碱裂解法抽提质粒DNA
试验一碱裂解法抽提质粒DNA
3 质粒DNA的进一步纯化
加入TE使DNA溶液为200ul，加入等体积的酚/氯仿，充 分振荡：会分三层 12000rpm，离心5分钟，吸取上清液 加入等体积的氯仿， 12000rpm，离心5分钟，取上清 加入1/10体积的3MNaAc，加2倍体积的预冷的无水乙醇， 混匀。 置于-70℃冰箱约10min以上或者-20℃冰箱30min至数个 小时
三、材料、试剂及仪器
1 材料： （1）菌种E.coliDH 10B含质粒pSK （2）菌种E.coliDH 10B含质粒pMP3 2 试剂: LB培养基（ 固体和液体）;氨苄青霉素 (Amp,100mg/ml);20﹪SDS;溶液Ⅰ; 溶液Ⅱ （最好现配现用）;溶液Ⅲ（-20℃预冷）; 4N NaOH; 3MNaAc（PH5.2）;无水乙醇; TE缓冲 液（PH8.0）; RNaseA(10mg/ml); 70﹪乙醇;饱 和酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
2.点样
1xTE或ddH2O:7μL 10ul混合液 10xloading buffer : 1ul 样品:2 ul 混合后点入点样孔中。其中最左边的两个孔点5ulMarker3和 DS2000作为分子量标准。 3.电泳
打开电源开关，调节电压至3-5v/cm即100V，可见溴酚蓝 条带由负极向正极移动，约一小时可观察
12000rpm离心15分钟（4℃），倒掉酒精，离心几秒， 用移液枪尽可能除去酒精 用0.5ml70 %酒精洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉酒 精 离心几秒，用移液枪尽可能除去酒精，风干。 加30ulTE溶解DNA沉淀（TE不加RNase）
五、实验注意事项
1 挑菌落应挑单菌落。 可用牙签挑取，也可用tip头挑取。市场上买的 牙签上有防腐剂，应用沸水煮过之后，烘干用 2 细菌培养过程应注意保持细菌的通气性： （1）培养基的体积不能占培养管的体积太多 （2）培养管的体积不用盖太紧 （3）培养管倾斜培养：可增大细菌与氧气接触 面积 （4）转速为200rmp：快一点的转速有利于保持 其的通气性
碱裂解法提取质粒DNA的研究
碱裂解法提取质粒DNA的研究碱裂解法是一种常用的提取质粒DNA的方法。
该方法通过将大肠杆菌等细菌细胞进行碱性处理，使其细胞壁溶解，并释放出质粒DNA。
以下是对碱裂解法提取质粒DNA的研究进行详细介绍。
首先，进行实验前的准备工作。
实验材料包括大肠杆菌含质粒的培养液，碱性裂解液，中和液，以及一些常规实验室工具。
准备条件优化的培养基，如Luria-Bertani培养基，以获得高质量的质粒DNA。
将培养的大肠杆菌细胞进行离心，取得细菌细胞的沉淀，并将其重悬于适量的碱性裂解液中。
碱性裂解液的配制对提取质粒DNA的质量具有重要影响。
通常，碱性裂解液包括Tris-HCl缓冲液（pH 8.0-8.5）、EDTA （0.1M，pH 8.0）以及SDS（0.5%-1.0%）。
在碱性裂解液中，细胞壁受到破坏，并且其中的DNA被释放出来。
为了进一步提取质粒DNA，需要添加RNase A（最终浓度为20μg/mL）来降解细胞中的RNA。
此外，可以根据需要添加蛋白酶K（最终浓度为100μg/mL）来去除大部分的蛋白质。
接下来，使用酒精沉淀法来纯化质粒DNA。
首先，加入等体积的冰冷异丙醇，使DNA和异丙醇充分混合，然后进行离心。
在高速离心后，离心管底部会形成一个白色的DNA沉淀。
利用移液枪将上层液体倒掉，然后用70%的乙醇洗涤DNA沉淀，移液枪将乙醇沉淀洗涤掉。
最后，利用离心机将样品离心至全速，将乙醇溶液除去，并风干沉淀。
最后，使用合适的缓冲液溶解DNA，以达到所需的浓度。
为了确定提取的质粒DNA的纯度和浓度，可以使用紫外光谱仪来测定其260nm和280nm的吸光度比值。
这个比值可用于评估质粒DNA中的蛋白质污染情况。
如果蛋白质污染特别严重，可以使用氯仿、酒精沉淀等方法进行进一步清除。
此外，还可以使用琼脂糖凝胶电泳来检测提取的质粒DNA的大小和完整性。
通过比较不同样品的DNA迁移位置，可以快速确定质粒DNA的大小。
总结：碱裂解法是一种非常常用且简单的提取质粒DNA的方法。
碱裂解法提取质粒DNA
葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性
这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去
溶液Ⅱ 0.2M NaOH / 1% SDS
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破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
加入溶液Ⅱ之后必须温柔混合，不然基因组DNA会物理断裂；
停留的时间不能过长，因为强碱性条件下基因组DNA会慢慢化学断裂
溶液Ⅲ 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸
这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；
SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀
自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDDNA时，多数情况下能看到三条带，按电泳速度由快到慢排序，
分别是 超螺旋带、开环带 和 复制中间体带（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤碱裂解法是一种常用的方法，用于提取质粒DNA（plasmid DNA）纯化。
以下是具体的实验原理和操作步骤。
实验原理：碱裂解法利用碱性溶液将细菌细胞的细胞壁和细胞膜溶解，使细菌细胞内的质粒DNA被释放出来。
接着，使用中性化剂中和碱性溶液，使DNA带正电荷，而细胞中的蛋白质则带负电荷，从而能够通过离心将DNA与蛋白质分离。
最后，通过浓缩、洗涤和纯化，得到高质量的质粒DNA。
操作步骤：1.培养细菌：选取含有质粒DNA的细菌菌株，如大肠杆菌。
在含有适当抗生素的培养基中培养细菌菌株。
2.收获细菌：当菌液呈现较稠的浑浊状态时，收取细菌培养物。
使用离心机将菌液离心，分离菌体沉淀和上清液。
将上清液倒掉，保留菌体沉淀。
3.碱裂解：将菌体沉淀溶解于碱性溶液中，如盐酸和十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。
轻轻混合并将溶液放入水浴中加热，使细菌细胞壁和细胞膜被溶解。
4.中和：使用中性化剂，如醋酸，使溶液中的酸性物质中和。
这样可以确保DNA带正电荷，而蛋白质和其他污染物则带负电荷。
5.离心：将溶液离心，在离心过程中，DNA会与细胞内其他分子分离，形成一个DNA沉淀。
上清液中含有蛋白质和其他污染物。
6.洗涤：使用洗涤缓冲液，如乙酸盐缓冲液，洗涤DNA沉淀，去除残留的污染物。
7.纯化：用去离子水溶解DNA沉淀，使其溶解在水中。
将溶解的DNA沉淀通过滤纸等过滤装置过滤掉残余杂质。
8.浓缩：通过酒精沉淀法或其他方法，将DNA溶液浓缩到所需的浓度。
9.检测：使用紫外分光光度计等方法，测定提取的质粒DNA的纯度和浓度。
注意事项：1.在实验过程中保持操作环境和仪器无菌。
2.碱裂解法中使用的溶液需准备新鲜，并避免受到污染。
3.操作过程中需要低温处理和离心操作，以保护DNA的完整性。
4.质粒DNA的提取可以根据实验目的进行进一步的扩增、测序或转染等应用。
总结：通过碱裂解法，可以从细菌中提取纯化的质粒DNA。
质粒DNA的提取实验报告
质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。
三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。
2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。
3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。
5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。
6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。
碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法提取质粒DNA细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb~200kb以上不等。
存在于细胞之中，独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成分。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的一种方法，它利用染色体DNA与质粒DNA 的变性与复性的差异来达到分离的目的。
其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中（PH12.6）裂解时，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补连不会完全打开，当加入KAc（PH4.8）中和后，质粒DNA分子能够迅速复性，成溶解状态，离心时留在上清中，蛋白质与染色体DNA难于复性而成絮状，离心时可与细胞碎片一起沉淀下来。
试剂：1.溶液I:50mmol/L 葡萄糖（使悬浮的大肠杆菌不会快速沉积到底部，其次调节渗透压）25 mmol/L Tris.HCl (PH8.0) (缓冲体系)10 mmol/L EDTA （PH8.0）(Ca离子、Mg离子等二价阳离子的螯合剂，抑制DNase活性)2.溶液II: 使用前临时配制0.2 mmol/L NaOH (溶解细胞)1% SDS （使细胞膜崩解）与此同时，提高溶液PH，使染色体DNA、蛋白质及质粒均变性。
3.溶液III：100mL5mol/LKAc 60mL (Na被K置换成十二烷基磺酸钾PDS，PDS结合蛋白质沉淀，同时牵连染色体发生沉淀)冰醋酸11.5 mL（中和NaOH，长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和。
基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了）ddH2O 28.5 mL注意：①NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
要新从浓NaOH稀释制备0.2M的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
碱裂解法抽提质粒DNA
[实验原理]
质粒是存在于染色体外的小型双链环状DNA，大小在1-200kb之间，能在宿主菌中自主复制。宿主细胞中质粒的拷贝数各有不同，一种是低拷贝数的，每个细胞仅含有一个或几个质粒分子，称为“严紧型”复制的质粒，另一类高拷贝的质粒，拷贝数可达到20个以上，这种类型称为“松弛型”复制的质粒。
（5）加入200微升溶液Ⅲ，上下翻转离心管约10次，混合均匀，冰浴10分钟。４℃，14,000 rpm离心5分钟。
（6）用移液器将上清液转移到新的1.5 ml Eppendorf离心管中，加入１倍体积酚／氯仿抽提，14 000 rpm离心５分钟。
（7）重复步骤（6）1次。
（8）移取上清液（400－500微升），加入2倍体积无水乙醇、0.1倍体积3 mol/L醋酸钠，置于－20℃冰箱30分钟。
2、细菌的培养
Байду номын сангаас
（1）配制LB液体，在琼脂糖平板培养基上划线培养出单菌落（37℃，16-20小时）。
（2）在灭菌过的10 ml玻璃培养管中加入3 ml LA液体培养基、以及3微升Amp (100 ug/ml)，挑取单菌落至培养基中。将培养管置于摇床中，３７℃振摇过夜(200-250 rpm,16-18小时)。
分别用蒸馏水将DNA标准品配制成浓度为5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg/mL的DNA溶液，于260 nm处测定光吸收值，在电脑中用软件制作标准曲线。
（2）样品测定
取20微升质粒DNA置一干净的离心管中，加入2 980微升蒸馏水稀释。然后用紫外分光光度计测定260nm和280nm的光吸收值。计算DNA浓度，并通过OD260/OD280比值评估样品纯度。
实验一-碱裂解法提取质粒DNA
实验一-碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法。
下面是进行碱裂
解法提取质粒DNA的实验步骤：
1. 培养细胞：选择所需的质粒含有目标基因的细菌，如大肠杆菌等，并在适当的培养基中培养细菌，使其达到对数生长期。
2. 收集细菌：将培养好的细菌菌液转移到离心管中，并进行离心，以沉淀细菌。
3. 溶解细菌：加入一定浓度的碱液（例如0.2N NaOH）使细
菌溶解。
通常使用细菌菌液总量的1/5体积的碱液，并轻轻摇
晃混合。
4. 添加中和液：将等体积的中和液（例如3M乙酸酸化乙酸钠
溶液）加入到溶解好的细菌溶液中，并迅速而轻轻地混合。
5. 离心：将混合液进行离心，以除去沉淀的细菌残渣和碱液。
6. 提取DNA：将上一步离心得到的上清液转移至新的离心管中，加入等体积的冷乙醇，并轻轻摇晃，使DNA沉淀。
7. 沉淀DNA：进行高速离心，使DNA沉淀。
8. 弃去上清液：弃去上清液，保留沉淀的DNA。
9. 洗涤DNA：使用70%乙醇洗涤沉淀的DNA，以去除残留的盐类和碱液。
10. 干燥DNA：使用洗涤干净的乙醇或空气干燥DNA沉淀。
11. 溶解DNA：用适当的缓冲液（如TE缓冲液）溶解DNA。
12. 储存DNA：将溶解好的DNA储存于适当的温度和条件下，用于后续实验。
实验一碱裂解法提取质粒DNA
实验一-碱裂解法提取质粒DNA 碱裂解法是一种常用的提取质粒DNA的方法。
质粒是一种裸露的、结构简单的小型环状DNA，它们存在于许多细菌细胞中，可以自主复制和表达。
质粒通常用于克隆和转化实验，是分子生物学实验中常用的工具之一。
一、实验目的通过碱裂解法提取质粒DNA，进一步了解质粒的基本性质和提取过程，为后续的分子生物学实验打下基础。
二、实验原理碱裂解法是一种利用细菌细胞壁和质粒DNA在不同pH值下稳定性的差异，将细胞壁和质粒DNA分离的方法。
在pH值高于7.5的环境下，细菌细胞壁的稳定性降低，而质粒DNA的稳定性相对较高。
通过加入碱液（如NaOH）并加热，可以破坏细菌细胞壁，使细胞内容物释放出来。
在pH值低于7.5的环境下，质粒DNA的稳定性降低，而细菌染色体DNA的稳定性相对较高。
通过加入高浓度的醋酸钾溶液并冰浴，可以沉淀出染色体DNA，而质粒DNA则留在上清液中。
三、实验步骤1.准备所需试剂和器材，包括细菌培养液、NaOH、KAc、冰浴、离心管、移液器等。
2.将细菌培养液倒入离心管中，用移液器加入适量NaOH，搅拌均匀。
3.将离心管放入沸水浴中加热5分钟，使细菌细胞壁破裂，释放出细胞内容物。
4.用移液器加入适量KAc，搅拌均匀，使pH值降低至7.5以下。
5.将离心管放入冰浴中冷却10分钟，使染色体DNA沉淀出来。
6.用离心机将上清液和沉淀物分开，收集上清液。
7.在收集的上清液中加入适量的乙醇，放在-20℃冰箱中冷冻1小时，使质粒DNA沉淀出来。
8.用离心机将沉淀物和上清液分开，收集沉淀物。
9.用适量的TE缓冲液溶解沉淀物，得到质粒DNA溶液。
10.用紫外分光光度计测定质粒DNA溶液的浓度和质量。
四、实验结果与数据分析1.实验结果：通过紫外分光光度计测定，得到质粒DNA溶液的浓度和质量。
通常，提取到的质粒DNA溶液需要有一定的浓度和质量才能进行后续的分子生物学实验。
2.数据分析：根据实验数据可以分析出提取到的质粒DNA溶液的质量和浓度是否符合要求。
实验二 碱裂解法抽提质粒DNA-2
注意事项
1、因为细菌培养液中的细胞壁成分抑制限制性内切酶活性，所有未从细菌 沉淀中除去所有培养液可导致质粒不能被限制性内切酶切割或不能完全 切割。 2、酚：在酸性pH条件下，DNA分配于有机相。因此，使用前酚必须用水 饱和并用Tris平衡至 pH>7.8，以防DNA分配到有机相。
三、实验材料
1、 含有pBluescript II SK (+)(pSK)质粒载体的大肠杆菌菌株DH5α菌液
2、含有重组质粒 MP3的大肠杆菌菌株DH5α菌液
注：pBluescript是由Stratagene公司开发的噬菌粒载体（phagemid vector，由质 粒载体和单链噬菌体的复制起点结合而成）。
10、移取上清液（记体积），加2倍体积冷的无水乙醇（ -20 ℃冰箱），混匀；
11、离心（12000 rpm，10分钟，室温)，倒掉乙醇。离心几秒钟，用移液器尽可能 除去乙醇； 12、加入0.5 ml 70％乙醇洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉乙醇；
13、加40 μl 1× TE 溶解，于65℃热板上温育10分钟，之后于 -20 ℃保存备用。
7、离心几秒钟，用移液器尽可能除去酒精，风干（或热板上烘干1 min）。
8、根据DNA沉淀的大小加20~50 l 1× TE 溶解DNA沉淀，并在65℃热板上温育 10分钟（可使DNase失活），之后于 -20 ℃保存备用。
质粒抽提方法即去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及 其它杂质，以得到相对纯净的质粒。 使用相对过量的试剂 — 这是适合所有核酸抽提的建议。试剂相对过量的好处 是：稳定性好，纯度高，操作更简单。 关注溶液I、溶液II和溶液III的比例！
质粒DNA提取方案(碱裂解法)
质粒提取原理采用碱裂解法抽提质粒DNA是基于染色体DNA 与质粒DNA的变性与复性的差异不同而达到分离目的的。
在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开，DNA变性。
质粒DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，留在溶液中。
而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA、不稳定的大分子RNA及蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
Solution I：葡萄糖可增加溶液的年度，维持渗透压，防止染色体DNA受机械剪切作用而被降解，污染质粒DNA；溶菌酶（可省略）水解菌体细胞壁的化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，具有溶菌的作用。
当pH<8.0时，溶菌酶受到抑制；EDTA有两个作用：(1)螯合Mg2+等金属离子，抑制DNase对DNA的降解。
(2) EDTA的存在有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度环境；Tris-HCl作为缓冲溶液维持适当的浓度和pH值。
Solution II：NaOH，DNA在5.0<pH<9.0时时稳定的，但当pH>12或pH<3时，就会引起双链之间氢键的解离而使DNA变性。
加Solution II后系统的pH高达12.6，线性染色体DNA和环型质粒DNA氢键均发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键只发生部分断裂，且其两条链不会发生完全分离，待pH调至中性闭合环型质粒DNA很快复性恢复原来的构型，而染色体DNA不能复性。
SDS 是阴离子表面活性剂，它有溶解膜蛋白破坏细胞膜，解聚细胞中核蛋白，能与蛋白质结合成为R-O-SO3-···R+-蛋白质复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
但SDS能抑制RNase的作用，所以在以后提取中必须将其除干净。
碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法提取质粒DNA溶液I：50 mM Glu / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA（pH 8.0）；重悬菌体，提供缓冲环境。
（pH很重要）。
葡萄糖：最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，增加粘稠度，减少摇晃时对DNA 的机械剪切力。
如缺了葡萄糖对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
EDTA：它是Ca2+ 和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在分子生物学试剂中的主要作用是抑制DNase的活性和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，就是要把E.coli细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
若不加EDTA，只要是在短时间里完成质粒抽提，也不怕DNA 会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
注意菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
溶液II：0.2 M NaOH / 1% SDS；裂解菌体细胞壁、在细胞膜上穿孔，释放质粒。
NaOH：用新鲜的NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
裂解细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
用了不新鲜的NaOH，即便有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。
只用SDS也能抽提得到少量质粒，因为SDS 也是弱碱。
加SDS是为下一步操作做铺垫。
注意：一，时间不能过长，在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
溶液III：3 M KAc / 2 M HAc。
加入后就会有大量的沉淀出现，与SDS的加入有关系。
如果在溶液II中不加SDS时也会有很少量的沉淀，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。
sds碱裂解法制备质粒dna
sds碱裂解法制备质粒dna
SDS碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法。
该方法利用定量的SDS和NaOH对细菌细胞进行裂解，使DNA迅速释放。
接着，加入适当的中和缓冲液，使DNA回复其天然形态，并去除蛋白质等污染物。
最后，通过酒精沉淀法或硅胶柱层析法纯化DNA。
以下是该方法的具体步骤：
1.生长细菌
生长适量细菌菌株并收获细菌：可以选择不同种类、不同来源、不同
体积得到不同量的细菌。
2.裂解细胞壁
将细菌沉淀后加入缓冲液和SDS混合。
SDS能够破坏细菌的细胞膜，使细胞壁裂解，从而将DNA释放出来。
3.中和
加入NaOH将溶液pH值升高至12，使DNA形状发生改变，变得易于析出。
接着，加入Tris-HCl中和缓冲液降低pH值，恢复DNA天
然形态，并使DNA强度不受影响。
4.去除杂质
通过高速离心将DNA沉淀下来，将上清液与DNA分离。
可以采用氯仿提取法以去除蛋白质和其他杂质，专用的富集试剂和离心柱可做更细致的纯化。
5.精华DNA
通过酒精沉淀法或硅胶柱层析法纯化DNA。
酒精沉淀法适用于大量DNA纯化，但对于大片段、GC富集的DNA适用。
硅胶柱层析法适用于小规模、高质量、片段少的DNA纯化，但成本稍高，操作复杂。
总之，SDS碱裂解法是一种快速，简单的质粒DNA提取方法。
由于其便捷的操作和高质量的DNA回收率，它已被广泛应用于基因工程和分子生物学等领域。
质粒dna提取的方法
质粒dna提取的方法
提取质粒DNA的常用方法主要有：
1. 碱裂解法：将含有质粒DNA的细菌株进行裂解，使细菌质粒DNA与蛋白质分离。
一般使用碱性裂解缓冲液（如0.2 M NaOH）和含有细菌裂解酶（如SDS）的胰酶溶液进行裂解，然后使用中性盐溶液（如3 M醋酸钠）进行酸性沉淀，最后通过离心分离沉淀的质粒DNA。
2. 除菌剂法：使用含有除菌剂（如SDS）的裂解缓冲液直接裂解细菌细胞，使质粒DNA与细菌蛋白质分离。
然后使用物理方法（如离心）分离DNA和蛋白质，最后使用醋酸盐沉淀法分离质粒DNA。
3. 膜裂解法：将含有质粒DNA的细菌株均匀涂在含有质粒DNA结合断裂物的特殊膜上，经裂解后，膜上会形成质粒DNA的斑点。
然后使用洗脱缓冲液将质粒DNA从膜上洗脱，得到纯化的质粒DNA。
4. 商业化质粒DNA提取试剂盒：市面上有各种质粒DNA提取试剂盒可供选择，这些试剂盒能够提供简便、快速、高产量且高质量的质粒DNA纯化方法。
根据试剂盒的不同，步骤和原理会有所区别。
不同的方法适用于不同的实验目的和样品类型，请根据具体情况选择合适的提取方法。
碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法提取质粒DNA实验原理碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。
碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
一、材料含pUC19质粒的大肠杆菌，1.5ml塑料离心管, 离心管架，枪头及盒、卫生纸。
二、设备微量移液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱，等。
三、试剂准备1、LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。
第二课_碱裂解法小量提取质粒DNA
第二课_碱裂解法小量提取质粒DNA
01 实验材料
•含适量抗生素的LB培养基
•含质粒的细菌克隆
•葡萄糖/Tris/EDTA (GTE)溶液
•NaOH/SDS溶液
•乙酸钾溶液，pH 4.8
•95%和70%乙醇
•TE缓冲液
02 实验步骤
1) 接种一个单菌落于5 ml无菌LB培养液中，在37℃
培养至饱和状态（过夜)。
2) 取1.5 ml培养液以最大转速离心20 s。
弃上清。
3)沉淀用100 μl GTE溶液彻底重悬并于室温静置5 min。
4)加入200 μl NaOH/SDS溶液，用指头敲击管壁混匀，于冰上放置5 min。
5）加入150 μl 乙酸钾溶液，在涡旋混合器上振荡2s
混匀，于冰上放置5 min。
6）离心3 min，然后吸取上清液移入干净的微量离心管中，加0.8 ml 95%乙醇，于室温静置2 min。
7)室温离心1 min，弃上清，用1 ml 70%的乙醇清洗沉淀，然后真空干燥。
8)沉淀用30 μl TE缓冲液重溶，于4℃短期保存，于-20℃或-70℃长期保存，取2.5～5 μl进行酶切分析。
如有必要，在酶切反应液中加入 1 μl 10 mg/ml RNA酶溶液（不含DNA酶)以去除污染的RNA。
碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法
1、取1.5ml培养液倒入1.5ml离心管中，4℃下12000g离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。
3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中（需剧烈振荡），室温下放置5-10分钟。
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒离心管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴5分钟。
5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，冰浴中5-10分钟，4℃下12000g离心5-10分钟。
6、上清液移入干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1），振荡混匀，4℃下12000g离心5分钟。
7、将水相移入干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。
8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心5-10分钟。
9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。
10、将沉淀溶于20μl STE缓冲液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，储于-20℃冰箱中。
[注意]1.提取过程应尽量保持低温。
2.提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量除干净需多次抽提。
3.沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。
沉淀DNA也可用异丙醇（一般使用等体积），且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。
碱裂解法提取质粒实验报告
一、实验目的1. 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和操作步骤。
2. 熟悉实验过程中所使用的仪器和试剂。
3. 学习质粒DNA的纯化和检测方法。
二、实验原理碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法，其原理基于质粒DNA与染色体DNA在变性和复性过程中的差异。
在强碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
而质粒DNA由于具有共价闭合环状结构，其氢键断裂后，两条互补链仍保持一定程度的结合。
当pH值调节至中性时，质粒DNA能够迅速复性，而染色体DNA则不能复性，形成缠连的网状结构。
通过离心，可以将复性的质粒DNA与未复性的染色体DNA及其他杂质分离开。
三、实验材料1. 仪器：恒温摇床、台式离心机、微量离心管、移液器、电泳仪、凝胶成像系统等。
2. 试剂：LB液体培养基、含质粒的大肠杆菌、溶液I（50 mmol/L葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，2 mg/mL溶菌酶）、溶液II（200 mmol/L NaOH、1% SDS）、溶液III（3 mol/L NaAc，pH 4.8）、TE缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，1 mmol/L EDTA）、无水乙醇、70%乙醇、琼脂糖、溴化乙锭（EB）等。
四、实验步骤1. 将含质粒的大肠杆菌接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养。
2. 取适量菌液，8000 rpm离心2分钟，收集菌体。
3. 将菌体沉淀用溶液I重悬，加入溶菌酶溶液，室温放置10分钟。
4. 加入溶液II，混匀，65℃水浴10分钟。
5. 加入溶液III，混匀，室温放置5分钟。
6. 12,000 rpm离心10分钟，收集上清液。
7. 向上清液中加入等体积的无水乙醇，混匀，室温放置15分钟。
8. 12,000 rpm离心10分钟，收集沉淀。
9. 用70%乙醇洗涤沉淀，12,000 rpm离心5分钟。
10. 弃去洗涤液，将沉淀溶解于TE缓冲液中。
质粒DNA的提取（碱裂解法）
质粒DNA的提取（碱裂解法）实验原理：碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH 值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。
通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
提取步骤：1.吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥2.加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬浮。
此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率3.加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。
这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
4.加入150μL solutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒），使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀5.4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL离心管中6.加入6μL 10μgl/μL的RaseA，混匀，37℃温浴30min。
7.等体积TriS饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中8.等体积氯仿:异戊醇(24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中9.加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇，冰浴0.5-1h，沉淀双链 DNA。
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实验一碱裂解法抽提质粒DNA
[实验原理]
质粒是存在于染色体外的小型双链环状DNA，大小在1-200kb之间，能在宿主菌中自主复制。
宿主细胞中质粒的拷贝数各有不同，一种是低拷贝数的，每个细胞仅含有一个或几个质粒分子，称为“严紧型”复制的质粒，另一类高拷贝的质粒，拷贝数可达到20个以上，这种类型称为“松弛型”复制的质粒。
质粒能编码一些遗传性状，如抗药性（氨苄青霉素、四环素等抗性），利用这些抗性可以对宿主菌或重组菌进行筛选。
质粒作为基因工程载体必须具备以下条件（1）复制子（ori）：一段具有特殊结构的DNA序列；（2）有一个或多个便于检测的遗传表型，如抗药性、显色表型反应等；（3）有一个或几个限制性内切酶位点，便于外源基因片段的插入；（4）适当的拷贝数。
制备质粒载体是分子生物学的常规技术。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
[实验目的]
1、掌握碱裂解法抽提质粒DNA的原理和方法。
2、掌握紫外吸收光谱法测定核酸含量的原理和方法。
[实验步骤]
1、试剂配制
（1）LB培养液
10 g Tryptone，5 g Yeast Extract，10 g NaCl，双蒸水定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存。
（2）LB平板培养基
在LB液体培养基中加入琼脂粉15g，高压灭菌，冷却至45℃左右时倒平皿，4℃保存。
（3）LA平板培养基
待LB液体培养基冷却至45℃左右加入Amp (100μg/mL)，摇匀后倒平皿，4℃保存。
（4）溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),10 mmol/L EDTA (pH8.0), 配制200ml。
取葡萄糖（C
6H
12
O
6
.H
2
O）1.982 g，双蒸去离子水160 ml，0.5 mol/L EDTA 4ml，
1 mol/L Tris-HCl(pH8.0) 5 ml，定容至200 ml，高压灭菌后4℃保存。
（5）溶液II：0.2 mol/L NaOH, 1%SDS。
配制100 ml，现用现配。
10 mol/L NaOH 2 ml，双蒸去离子水80 ml，10%SDS 10 ml，最后用双蒸去离子水定容至100 ml，室温保存。
（6）溶液III：配制100 ml。
5 mol/L 乙酸钾 60 ml，冰乙酸11.5 ml，双蒸去离子水28.5 ml。
（7）5 mol/L 乙酸钾（200 ml）
乙酸钾98.14 g，溶解于160 ml双蒸去离子水中，搅拌溶解后定容至200 ml。
（8）3 mol/L 乙酸钠（NaAc）（pH5.2)
取乙酸钠（CH
3COONa.3H
2
O) 204.1g，溶解于200 ml双蒸去离子水中，用冰
乙酸调pH5.2，双蒸去离子水定容至500 ml，高压灭菌后4℃保存。
（9）10 mol/L NaOH溶液（100 ml）
NaOH晶体40 g，加水至100 ml。
（10）10%SDS
称取SDS 10g，溶解于80 ml水中，68℃助溶，加数滴1 mol/L HCl调pH7.2,定容至100 ml。
（11）0.5 mol/L EDTA（pH8.0) （100 ml）。
Na
2EDTA.2H
2
O 18.61 g, H
2
O 70 ml，边搅拌边加入NaOH固体调节pH，接近
pH8.0时才充分溶解，大约需NaOH 2g。
最后加水至100 ml。
（12）TE缓冲液（pH8.0）（100 ml）
10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。
2、细菌的培养
（1）配制LB液体，在琼脂糖平板培养基上划线培养出单菌落（37℃，16-20小时）。
（2）在灭菌过的10 ml玻璃培养管中加入3 ml LA液体培养基、以及3微升Amp (100 ug/ml)，挑取单菌落至培养基中。
将培养管置于摇床中，３７℃振摇过夜(200-250 rpm,16-18小时)。
3、质粒的提取
（1）吸取1.5毫升菌液至1.5 ml Eppendorf离心管中，3 000 rpm离心3分钟，弃上清液。
（2）加上1.5毫升菌液，重复操作（１）。
（3）用移液器尽可能除去上清液，加入150微升溶液Ｉ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。
（4）加入250微升溶液Ⅱ,缓慢地上下翻转离心管约10次，混合均匀。
室温下放置５分钟。
（5）加入200微升溶液Ⅲ，上下翻转离心管约10次，混合均匀，冰浴10分钟。
４℃，14,000 rpm离心5分钟。
（6）用移液器将上清液转移到新的1.5 ml Eppendorf离心管中，加入１倍体积酚／氯仿抽提，14 000 rpm离心５分钟。
（7）重复步骤（6）1次。
（8）移取上清液（400－500微升），加入2倍体积无水乙醇、0.1倍体积3 mol/L 醋酸钠，置于－20℃冰箱30分钟。
（9）14 000 rpm 离心10分钟，尽量去掉酒精。
（10）用0.5 ml 70％酒精洗DNA沉淀１次，离心２分钟，尽量去掉酒精，风干１０分钟。
（11）加50微升TE缓冲液溶解DNA沉淀，然后加入１微升RNase，37℃过夜，－20℃保存。
4、DNA浓度测定
（1）标准曲线的制作
分别用蒸馏水将DNA标准品配制成浓度为5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg/mL的DNA溶液，于260 nm处测定光吸收值，在电脑中用软件制作标准曲线。
（2）样品测定
取20微升质粒DNA置一干净的离心管中，加入2 980微升蒸馏水稀释。
然后用紫外分光光度计测定260nm和280nm的光吸收值。
计算DNA浓度，并通过
OD
260/OD
280
比值评估样品纯度。
[思考题]
1、在质粒提取过程中，如何避免染色体DNA污染？为什么？
2、紫外吸收法测定核酸含量和纯度的原理是什么？
3、提纯的质粒DNA用琼脂糖电泳检查时为什么会出现不同的电泳条带？质粒DNA 条带有“拖尾”现象是由什么原因造成的，对以后的外源基因克隆可能产生什么影响？为什么？。