MLR混合淋巴细胞反应

MLR混合淋巴细胞反应

混合淋巴细胞培养（MLC）或称混合淋巴细胞反应（MLR）常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原（HLA抗原）相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。

一、实验原理

两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLAⅡ类抗原中D和DP抗原（淋巴细胞鉴定的抗原，SD抗原）不同，可相互刺激对方的T细胞发生增殖，此为双向混合淋巴细胞培养（two way MLC）；若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂霉素C（mytomycine C）处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养（one way MLC）。两个个体间HLA抗原差异程度越大，反应越强烈，可通过细胞数量、形态检查或3H-TdR掺入率检测反应细胞的增殖水平。如用经照射的、已知D位点抗原的纯合子分型细胞（Homozygous typing cell，HTC）作为刺激细胞，则可检测待检者的D位点抗原型别。若待检者抗原与标准HLA-D抗原相同，MLC不发生增殖，此为HLA-D抗原阴性分型法。EB病毒转化的B淋巴母细胞表达高水平的HLAⅡ类抗原，常作为单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞。

二、实验方法

这里介绍多年前做过的MLR的方法，绝对正宗，传统的标准方法：

1、方法

分别取C57BL（H-2b）和Balb/C（H-2d）小鼠脾脏制备细胞悬液，Balb/C小鼠脾细胞悬液（2X107/ml）加丝裂霉素C（50微克/ml）处理，37oC，30min，培养液洗涤3次后用5%NBS培养液配制细胞悬液（5X106/ml），作为刺激细胞，加入96孔培养板，5X105/0.1ml/孔；再加入C57BL脾细胞悬液，为反应细胞，也是5X105/0.1ml/孔；另设单独刺激细胞孔和单独反应细胞孔，均为三复孔。CO2孵葙培养5天，加3H-TdR 0.5 微居/孔，再培养12~16h

后，收集细胞于玻璃纤维滤纸上，干燥后用液闪法测定cpm值，根据以下公式计算刺激指数（SI）：

SI＝（混合反应细胞孔cpm－刺激细胞孔cpm值）/ 反应细胞孔cpm值

2、结果

Balb/C小鼠6-8周龄脾细胞对C57BL小鼠脾细胞的MLR的SI为：13.5

出生后0～2天去胸腺的Balb/C小鼠，6-8周龄的脾细胞的MLR的SI：3.0

三、注意事项

1、注意无菌操作。

2、刺激细胞接受照射剂量要准确，使细胞暂时存活，但失去增殖的能力。

3、可用Raji或Daudi细胞作为刺激细胞，也可将不同的细胞混合作为刺激细胞。