大肠杆菌感受态细胞的制备和转化报告
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2 1 0 分 子实 生验 物 学
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提高转化效率的几个因素
质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。 转化效率与外源 DNA的浓度在一定范围内成正比 ,但 当加入的外源 DNA 的量过多或体积过大时 , 转化效率 就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞 达到饱和。一般情况下 ,DNA 溶液的体积不应超过感
则在含卡那霉素的培养基上不能生长。能在卡那霉素 培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了质
粒。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电
泳、酶切等进一步鉴定。
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1. 受体菌的培养
1) 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种
于3-5ml LB液体培养基中,37℃,180rpm振荡培养过夜；
转移,使受体细胞出现新的遗传性状。 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转
化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。
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常用的感受态细胞制备方法 KCl法， CaCl2法，电击感受态制备等 RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高， 但制备较复杂，不适合实验室用 电击感受态细胞转化效率高，操作简便，但需 电击仪 CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足 一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用 时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃以下 保存半年，因此CaCl2法使用更为广泛. 2 分
实验九，十
大肠杆菌感受态细胞的 制备和转化
一. 实验原理
1. 概念
感受态细胞
在自然条件下 ,很多质粒都可通过细菌接合作用转移 到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种 转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另 一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌， 需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后， 细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 2 分子进入的细胞，称感受态细胞。
2）设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，超 净工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度 计，微量移液枪， eppendorf管等。
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3. 试 剂 0.1mol/L的CaCl2 LB液体培养基 LB固体培养基 Kana母液：卡那霉素(Kanamycin )母液：配成 100mg/ml水溶液, -20℃保存备用
的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或 杂DNA所污染 , 否则均会影响转化效率或杂 DNA的
转入 , 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
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二. 材料，设备及试剂
1）材料
E. coli DH5α菌株； 质粒、 1.5ml 离心管（又称eppendorf管） 卡那霉素；
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Байду номын сангаас
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三. 操作步骤
本 实 验 以 E.coli DH5a 菌 株 为 受 体 细 胞 , 并 用 CaCl2 处理 , 使其处于感受态 , 然后与质粒共保温 , 实现 转化。由于质粒带有卡那霉素抗性基因，可通过卡那
霉素抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入质粒，
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CaCl 2 法制备感受态细胞原理 CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现，其 基本原理是：细胞处于 0 ～ 4 ℃， CaCl2 低渗溶液 中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于 细胞表面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温 一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如 卡那霉素耐药基因得到表达，然后将此细菌培养物 涂在含卡那霉素的选择性培养基上，倒置培养过夜， 2 分 2008 0 子实 即可获得细菌菌落。 1 生验
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提高转化效率的几个因素 细胞生长状态和密度
质粒的质量和浓度
试剂的质量
防止杂菌和杂DNA的污染
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提高转化效率的几个因素
细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从 －70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备 感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生 长期时为好，可通过监测培养液的 OD600 来控制。 DH5α 菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同 ),这时比较合适。密 度过高或不足均会影响转化效率。
株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 , 它可以容忍 外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如物理制备法,化学制备法等)
的处理后 , 细胞膜的通透性发生了暂时性的改变 ,成为能允许 外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的 DNA分子通过复制 , 表达实现遗传信息的
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转 化
转化 (Transformation) 是将外源 DNA 分子引入 受体细胞 , 使之获得新的遗传性状的一种手段 , 它 是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域 的基本实验技术。
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转化过程
转 化
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异
受态细胞体积的5％。
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提高转化效率的几个因素
试剂的质量: 所用的试剂 ,如 CaCl2 等均需是最高纯度的 , 并用超纯 水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处 防止杂菌和杂DNA的污染： 整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如
离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有
2) 将该菌悬液以1:30-100的比例接种于100ml LB液体 培养基中，37℃振荡培养2－3小时至OD600在0.3-0.4左右 ; 3) 无菌条件下取 1.5 ml 菌液到 eppendorf 管中，冰浴 10min，4℃, 8000rpm离心5min; 4) 彻 底 弃 上清 液 ， 在冰 浴 上 加入 500ul 预冷 的 无 菌 CaCl2 (0.lmol/L)使细胞悬浮；
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提高转化效率的几个因素
质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。 转化效率与外源 DNA的浓度在一定范围内成正比 ,但 当加入的外源 DNA 的量过多或体积过大时 , 转化效率 就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞 达到饱和。一般情况下 ,DNA 溶液的体积不应超过感
则在含卡那霉素的培养基上不能生长。能在卡那霉素 培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了质
粒。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电
泳、酶切等进一步鉴定。
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1. 受体菌的培养
1) 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种
于3-5ml LB液体培养基中,37℃,180rpm振荡培养过夜；
转移,使受体细胞出现新的遗传性状。 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转
化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。
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常用的感受态细胞制备方法 KCl法， CaCl2法，电击感受态制备等 RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高， 但制备较复杂，不适合实验室用 电击感受态细胞转化效率高，操作简便，但需 电击仪 CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足 一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用 时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃以下 保存半年，因此CaCl2法使用更为广泛. 2 分
实验九，十
大肠杆菌感受态细胞的 制备和转化
一. 实验原理
1. 概念
感受态细胞
在自然条件下 ,很多质粒都可通过细菌接合作用转移 到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种 转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另 一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌， 需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后， 细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 2 分子进入的细胞，称感受态细胞。
2）设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，超 净工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度 计，微量移液枪， eppendorf管等。
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3. 试 剂 0.1mol/L的CaCl2 LB液体培养基 LB固体培养基 Kana母液：卡那霉素(Kanamycin )母液：配成 100mg/ml水溶液, -20℃保存备用
的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或 杂DNA所污染 , 否则均会影响转化效率或杂 DNA的
转入 , 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
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二. 材料，设备及试剂
1）材料
E. coli DH5α菌株； 质粒、 1.5ml 离心管（又称eppendorf管） 卡那霉素；
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三. 操作步骤
本 实 验 以 E.coli DH5a 菌 株 为 受 体 细 胞 , 并 用 CaCl2 处理 , 使其处于感受态 , 然后与质粒共保温 , 实现 转化。由于质粒带有卡那霉素抗性基因，可通过卡那
霉素抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入质粒，
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CaCl 2 法制备感受态细胞原理 CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现，其 基本原理是：细胞处于 0 ～ 4 ℃， CaCl2 低渗溶液 中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于 细胞表面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温 一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如 卡那霉素耐药基因得到表达，然后将此细菌培养物 涂在含卡那霉素的选择性培养基上，倒置培养过夜， 2 分 2008 0 子实 即可获得细菌菌落。 1 生验
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提高转化效率的几个因素 细胞生长状态和密度
质粒的质量和浓度
试剂的质量
防止杂菌和杂DNA的污染
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提高转化效率的几个因素
细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从 －70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备 感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生 长期时为好，可通过监测培养液的 OD600 来控制。 DH5α 菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同 ),这时比较合适。密 度过高或不足均会影响转化效率。
株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 , 它可以容忍 外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如物理制备法,化学制备法等)
的处理后 , 细胞膜的通透性发生了暂时性的改变 ,成为能允许 外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的 DNA分子通过复制 , 表达实现遗传信息的
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转 化
转化 (Transformation) 是将外源 DNA 分子引入 受体细胞 , 使之获得新的遗传性状的一种手段 , 它 是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域 的基本实验技术。
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分 子实 生验 物 学
转化过程
转 化
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异
受态细胞体积的5％。
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分 子实 生验 物 学
提高转化效率的几个因素
试剂的质量: 所用的试剂 ,如 CaCl2 等均需是最高纯度的 , 并用超纯 水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处 防止杂菌和杂DNA的污染： 整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如
离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有
2) 将该菌悬液以1:30-100的比例接种于100ml LB液体 培养基中，37℃振荡培养2－3小时至OD600在0.3-0.4左右 ; 3) 无菌条件下取 1.5 ml 菌液到 eppendorf 管中，冰浴 10min，4℃, 8000rpm离心5min; 4) 彻 底 弃 上清 液 ， 在冰 浴 上 加入 500ul 预冷 的 无 菌 CaCl2 (0.lmol/L)使细胞悬浮；