硕士研究生分子生物学实验讲义

硕士研究生分子生物学实验讲义
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ﻩ
分子生物学实验讲义
(硕士研究生试用)
山西医科大学
基础医学院
生物化学与分子生物学实验室
2010.6
实验一动物组织蛋白质的提取
【目的要求】
1．掌握动物组织蛋白质的提取方法。

2.了解动物组织蛋白质提取的原理。

【实验原理】
由于蛋白质种类很多,性质上的差异很大，即或是同类蛋白质,因选用材料不同,使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。

但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中,少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。

因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。

蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。

故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。

温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。

提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用,将细胞内蛋白质提取出来,并与其它不需要的物质分开。

但动物材料中的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液(如血浆、消化液等)中，可以不必经过提取直接进行分离。

蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。

蛋白质经细胞破碎后,用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来,再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。

ﻫ【试剂器材】
1．实验小鼠
2．0．9%NaCｌ
3．动物组织蛋白裂解缓冲液
Trｉs 5０mＭ
ＮaCl 15０mＭ
EＤTA 0.５mM
DTT1mM
Triｔｏn X－100 1%
去氧胆酸钠0.5%
SDS０.1%
4．ＰMSF/异丙醇储备液10０ｍM（１74mg/１0ml)于-20℃储存
5．-2０℃储存的冰块
【操作步骤】
1.颈椎脱臼处死小鼠,75%酒精擦拭皮肤,剪开腹部,剪切肝脏组织，称取0.6g，置于含
预冷0.9%NaＣl(6ｍL）的平皿中。

2.在平皿中剪碎肝脏组织，并转移到匀浆器中。

3.在预冷的裂解缓冲液中添加PMSF/异丙醇储备液(20µL/2mL)。

4.迅速将2mＬ预冷的裂解缓冲液加入匀浆器中，冰浴条件下充分研磨。

5.将组织研磨液转移到１.5mL的离心管中，于4℃离心（1 4000rpm，１0mｉn）。

6.离心完毕吸取上清液转移至一新的1.5ｍｌ离心管中,即为组织蛋白粗提取液。

7.所获蛋白提取液可保存于-20℃用于后续实验或用考马斯亮蓝等方法进行蛋白质浓
度测定后保存备用。

【注意事项】
在整个制备过程中使组织始终处于冰浴状态，以防蛋白质的降解。

ﻫ
实验二蛋白质的定量(Bradford法)
【目的要求】
掌握考马斯亮蓝(Coｏmassｉe BriｌliaｎｔＢlue)法测定蛋白质含量的原理和方法。

【实验原理】
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度是利用蛋白质与染料结合的原理，定量测定微量蛋白质浓度，具有快速、灵敏的特点。

考马斯亮蓝Ｇ-2５0存在两种不同的颜色形式:红色和蓝色。

当染料与蛋白质结合后由红色转变成蓝色形式。

蛋白质与G2５0的结合是通过范德华力实现的，并且在一定浓度范围内二者的结合显色符合朗伯－比尔定律。

结合后的产物在595ｎm处具有最大吸收峰，通过对溶液的光吸收测定可获得与其结合蛋白质的量。

【试剂器材】
1．考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G-250 1０0mg溶于２5mＬ甲醇中，加入800 mL蒸馏水,再加入10０mＬ85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤。

2.标准蛋白质溶液（1mｇ/mL）：牛血清白蛋白100mg,加0．９％NaＣl至10０mL。

3.试管及试管架，吸管。

4.比色计。

【操作步骤】
一、标准曲线的制备:取５支试管，编号，按下表操作
编号1号液２号液3号液4号液５号液
标准蛋白质溶液（mL）0.20．4 0.6 0.8 1.0 （1mg /mL)
0．9％ＮaＣｌ(mL）０．8 0.6 0.40.２－
蛋白质浓度 200 40０６00 8０0 １000
（μg /mL)
另取6支试管，编号为０～5,按下表操作
编号０ 1 ２ 3 4 5
１号液2号液3号液4号液5号液
不同浓度蛋白质溶液(mL)- 0．１0.10．１0.1
0．１
0.9%ＮaCl(mL）０.１- － - -
－
考马斯亮蓝试剂（ｍL） 5 5 5 5 5 5
蛋白质含量（μg)0 ２0 40 6080 10０
混匀各管,室温下静置10分钟，于595ｎm处进行比色。

二、绘制标准曲线:以A 59５nｍ为纵坐标，标准蛋白质含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准
曲线。

三、测定未知样品蛋白质浓度：
测定方法同上，取适量未知样品,使其测定值在标准曲线的直线范围内。

根据所测定的A 值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白质的量,从而计算出未知样品的蛋白质浓595 nm
度。

【注意事项】
1．在考马斯亮蓝试剂加入后的5－20分钟内测定光吸收,因为在此段时间内颜色最稳定。

2．测定中,蛋白—染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可
以忽略的，测定后可用乙醇将比色杯洗干净。

实验三ＳDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
【目的要求】
1．了解并掌握SDS-PAGＥ电泳原理及方法。

2.掌握垂直板电泳的操作方法。

【实验原理】
十二烷基硫酸钠（SＤS)—聚丙烯酰胺凝胶（ＰAＧE)电泳可根据蛋白质分子大小的差别分离蛋白质,并可测定蛋白质的相对分子量,其原理主要与电泳过程中存在的特殊物理效应有关:
１.凝胶的分子筛效应:聚丙烯酰胺凝胶是在催化剂的作用下聚合而成的具有网状立体结构的微孔凝胶,蛋白质颗粒在电场中通过此凝胶时，会受到阻碍。

大分子蛋白质受到的阻力大,电泳速度小，而小分子蛋白质受到的阻力小，移动快，因而最终在凝胶中得以分离。

２．电荷效应:SＤS是一种表面活性剂，在蛋白样品和PAGＥ凝胶中加入SDＳ，则能与蛋白质分子上的疏水基团结合，使蛋白质表面覆盖一层SＤS分子。

由于十二烷基硫酸根带有大量负电荷，且电荷量远远超过蛋白质分子原有的带电量，因而掩盖了蛋白质分子本身的电荷差别，使各种ＳDS-蛋白质复合物都带有均等密度的负电荷,分子之间的电荷差异消失。

3.变性效应:SDS同时还破坏了蛋白质中的非共价键,导致蛋白质变性,使SDS－蛋白质复合物在溶液中呈现相似的形状。

因此,蛋白质在SDS-ＰＡＧE凝胶中的电泳迁移率不再受蛋
白质原有电荷和形状的影响,而主要取决于分子量的大小。

在进行ＳDS－PAGE电泳时，同时使用蛋白质分子量标准样品,则可以在电泳完毕后根据标准分子量大小得知样品蛋白质的相对分子量。

４．凝胶对样品的浓缩效应:SＤＳ－PＡGE使用一种不连续的缓冲系统，即分为低浓度的浓缩胶和较高浓度的分离胶，配制这两种凝胶所用缓冲液的pＨ值和离子强度也不相同。

电泳时,样品中的SDＳ-蛋白质复合物首先经过浓缩胶,体积得到极大的浓缩，然后再经过分离胶被分离。

SＤＳ－PＡGE凝胶已经成为实验室常用的蛋白质分离方法，通常被用于蛋白质制品纯度的鉴定和蛋白质分子量的测定。

【试剂器材】
1．30%凝胶贮备液称取3０g 丙烯酰胺和Ｎ，N′－亚甲双丙烯酰胺0.８ｇ,用去离子水配制成100ml的溶液，过滤，贮存于棕色瓶中,４℃冰箱保存。

２．１０％凝胶贮备液称取10g丙烯酰胺和Ｎ，N′-亚甲双丙烯酰胺0.5g，用去离子水配制成100ml 的溶液,过滤,贮存于棕色瓶中，4℃冰箱保存。

3.10% SDS用去离子水配制,贮存于室温中。

４．1％TEMED（N,N,N’,Ｎ’-四甲基乙二胺)。

5.10％过硫酸铵用去离子水在临用前配制。

6.Ｔｒis-甘氨酸电泳缓冲液（pH 8．3)：
Trｉs 6．0ｇ
甘氨酸28.8g
10%ＳＤＳ溶液10 mｌ
用蒸馏水定容至1000ml
7．1.5 mol／ＬpH 8.8 Trｉs－HＣl 缓冲液称取Triｓ１8１.５ｇ,加适量蒸馏水溶解,用浓HCｌ调节pH值至８．8，加蒸馏水至1０00 mｌ。

8．０．５moｌ/L pH6.８Tris－HCｌ缓冲液称取Tris 6０.６g，加５０0ml蒸馏水溶解，用浓HＣｌ调节pＨ值至6.8,加蒸馏水至100０ml。

9.0.05mol/L pH8．0Ｔris-HCl 缓冲液称取Trｉs 6.1g,加500ml蒸馏水溶解，用浓HCｌ调节pＨ值至８.0，加蒸馏水至10０0 ml。

1０．2 样品缓冲液：
蔗糖4g
溴酚蓝2mｇ
１0% SＤＳ溶液2ml
5％β-巯基乙醇0.5mｌ
0.０5mol/L Tｒis-HCl(pH 8.0）２ml
用蒸馏水定容至10.０ｍl
11．0.25％考马斯亮蓝R250 将2．５g考马斯亮蓝R２５０溶解于450mｌ甲醇
中,再加入45０ｍl蒸馏水和100ml 冰乙酸,混匀,过滤除去颗粒物质。

１2．洗脱液将50mｌ甲醇和7５ml冰乙酸溶解于8７５ｍl蒸馏水中，混匀。

13.预染蛋白质分子量标准：117k D、90kＤ、49kD、3５kD、26kD、１9kD共6种蛋白质
１4.电泳槽、电泳仪、扫描仪、染色缸、摇床、一次性手套、微量加样器等。

【操作步骤】
1．制备凝胶
（1)准备玻璃板，洗净、晾干。

按电泳槽使用说明装好,按下表配制1２%分离胶溶液和5%浓缩胶溶液:
表3-1：浓缩胶与分离胶的配制
溶液成分12%分离胶溶液（mｌ) 5％浓缩胶溶液（ｍl）
30% 凝胶贮备液4．0 －
1０％凝胶贮备液－２.5
1.5 moｌ／LｐH 8.8Ｔｒis-HCl
2.５
-
0.5 mol/L pH6．8 Trｉｓ-HＣl －
1．25
１0% SDＳ０.1 0.05
1％ＴＥMED 0.8
0.4
蒸馏水2．5
0.75
１0％过硫酸铵0.1 0.0５
总体积１0.0 5.0
（２)小心将分离胶注入准备好的玻璃间隙中,并为浓缩胶留有空间。

轻轻在顶层加入几毫升去离子水,以阻止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用。

(3）凝胶聚合后，倒掉上层水,用滤纸吸干凝胶顶端的水。

（４）按表3-1配制浓缩胶,注入分离胶上端,插入梳子，应小心避免产生气泡。

2.点样
(1）待测蛋白样品的制备：若样品为水溶液，且蛋白质含量大于10 mg/mｌ,可将待测液与样品缓冲液等体积混匀,100℃加热３mｉn。

（2）浓缩胶聚合后,拔去梳子，将凝胶放入电泳槽中；在上、下槽中加入电泳缓冲液。

（3）将样品混合液、标准蛋白按次序加入梳孔中。

3.电泳
起始电压为8V/ｃm,当染料进入分离胶后，将电压调至15Ｖ／cｍ，继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部,关闭电源。

4.染色
取下凝胶,将凝胶浸泡于考马斯亮蓝染色液中，在摇床上室温缓慢摇动3０～6０ｍin。

5.脱色
换洗脱液，于摇床上室温缓慢摇动1～2 小时，其间更换1～２次洗脱液。

洗脱后的凝胶可以照像或干燥,也可置于含有20％甘油的水中密闭保存。

【注意事项】
1. ＳDS－PＡGE电泳要求样品的离子强度尽量要低，如果离子强度过高,应经透析或离子交换除盐后再进行电泳。

2.丙烯酰胺试剂是一种神经毒素,可通过皮肤吸收,会因多次积蓄而中毒。

操作时应极其小心,需要带一次性手套。

3.上样量以10~１5μl为宜,如果样品蛋白含量过少，为保证区带清晰，可增加上样量，同时应将样品缓冲液浓度提高二倍或更高。

4.溴酚蓝染料是指示剂,为电泳时可见的迁移标志物。

5.凝胶聚合的时间与温度有关，夏天聚合快，可置于冰浴中减慢聚合;冬天室温低，可放入温箱中加快聚合。

实验四蛋白质转印实验（半干式）
【目的要求】
1.掌握半干式蛋白质转印技术的基本操作。

2.掌握蛋白质转印后的检测方法。

【实验原理】
蛋白质印迹(Western bｌottｉng)是将蛋白质电泳分离技术与免疫标记技术结合所形成
的一种鉴定特异性抗原的方法。

蛋白质转印应先将含某抗原的蛋白混合物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶（ＳＤＳ-PAＧE)电泳，使各种蛋白成分根据分子量的不同分离开来；再通过电转移将各种蛋白成分转印到硝酸纤维素膜（NC)或PVDF膜上;通过特异试剂（抗体）作为探针，与膜上的相应抗原发生结合，再与酶标记的抗Ig 抗体结合,洗涤后加入底物进行显色。

根据显色条带的位置和深浅,可以对抗原及其分子量或相对含量进行检测。

蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种优点，可检测到低至1
－5ng的靶蛋白。

本实验的主要目的是采用半干式电转移将ＳDS－PAＧE凝胶电泳分离后的蛋白质从凝
胶转移至固相支持材料上。

裁剪与凝胶一样大小的硝酸纤维素膜，用去离子水浸湿后，再浸
入转移缓冲液内，随后取出进行转移（半干式电转移在室温操作，所需时间较短);将凝胶及
与之相贴的硝酸纤维素膜夹于事先用转移缓冲液浸泡过的滤纸之间,平放在电转仪上,负极在
上，正极在下，凝胶在阴极端,薄膜在阳极端，转移方向从阴极到阳极；根据凝胶面积设置
电流,室温下进行转移；转移结束,取出薄膜,丽春红染色检测转印效果。

【试剂器材】
1．半干式电泳转印槽
2．硝酸纤维素膜
3．滤纸
4．转移电泳仪
5．培养皿
6．万向旋转摇床
7．转印缓冲液
【操作步骤】
1．将电泳后的SDＳ－ＰＡGE 凝胶浸在转印缓冲液中，洗10 ｍiｎ。

2．去掉浓缩胶,测量剩余胶的尺寸大小。

3．剪1张和胶大小一致的硝酸纤维素膜，用铅笔在膜的右下角做一个标记，用于定位。

剪６张和胶大小一致的滤纸(尺寸一定不能大于胶的尺寸,否则多出的部分会在胶的边缘接
触，形成短路,导致转移不充分)。

4．将膜及滤纸在转印缓冲液中浸润10mｉn。

5．将３张湿滤纸放到半干电转仪的底部平板电极上（负极),然后依次放置胶、硝酸纤维素膜、滤纸（３张），注意堆放整齐,同时注意每层之间避免气泡存在,一般可用试管碾压
赶走气泡(注意：一旦胶和膜接触，位于胶表面的蛋白就会结合到膜上，所以胶一定要
一次成功,不要试图调整胶的位置，否则蛋白质色带可能会印上去，最后产生重迭影像）。

6．待所有的膜和胶都放好后,盖上转印仪的上盖,让上部的平板电极压紧由滤纸、膜、胶形成的三明治结构(注意正负极,转印结束后，才可以打开上盖)。

7．连接转移电泳仪,电流通常设为1 mA/cm2左右。

8 cm Ｘ7 cm的胶通常使用100 mＡ恒流转移。

大胶必须限制电流在０．８mA/cm２,防止电流过大，产生过多热量，影响转印。

转印时间如下表所示。

表4-1转印时间和蛋白分子量的关系*
分子量（ＭW) 转印时间
<20 kDa 30 分钟
20 kDa~80ｋＤa 60 分钟
>80kＤa ９０分钟
＊以8X7cｍ的迷你胶在100 mＡ恒流的条件为例
8．转印结束，取出转印三明治，打开后依次取出转印膜及凝胶。

9．将转印膜浸入丽春红染色液中，观察是否有红色蛋白条带出现；转印后的凝胶可以进行考马斯亮蓝染色,看有无蛋白质残留;若电泳时加有预染标准蛋白质marker,则可在转印
膜上看到相应色带,帮助确定转印成功，并可评估转印效率。

10．若继续进行免疫杂交实验,则用去离子水漂洗转印膜后可进行封闭。

【注意事项】
1. 不要切去胶的一角以作标记,因为这样容易导致短路或转移不充分。

尽可能在电泳结束后就进
行转印,防止样品在胶内弥散开来。

2. 丙烯酰胺浓度越低,蛋白越容易转移下来。

所以应选择可以分离蛋白最低浓度的凝胶进行
电泳。

梯度胶适用于转印一系列不同大小的蛋白,因为凝胶的孔与不同大小的蛋白匹配良好。

３. 蛋白质结合到硝酸纤维素膜上主要是通过疏水键，对于常规使用效果非常好。

但对于小
的多肽,建议使用小孔径(0.2 μm）的膜。

４. PＶDF膜比硝酸纤维素膜更疏水,在转印过程中结合蛋白更紧密,可以耐受更多的SＤＳ。

目前,PVDＦ膜一般比硝酸纤维素膜需要更严谨的封闭条件,适用于蛋白测序。

尼龙膜通过疏
水和静电相互作用结合,其SDS耐受度甚至高于PVDＦ膜,但也需要更严谨的封闭条件,主要
建议用于Northerｎ和Sｏuｔherｎ杂交。

实验五质粒ＤNA的提取（碱裂解法)
【目的要求】
1.掌握碱裂解法制备质粒ＤNＡ的原理和方法, 进一步认识质粒ＤNA 的性质。

2．初步掌握分子克隆基本操作技术。

【实验原理】
质粒（plasmid),是能在染色体外自我复制的稳定共生型遗传单位,主要存在于细菌、放线菌、真菌和某些动植物细胞中。

它能在细菌中垂直遗传,且保持稳定的拷贝数，赋予宿主
细胞某些特殊的表型。

迄今为止从细菌中分离得到的质粒都是双链闭合环状DNA分子，大
小为1 kb~2０0 kb。

在基因工程研究中,质粒是最常用的一种基因克隆载体,用于运载外源基
因进入宿主细胞。

因此，质粒DNA的提取和纯化是分子生物学技术中的一项基础工作。

质粒DNＡ提取的关键是要与细菌染色质DNＡ分开。

常用的提取方法有煮沸法、碱裂解法、去污剂法、有机溶剂法和溶菌酶法等，不同方法各有利弊，应根据不同质粒的性质、不同宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合加以选择。

一般以碱裂解法最为常用，因为它对细菌的裂解完全，对染色质DＮA和蛋白质的变性充分，因而所提取的质粒DNA产量高、纯度高。

但如果碱变性时间过长，有可能会导致质粒DNA变性，导致随后的内切酶酶切困难。

碱裂解法提取质粒DＮA的主要原理和步骤是:
1.接种含质粒的单个菌落到培养基中过夜培养。

随着细菌的生长, 质粒DNA也随之自主复制。

必要时,可以在细菌生长后期在培养基中适量加入氯霉素，以抑制宿主细胞的蛋白质合成和染色质ＤNＡ的复制,细菌的数量不再增加，而质粒ＤＮA的复制基本不受影响，从而大量扩增质粒DNA的拷贝数。

２.离心收集细菌。

３．加入强碱溶液裂解菌体,必要时可以适量加入溶菌酶。

此时大分子量线状的细菌染色质DＮＡ和蛋白质发生变性，而闭合环状的质粒ＤNA多数仍不变性，处于自然状态。

4.几分钟后加入中和液，将ｐH值调至中性。

在高盐浓度条件下，大部分染色质ＤＮA与蛋白质不能复性，交连成不溶性网状结构,在去污剂SDS的作用下形成絮状沉淀。

而质粒DNＡ分子量小，且为闭合环状结构,少数变性的质粒ＤNA也能够迅速复性,呈溶解状态。

5.离心，去除大部分细胞碎片、染色质DNＡ、RNA和蛋白质。

质粒DＮＡ保留在上清中。

6.最后再用RNA酶消化,酚/氯仿抽提、透析和乙醇（或异丙醇）沉淀等方法进一步去除残余蛋白质和核酸,纯化质粒DNA。

【试剂器材】
1．LB培养基：蛋白胨10 g, 酵母抽提液５g，NaCl 10g, 加蒸馏水至1 000 mL, 用NaOH调pH至7.５, 高压蒸汽消毒20min。

2.I号液:50mmoｌ/L 葡萄糖，25mmoｌ／L Tris·Cｌ（pＨ８.0）,１０mmｏｌ／L EDTA（必要时在使用前加溶菌酶4mg/mＬ)
3.II号液：0．２ｍol/L NａOH,含1%SDS（IＩ号液必须在实验时新鲜配制）
４.IＩＩ号液：5mol/L KAc 60ml,冰醋酸１1．５ｍｌ，水28.５ml（含3ｍol/L钾,5mol/L 醋酸，pH4．8）
5.RＮasｅ：10ｍｇ/ｍL －20℃保存备用
6.TE：10ｍmoｌ/L Ｔriｓ﹒HCｌ(pH8.０），1mmol/L EDＴA(pH８.0)。

高压灭菌２0min,4℃保存备用。

7.STE：０．１ｍoｌ/L NaCl,10mmol/ＬＴriｓ﹒Cl (pH 8.0),1ｍmｏl/L EＤＴA
8．酚／氯仿/异戊醇（25：2４:1）
9．乙醇(无水乙醇、７0％乙醇）,-20℃保存备用
1０.台式低温高速离心机
1１．涡旋混合器(Vｏｒｔex)
12．1．5ml eppendorf离心管(灭菌）
13.移液器
【操作步骤】
１.培养：在5ml含适当抗生素的LB培养液中接种含质粒的单个菌落,３7℃，1５0rpm 振荡培养过夜。

２．收菌:取1-１.5ml培养液于1.5mｌEpendｏrf管中,５０00rpm离心３分钟，弃上清，收集细菌。

3．重悬:弃上清，在沉淀中加入预冷的I号液100μｌ，voｒtex强烈振荡,充分悬浮菌体。

4.裂解：加新鲜配制的ＩI号液20０μl,立即温和颠倒离心管５次，混匀。

置冰水浴中3－5分钟。

5.中和:加入150μｌ预冷的IIＩ号液,立即温和颠倒混匀数次,混匀。

置冰水浴中3-５分钟。

６.沉淀:12 000 rpm离心10分钟,取上清液置新Epenｄorf管中。

7.酚/氯仿抽提：加入等体积的酚／氯仿/异戊醇（25：24:1），振荡混匀,1２00０rpｍ离心2分钟。

取上清液（小心不要吸到中间蛋白膜）,转入另一个Eppendｏrｆ管中。

8.氯仿抽提：加入等体积的氯仿,振荡混匀，１2０0０rpm离心２分钟，取上清液转入另一个Eｐｐｅndｏrｆ管中。

９.乙醇沉淀：加入2倍体积的无水乙醇(或0.6倍体积异丙醇）,混匀,室温放置１０分钟。

4℃，120０0rpm离心5分钟。

10.洗涤：弃上清,沉淀用70%乙醇洗涤,4℃，１2０00rｐｍ离心2分钟。

１1．干燥:弃上清,用消毒滤纸条小心吸净管壁乙醇滴。

将Ｅppenｄｏｒf管倒置于滤纸上,室温蒸发乙醇10分钟。

１2．溶解:加入２0μl TE(含无DNA酶的ＲNA 酶20μg/ｍl),温和振荡２分钟。

置于－20℃冰箱保存。

实验六聚合酶链反应(PCＲ)体外扩增DＮA
【目的要求】
掌握PCR的基本原理与实验技术。

【实验原理】
聚合酶链反应(polyｍerase cｈａin reａctioｎ,PCR)是一种通过体外酶促反应大量、快速、选择性地合成目的DNＡ片段的核酸合成技术,具有高度特异性、操作简单、高效快速、
灵敏度高等特点,是最常用的分子生物学技术之一。

ＰＣR的基本原理如图6-１所示。

图6-1：PCR原理示意图
PCR反应体系主要由以下5种成分组成：与目的基因上下游互补的两条单链DNＡ引物（pｒimer)、含目的基因片段的模板DNA、耐热DNA聚合酶、四种dNＴP底物和缓冲液。

经过约9４℃的热变性（使双链DＮA模板解离为单链）、３7～60℃退火（使引物与模板特异性结合）、７2℃延伸(在DＮＡ聚合酶的催化下合成DNA互补链）三步反应为一个循环。

每循环一次,目的基因片段数量即大约增加1倍（理论值为2n)，而每一次循环所产生的DN Ａ又成为了下一次循环的模板。

通过2０～30次变性、退火、延伸三种温度的循环，目的基因片段的数量可以在几个小时内以指数形式扩增上百万倍。

因此可以迅速地从极其微量的样品(如一根毛发、一滴血)中大量获取目的基因片段。

PCR反应条件的优化:优化的目的主要有两个,即提高扩增产物特异性和提高产物产量。

但在多数情况下，这两个目的却是互相矛盾的。

总体来说,适当减少模板、引物、聚合酶、Mｇ２+的浓度和适当提高退火温度、减少循环次数，可以提高产物的特异性,但相应会减少产量；反之,则可以提高产物的产量,但增加非特异性扩增产物。

因此，应根据实验目的合理选择最佳反应条件，必要时可进行多次预实验反复摸索。

1．引物：引物是决定PＣR成败的最关键因素。

①必须保证引物碱基序列的高度特异性;②引物长度一般为15-30bp，过短则特异性降低；③G+C含量控制在40-６0％，且两个
引物的Tｍ值不得相差太大；④引物自身不得存在3ｂp以上的互补碱基序列;⑤两条引物之间不应存在4个以上连续的同源性或互补性碱基;⑥避免4个以上同一碱基的连续出现；⑦引物合成质量要好，并需要纯化；⑧反应体系中引物浓度一般应控制在0.2－1μｍol／L,过低则产量降低，过高则导致非特异性扩增。

2．耐热DNA聚合酶：①通常TaｑDNA聚合酶用量为0.5-5U/１０0μl，酶量过大会导致非特异产物的增加；②传统使用的Taq DＮA聚合酶的一个致命缺点是不具备3′→5′校正外切酶活性,错配率高（大约每聚合9０00个核苷酸发生一次错误掺入，经过约２0个循环后，扩增产物中随机突变率大致为1／40０-1/90０),导致扩增产物发生突变。

现已有多种高保真耐热DNA聚合酶(如Pｆu DNＡ聚合酶、VENT DＮＡ聚合酶等)可供选择，用于某些精度要求高的实验。

３．模板:PＣR对模板的质和量要求都不是太高。

RNA也可作为模板，但须先逆转录为cDNA。

模板不需要太纯,但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Ｔaq DＮA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白。

对于扩增哺乳动物基因组中单拷贝序列，模板DNA的加入量一般为０.２-2μg。

对于质粒ＤNA模板只需要20ｎg。

模板量过多，会增加非特异性扩增机会。

４.Mg2＋浓度:Mｇ２＋是维持ＴａｑＤNA聚合酶活性所必需的，还影响DＮA的Tｍ值、产物的特异性及引物二聚体的形成。

Ｍg2＋浓度过低时，酶活性显著降低,使产量降低;过高时，易生成非特异性扩增产物。

由于模板ＤNA、引物、ＥDTA和dNTP均可与Mg2+结合而降低游离Mg２＋浓度,因此Mg2+的浓度应比dNTP高0.2-２．5 mｍol/L,模板的DNA 应溶于10mmol／L Trｉs-HCl（ｐＨ7.６)/０.1mmoｌ/ＬEDＴA中。

５．dNTPs:dＮTP具有较强的酸性，使用前应调节pH至7.0-７．5。

浓度范围为２0-200μmol/L,高浓度dＮTPs易产生错误掺入，而浓度太低则降低反应物的产量。

四种dNＴP应等当量配制，其中任何一种浓度偏高或偏低,都会诱导错误掺入，降低合成速度,过早终止反应。

决定最低dNTＰ浓度的因素是靶序列DＮＡ的长度和组成。

在100μl反应体系中,20μｍol/ＬｄNTPｓ基本满足合成2．6μg DNA，5０μmｏｌ／L dＮTＰs可以合成６.6μg DNA，而200μｍol／L ｄNTPs则足以合成２5μgDNA。

6．变性温度与时间:通常采用94-95℃变性1分钟。

一般在第１次热循环前预先94℃变性5-10分钟，然后再进入循环过程的94℃变性阶段。

７．复性温度与时间:这是决定PＣR成败的又一个关键因素,它直接决定了扩增产物的特异性。

合适的复性温度应低于PCR条件下真实Ｔｍ值。

℃。

降低温度可提高产量，但增加非特异性扩增;反之则提高特异性但降低产量。

8、延伸温度和时间:延伸温度一般为７２℃。

延伸时间主要视目标ＤNA片段长度而定。

正常掺入速度为35－100ｎt/秒，一般情况下３0－60秒就足够，时间过长也增加非特异性扩增。

但最后一个循环可将时间延长到4-１0分钟。

9.循环次数:在PCR反应后期，由于底物和引物的消耗、酶活性的下降、终产物(双链ＤNＡ、焦磷酸）的堆积等原因,导致产物从原来以指数级增加的形式转变为线性形式，即所谓平台效应。

所以即便再增加循环数，由于产物的增加量有限，反而会增加非特异性扩增的。