第三章毛细管电泳法ppt课件

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二、毛细管电泳的特点
CE是现代微柱分离和经典电泳技术有机结合的产物,具有较 HPLC和平板凝胶电泳更多的优点:
(1)高效:每米理论塔扳数低则十几万,高则几百万甚 至上千万;
(2)快速:可在十几分钟甚至几十秒内完成分离;
(3)低样品消耗:只需纳升甚至皮升级样品量;
(4)低成本分析:只需低廉的分离毛细管和少量的运行
式中, eo为f 电渗速度;为eof 电渗淌度(EOF mobility); 为双电
层的Zeta电位; 为 缓冲液介电常数;η为电解液粘度;V为所
施加的电压; 为毛l to细t 管总长度。
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在具体实验中,可根据需要选用不同的中性组分作为标 记物(N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲酰胺、苯酚、 丙酮等),测定不同缓冲条件下中性标记物的迁移时间, 按下述公式计算出电渗率:
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第二节 毛细管电泳基础理论
+

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一、电泳流
电泳:在电解质溶液中,位于电场中的带电离子 在电场力的作用下,以不同的速度向其+ 所带电荷
相反的电极方向迁移的现象。

电泳时,不同离子在电场中具有不同的定向迁移 速度,迁移速度与哪些因素有关?
淌度(μ):单位电场下的电泳速度。
与带电离子的移动速度更是直接相关。对于球形分子F’的大小服从Stokes 定律:
F’=6πηrνef
η:缓冲液粘度;r:球形分子的半径;νef:离子在电场中的迁移速度。
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当带电离子以速度ν 在电场中移动时,受到大小相等、方向相反的电场驱 动力和平动摩擦阻力的作用,此时
F=F’
来自百度文库
故:
q·E= 6πηrνef
石英毛细管柱,内壁大约有8.31 mol/m2的硅醇基 (Si-OH),其等电点约为1.5,内充液pH>3时,表 面电离成SiO-,管内壁带负电荷,形成双电层。
在高电场的作用下,带
正电荷的溶液表面及扩
散层向阴极移动,由于
这些阳离子实际上是溶
剂化的,故将引起柱中
的溶液整体向负极移动,
形成电渗流。
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1. CE中电渗流的大小与方向
电渗流的大小可用电渗速度和电渗淌度表示。
(1)电渗流的大小
电渗流的大小与电场强度、Zata电势及缓冲液介电 常数有关,某一电泳体系内电渗流的具体数值可以 用Helmholtz-Smoluchowski 公式计算:
eo fε ltV ot(ε )l(V to)teoEf
则离子在电场中的迁移速度:
ef
qE
6πr
即带电离子的电泳迁移速率(或称电泳淌度) :
μef
ef
E
q
6πr
由此可知,球形带电离子的迁移率,主要取决于自身状态,即与其所带电
量成正比,与其半径及介质粘度成反比。电泳过程中正是利用带电离子电
泳迁移速度或迁移速率的差异来实现分离的。
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二、电渗流
缓冲液;
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(5)高度自动化:CE是目前自动化程度最高的分离分 析方法之一;
(6)洁净:通常用水溶性缓冲液,对人体和环境无害; (7)多分离模式:可根据需要在同一仪器上选用不同的
样品分离模式;
(8)应用范围广:具有“万能”分析的功能和潜力,既 可以分析无机离子、氨基酸、药物等小分子,又可以 分析蛋白质等生物大分子,甚至整个细胞和各种微粒。
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一、毛细管电泳发展历程
1808年,俄国物理学家 Pence 发现电泳现象。
1937年,瑞典Tiselius将蛋白质混合液放在两段缓冲 溶液之间,两端施以电压进行自由溶液电泳,发现样品 的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定,第一次从人血 清提取的蛋白质混合液中分离出白蛋白和α、β、γ球蛋 白,但分离效率低;
第三章 毛细管电泳法
Capillary Electrophoresis
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第一节 毛细管电泳概述 第二节 毛细管电泳基础理论 第三节 毛细管电泳仪 第四节 毛细管电泳类型 第五节 毛细管电泳的应用和进展
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第一节 毛细管电泳概述
毛细管电泳(CE),又称高效毛细管电泳,是近 年来发展最快的高效分离分析技术之一。该技术 是现代微柱分离技术和经典电泳技术结合的产物, 是气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)等常用 分离技术的重要补充,在诸多研究领域得到了人 们广泛的接受和认可。
绝对淌度:在无限稀释溶液中测得的淌度。
有效电泳淌度:在实际溶液中测得的淌度。
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电场强度:与所施加的电压成正比,与两电极间的距离(L)成反比
E=V/L
电场力:在溶液中,电场对带电离子作用力(F)的大小等于带电离子所带 的净电荷(q)与电场强度的乘积:
F=q·E
在电泳迁移过程中,介质粘滞力(F’)必然会阻碍离子的迁移。 粘滞力的大小与离子大小、形状、缓冲液粘度、甚至电泳介质孔径均有关系,
eo f E eoftl dE etld telV ttot
其中,t:中性标记物的迁移时间,ldet为毛细管电泳有效 长度, ltot为毛细管电泳有效长度。
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(2)CE中电渗流的方向
石英毛细管带负电荷,溶液带正电荷,电渗流 流向阴极;
改变电渗流方向的方法:
毛细管改性:表面键合阳离子基团; 加电渗流反转剂: 内充液中加入大量的阳离子表面
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3.CE中电渗流的作用
电渗流的速度一般约等于离子电泳速度的5~7倍; 各种电性粒子在毛细管柱中的迁移速度为:
+
阳离子迁移速度 =电渗流+电泳流,阳离子运动速度快于电渗流; 阴离子迁移速度 =—电渗流–电泳流,阴离子运动速度慢于电渗流; 中性粒子迁移速度 =电渗流,中性粒子运动速度与电渗流一致。
活性剂,将使石英毛细管壁带正电荷,溶液表面带 负电荷。电渗流流向阳极。
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2.CE中电渗流的流形
液相色谱中的溶液流动为层流,抛物线流型,管壁 处流速最慢,管中心处的速度为平均速度的2倍(引 起谱带展宽较大)。
在毛细管电泳中,电荷均匀分布,整体移动,电渗 流的流动为平流,塞式流动(谱带展宽很小),故 柱效较高。
1981年,Jorgenson在75μm毛细管内施加300 V/cm的高强度电场,获得了理论塔板数超过400,000 plates/m的高分离效率,轰动了整个分离界,成为CE 划时代里程碑
1989年,毛细管电泳仪问世。
1989年,第一届CE国际会议的召开,标志着一门新的
分析技术的产生。
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