膳食纤维含量测定方法

酶-重量法

1.原理：

样品分别用α-淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶进行酶解消化以去除蛋白质和可消化的淀粉。总膳食纤维（TDF）是先酶解，然后用乙醇沉淀，再将沉淀物过滤，将TDF残渣用乙醇和丙酮冲洗，干燥称重。不溶性和可溶性膳食纤维（IDF和SDF）是酶解后将IDF过滤，过滤后的残渣用热水冲洗，经干燥后称重。SDF是将上述滤出液用4倍量的95%乙醇沉淀，然后再过滤，干燥，称重。 TDF、IDF和SDF量通过蛋白质、灰分含量进行校正。

2.适用范围

AOAC991.43 本方法适用于各类植物性食物和保健食品。

3.仪器

3.1烧杯：400或600ml高脚型。

3.2 过滤用坩埚：玻料滤板，美国试验和材料学会（ASTM）40-60μm，Pyrex 60ml （Corning No.36060 buchner，或同等的）。如下处理：

（1）在灰化炉525℃灰化过夜。炉温降至130℃以下取出坩埚。

（2）用真空装置移出硅藻土和灰质。

（3）室温下用2%清洗溶液浸泡1小时。

（4）用水和去离子水冲洗坩埚；然后用15ml丙酮冲洗然后风干。

（5）在干燥的坩埚中加0.5g硅藻土，在130℃烘干恒重。

（6）在干燥器中冷却1小时，记录坩埚加硅藻土重量，精确至0.1mg。

3.3 真空装置：

（1）真空泵或抽气机作为控制装置。

（2） 1L的厚壁抽滤瓶。

（3）与抽滤瓶相配套的橡皮圈。

3.4振荡水浴箱：

（1）自动控温使温度能保持在98±2℃。

（2）恒温控制在60℃。

3.5 天平：分析级，精确至±0.1mg。

3.6马福炉：温度控制在525±5℃。

3.7干燥箱：温度控制在105和130±3℃。

3.8干燥器：用二氧化硅或同等的干燥剂。干燥剂两周一次在130℃烘干过夜。

3.9 PH计：注意温控，用pH

4.0、7.0和10.0缓冲液标化。

3.10 移液管及套头：容量100μl和5ml。

3.11 分配器或量筒：

（1） 15±0.5ml，供分配78%的乙醇，95%的乙醇以及丙酮。

（2） 40±0.5ml，供分配缓冲液。

3.12. 磁力搅拌器和搅拌棒。

4. 试剂

全过程使用去离子水，试剂不加说明均为分析纯试剂

4.1 乙醇溶液：

（1） 85%：加895ml95%乙醇在1L量筒中，用水稀释至刻度。

（2） 78%：加821ml95%乙醇在1L量筒中，用水稀释至刻度。

4.2 丙酮：

4.3 供分析用酶：在0-5℃下储存。

（1）热稳定α-淀粉酶溶液：Cat. No. A3306，Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO63178，或 Termamyl 300L，Cat. No. 361-6282，Novo-Nordisk，Bagsvaerd，Denmark，或等效的酶。（2）蛋白酶：Cat. No. P3910，Sigma Chemical Co.，或等效的。当天用MES/TRIS缓冲液中现配50mg/ml酶溶液。

（3）淀粉葡糖苷酶溶液：Cat. No. AMG A9913，Sigma Chemical Co.，或等效的。

4.4 硅藻土：酸洗（Celite 545 AW，No.C8656，Sigma Chemical Co.，或等效的）。

4.5 洗涤液：两者挑一。

（1）铬酸：120g重铬酸钠Na2Cr2O7·2H2O，1000ml蒸馏水和1600ml浓硫酸。

（2）实验室用液体清洁剂，预备急需清洗的（Micro，International Products Corp.，Trenton，NJ08016，或等效的）。用水配制2%溶液。

4.6 MES-TRIS缓冲液：0.05mol/L，温度在24℃时pH值为8.2。

（1） MES：2-（N-吗啉代）磺酸基乙烷（No.M-8250，Sigma Chemical Co.或等效的）。（2） TRIS：三羟（羟甲基）氨基甲烷（No.T-1503，Sigma Chemical Co.或等效的）。

在1.7L的蒸馏水中溶解19.52gMES和12.2gTRIS，用6mol/L NaOH调pH到8.2，用水定容至2L。（注意：24℃时的pH为8.2，但是，如果缓冲液温度在20℃，pH就为8.3，如果温度在28℃，pH为8.1。为了使温度在20-28℃之间，需根据温度调整pH值。）

4.7 盐酸溶液：0.561mol//L，加93.5ml6mol/L盐酸到700ml水中，用水定容至1L。

5. 操作方法

5.1. 样品制备：

（1）固体样品：如果样品粒度＞0.5mm，研磨后过0.3-0.5mm（40-60目）筛。

（2）高脂肪样品：如果脂肪含量＞10%，用石油醚去脂。每克样品用25ml，每次提取完静置一会儿再小心将烧杯倾斜，慢慢将石油醚倒出，共洗三次。

（3）高碳水化合物样品：如果样品干重含糖＞50%，用85%乙醇去除糖份，每克样品每次10ml，共洗三次轻轻倒出，然后在40℃烘箱中不时翻搅干燥过夜，并研磨过0.5mm筛。5.2. 样品消化

（1）准确称取双份1.000±0.005g样品（M1和M2），置于高脚烧杯中。

（2）在每个烧杯中加入40ml MES-TRIS缓冲液，在磁力搅拌器上搅拌直到样品完全分散。（防止团块形成，使受试物与酶能充分接触）。

（3）用热稳定的淀粉酶进行酶解处理：加100μl热稳定的淀粉酶溶液，低速搅拌。用铝箔片将烧杯盖住，在95-100℃水浴中反应30分钟。（起始的水浴温度应达到95℃）。

（4）冷却：所有烧杯从水浴中移出，凉至60℃。打开铝箔盖，用刮勺将烧杯边缘的网状物以及烧杯底部的胶状物刮离，以使样品能够完全的酶解。用10ml蒸馏水冲洗烧杯壁和刮勺。（5）用蛋白酶进行酶解处理：在每个烧杯中各加入100μl蛋白酶溶液。用铝箔盖住，在60℃持续摇动反应30分钟（开始时的水浴温度应达60℃），使之充分反应。

（6） pH值测定：30分钟后，打开铝箔盖，搅拌中加入5ml0.561mol/L HCL至烧杯中。60℃时用1mol/L NaOH溶液或1mol/L HCL溶液调最终pH为4.0-4.7。（注意：当溶液为60℃时检测和调整pH，因为在较低温度时pH会偏高。）

（7）用淀粉葡糖苷酶溶液酶解处理：搅拌同时加100μl淀粉葡糖苷酶溶液。用铝箔盖住，在60℃持续振摇反应30分钟，温度应恒定在60℃。

5.3 测定

5.3.1.总的膳食纤维测定

（1）用乙醇沉淀膳食纤维：在每份样品中，加入预热至60℃的95%乙醇225ml，乙醇与样品的体积比为4∶1。室温下沉淀1小时。

（2）过滤装置：用15ml78%乙醇将硅藻土湿润和重新分布在已称重的坩埚中。用适度的抽力把坩埚中的硅藻土吸到玻板上。