基因表达载体构建

一、简述原核生物和真核生物基因表达调控的异同点，并说明基因表达调控与基因工程表达载体构建的关系。

1．原核生物和真核生物基因表达调控的共同点：

（1）结构基因均有调控序列；

（2）表达过程都具有复杂性，表现为多环节。

2．不同点：

原核生物：（1）RNA聚合酶只有一种，其σ因子决定RNA聚合酶识别特异性；（2）操纵子模型的普遍性；（3）阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性（负性调节占主导）；（4）转录和翻译偶联进行；（5）转录后修饰、加工过程简单；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。

真核基因表达调控特点：（1）RNA聚合酶有三种，分别负责三种RNA转录，每种RNA聚合酶由约10个亚基组成；（2）活性染色质结构发生变化；（3）正性调节占主导；（4）转录和翻译分隔进行；（5）转录后修饰、加工过程较复杂；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。

3.由于基因的表达调控受到多种因子的影响，而构建基因工程表达载体时多是将真和生物的目的基因转入到原核生物载体上表达，所以应注意以下几点：

（1）外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。其遗传密码不得缺失、遗漏、或错位及错码。否则会导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基因序列内部应不含两端酶切位点的识别序列。

（2）插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下，也就是使原核的RNA 聚合酶能够识别插入的基因。

（3）外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录（如无内含子），转录后的mRNA 在菌体必须相当稳定，并且能有效地进行翻译，转译的蛋白分子在菌体内不致于受菌体蛋白酶的降解。

二、目的基因功能和表达分析的意义是什么？目的基因功能与表达分析的主要环节有哪些？各有什么目的？这些环节与基因工程的主要环节有什么异同？

1．意义：克隆的目的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能及基因表达调控的机理，明了其利用价值和途径。

2．主要环节：

（1）目的基因的获得和加工：将得到的目的基因通过加工以期能连接到表达载体上并稳定表达；

（2）载体的选择与加工：根据不同的实验目的和实验条件选择不同的载体，并

对载体进行改造加工，使其满足高效连接的需要；

（3）载体与目的基因的连接：即通过连接反应，将载体和目的基因连接形成重组DNA；

（4）重组子导入受体细胞：通常将重组DNA导入大肠杆菌感受态进行扩增和筛选，以期得到大量的单一重组子，便于利用；

（5）阳性克隆的筛选与鉴定：在连接产物中既有载体和目的基因的连接，也有载体自连、目的基因自连以及为发生连接的载体和目的基因，在转化过程中上述各种分子都会进入宿主细胞，所以需通过筛选鉴定出阳性克隆。

3．异同：目的基因功能与表达分析主要是为了研究目的基因的表达情况以期为基因工程应用打下基础；基因工程则是将目的基因应用于实验对象上以期获得相应的产物或者实验现象。

根癌农杆菌Ti质粒有什么特点？如何构建农杆菌Ti表达质粒载体？

1.Ti质粒可分为4 个功能区域：①T-DNA区(transferred-DNA region)：T-DNA 是根癌农杆菌侵染植物细胞时从Ti 质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA；②Vir 区(virulence region)：Vir 区上的基因能激活T-DNA 转移，使根癌农杆菌表现出毒性；③Con 区(regions encoding conjugations，接合转移编码区)：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移；

④Ori区(origin of replication，复制起始区)：Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我复制。

2.农杆菌Ti表达质粒载体的构建

（1）野生型Ti 质粒的改造

野生型Ti 质粒的改造，主要包括以下几个方面：①删除T-DNA上的tms、tmr 和tmt 基因；②加入大肠杆菌复制起点和选择标记基因，构建根癌农杆根瘤菌-大肠杆菌穿梭质粒，便于重组分子的克隆与扩增；③引入植物细胞的筛选标记基因，便于转基因植物细胞的筛选；④引入植物基因的启动子和polyA化信号序列；⑤插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆；⑥除去Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度。

（2）中间载体的表达构建

为了使Ti 质粒成为有效的外源基因导入载体，科学家们将T-DNA片段克隆进大肠杆菌的质粒，并插入目的基因，而后通过接合转移将目的基因引入到根癌农杆菌的Ti 质粒。带有重组T-DNA的大肠杆菌衍生载体称为中间载体。

在中间载体中加上能在植物细胞中表达的各种启动子，主要包括组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子三类，它们可使外源基因在植物细胞中表达；

当启动子与显性选择标记基因及报告基因连接，构成嵌合基因时，这些标记基因同样能表达，从而可提供用于筛选和鉴定的表型。

（3）植物表达载体的构建

中间表达载体不能将外源基因转化进植物细胞，因此，必须将中间表达载体引入到上述已改造的受体Ti 质粒中，并构建成能侵染植物细胞的基因转化载体(它是由两种以上质粒构成的复合型载体，故称之为载体系统)，才能在植物基因转化中应用。为利用根癌农杆菌的Ti 质粒，发展了一元载体系统和双元载体系统。一元载体系统是指首先将目的基因插入到中间表达载体上，筛选出含有目的基因的重组分子，然后将重组质粒转化到根癌农杆菌中，重组质粒与Ti 质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti 质粒上，用于侵染植物细胞。T-DNA 重组分子就可整合到植物细胞染色体DNA 上。最后利用植物选择标记基因筛选转化细胞。

双元载体系统是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的系统。其中之一是含有T-DNA转移所必需的Vir 区段质粒，它缺失或部分缺失T-DNA序列。它的主要作用是表达毒蛋白，激活T-DNA 的转移，故称为辅助Ti 质粒(helper Ti plasmid)；另一个则是含有T-DNA的质粒，一般作为目的基因的载体，由于其分子量较小，故称为微型质粒(mini-Ti plasmid)。它是一种寄主范围广泛的DNA转移载体质粒。它既含有大肠杆菌复制起始位点，又含有根癌农杆菌复制起始位点，实际上是一种大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒。这两种质粒在单独存在的情况下，均不能诱导植物产生冠瘿瘤。若根癌农杆菌细胞内同时存在这两种质粒时，便可获得正常诱导肿瘤的能力。因此，含有双元载体的根癌农杆菌细胞浸染植物时，就可以将含有目的基因的T-DNA整合进植物基因组中。

目前以T-DNA转化植物细胞的标准方法大多采用Ti 质粒介导的双元载体系统。首先将目的基因插入到微型质粒，含有目的基因的重组微型质粒转化大肠杆菌后，再导入携带辅助Ti 质粒的根癌农杆菌中，经筛选后直接感染植物细胞。根癌农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti 质粒上的vir基因，随后将微型质粒上的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。

三、植物病毒表达载体有什么特点？有哪些应用？

1．植物病毒表达载体的特点：

（1）病毒增殖水平较高，可使伴随的外源基因高水平表达；

（2）病毒增殖速度快, 外源基因在很短时间可达最大量的积累；

（3）病毒基因组小，易于进行遗传操作，大多数植物病毒可以通过机械接种感染植物，适于大规模商业操作；