可通过测量340nm处吸光度值的变化来监测NADH及NAD＋的含量变化，从而获得测定酶的酶活。

另一种连续监测法是用“色素原”底物，即底物本身无色，经酶作用后成为有色物，从而可通过监测生成物含量的变化间接得到测定酶的酶活。

在前一种方法中，如广泛应用的ALT（GPT）、AST（GOT）的速率法测定，后一种方法中有ALP的AMP法测定。