Modfit软件分析细胞周期操作方法
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。
↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管↓提前一天网上预约↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。
↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱↓液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）↓荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析——Flowjo 软件分析图片拷贝：直接Ctrl+CFCM-DNA 量分析 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量分布组方图分为三部分，即 G0/1、S 、G2M 。
流式细胞术的应用-周期检测
细胞周期的检测目录一、背景知识二、实验设计原则三、实验操作步骤四、实验结果分析一、背景知识1、细胞周期：G0/G1二倍体S二倍体---四倍体G2/M四倍体细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程。
共分为静止期(GO期)、DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)与分裂期(M期)。
在细胞周期的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。
通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以检测细胞周期。
2、细胞周期常用的核酸染料1.碘化丙啶(Propidium Iodide, PI) 是一种可以嵌合到双链DNA和RNA 的碱基对中，并与之结合的荧光染料，无碱基特异性。
其与双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。
细胞内的DNA被PI染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量的测定。
PI不能穿透细胞膜而被排斥在活细胞外，但是可以穿过破损的细胞膜而对核染色。
可用于区分活、死细胞。
利用这一特性，通常与Calcein-AM、Hoechst 33258或Hoechst 33342等活细胞荧光探针一起使用，同时对活细胞和死细胞染色和鉴定，用于细胞凋亡相关的研究。
也可以用作多重荧光染色的复染剂，兼容于各种细胞标记技术，包括直接或者间接的荧光抗体检测，mRNA原位杂交，细胞结构特异性的荧光探针检测法以及组织染色。
PI的单独染色也可以进行细胞周期的检测。
PI的摩尔吸光系数相对比较低，但是其具有足够大的斯托克斯频移来同时检测核酸DNA和荧光标记抗体，只需要使恰当的滤片。
PI适用于荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪以及荧光计分析。
2.7-氨基放线菌素(7-amino-actinomycinD，7-AAD) 是一种核酸染料。
它不能通过正常细胞膜。
7-AAD同PI有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品。
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。
↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管↓提前一天网上预约↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。
↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱↓液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）↓荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析——Flowjo 软件分析图片拷贝：直接Ctrl+CFCM-DNA 量分析 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量分布组方图分为三部分，即 G0/1、S 、G2M 。
脂肪干细胞的提取及鉴定
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。
取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L 氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
镜下计数，孵箱培养，24小时后第一次换液，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养：3.2.1操作步骤a．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一--PI法
组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一－－PI法schoman无论是肿瘤或其它正常新鲜组织均可用PI（碘化丙啶）的方法来检测，这是一种常见而且便宜的方法。
主要操作步骤如下：1、组织块用0.25%胰酶消化30min－1h。
2、200－400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液。
3、75％乙醇（－20度预冷）固定细胞1h。
4、加入PI（终浓度50ug／ml）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50ug／ml）1ml染色30min－1h。
5、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。
注意事项：1、组织消化后使细胞形成单个细胞悬液是本检测方法的关键。
如组织难以消化，可加入适量胶原酶。
另外，消化前，用剪刀将组织剪成小块也不要忘了。
2、细胞可尽量的多准备（at least 100 thousand），这样流式检测方便，结果可靠。
3、每次消化的时间等条件应尽量一致，否则使实验结果CV值偏大。
4、细胞用乙醇固定后可以访置48小时（4度保存）后检测，便于无法立即检测的实验者，对实验结果基本没有影响。
其它也有一些检测凋亡的方法，均有商品化试剂盒。
在此不赘述。
yanzishenyang：我看相关的说明：碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA 结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。
应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。
偶得细胞是用PI染色的，经过流氏细胞仪检测出现一个亚二倍体峰，是否能和坏死区别？因为偶用的作用细胞的蛋白本身可以造成细胞膜的损伤，所以PI可以进入细胞，这是否意味着我检测的结果无法区分凋亡和坏死？hdhdhd0000：用PI法识别凋亡时，有一种方法叫SUB-G1法，这种方法需要在染PI前加入适量的破膜剂（磷酸盐－枸橼酸盐缓冲盐），我们称之为PC液，它会让晚期凋亡所形成的DNA小碎片部分出膜而使胞内的DNA总含量减少，从而使流式上的DNA直方图的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是SUB－G1峰（凋亡峰）！用荧光2的面积做直方图可以清楚的看见凋亡峰，但是要区分APo和Nec需要少量的经验，而在荧光2高度图上，因为是用的是对数，所以可以把凋亡和坏死拉开，凋亡峰在不同的细胞周期特异性细胞凋亡时，都特异性的出现在10的2次方荧光道数处，坏死在10的1次方处，从而可以清楚的分清它们。
流式细胞术系列之-用ModFit软件分析DNA倍体和细胞周期
【临床意义 临床意义】 临床意义
• 发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断 发现癌前病变， • 在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用 在肿瘤的诊断、 • 在指导肿瘤化疗中的作用
乳腺癌DNA异倍体患者生存率
乳腺癌肿瘤细胞异倍 体患者长期生存率显 著下降
【临床病例】 临床病例】
AL 骨髓
Diploid: 46.75 % Dip G1: 97.54 % at 46.06 Dip G2: 0.58 % at 92.12 Dip S: 1.88 % G2/G1: 2.00 %CV: 2.26 Aneuploid 1: 47.55 % An1 G1: 93.05 % at 49.83 An1 G2: 0.00 % at 99.67 An1 S: 6.95 % G2/G1: 2.00 %CV: 2.13 DI: 1.08 Aneuploid 2: 5.70 % An2 G1: 94.97 % at 55.72 An2 G2: 5.03 % at 103.44 An2 S: 0.00 % G2/G1: 1.86 %CV: 4.52 DI: 1.21
• 倍体（Ploidy）： 倍体（ ）：原指染色体数目。流式中用来描述总的 ）： DNA含量。 • 二倍体细胞有正常细胞的DNA含量但不除外染色体异常。 • DI为1.9-2.1 的细胞为四倍体（CV为5%时）。在二倍体和四 倍体区域之外的统称异倍体。
结果分析
• CellQuest、WinMDI等软件均可以进行分析，但需要手 工进行参数统计和计算； • 推荐使用ModFit分析软件（分析如下：） • 1、打开软件； • 2、在FL2-W/FL2-A散点图中设定单个细胞门（R1）， 去除聚集细胞，必要时可以设两个门。 • 3、在FL2-A直方图中显示R1中细胞的DNA含量直方图 • 注：该软件可以自动分析，也可手动分析；可以分析 凋亡、异倍体、各期比例等；结果均自动计算。
Modfit分析细胞周期指南
Modfit分析细胞周期指南本指南只提供在guava流式细胞分析仪上使用细胞周期模块分析后产生的数据,其它请参阅产品使用说明书,本指南仅供参考。
一.概述细胞周期的概念:细胞由一次分裂结束到下一次分裂结束,都要经历相同的变化阶段(即G1→S→G2→M )周而复始地进行活动,细胞的这种生长、分裂循环即称为细胞周期(cell cyc1e)。
一个细胞周期包括有丝分裂期(M)与分裂间期(G1、S、G2)。
尽管在各种细胞中各期所占时间都不尽相同,但相对而言M期最短,S期却较长。
分裂间期:1 、G1期,前一次有丝分裂完成到S期开始。
各种与DNA复制有关的酶明显增多,线粒体、叶绿体、核糖体增多,内质网在更新扩大,高尔基体、溶酶体都增加,中心粒彼此分离、复制。
2、S期:DNA、组蛋白合成3、G2期, S期结束后到有丝分裂开始。
由上可以瞧出G2期、S期、M期反映了细胞的增殖活性,特别就是G2期、S期(因M期较短)。
因而,G2/M％+S％反映了细胞增殖能力。
二者有无差别要进行统计检验。
细胞周期阻滞:对于生殖细胞及保持增殖能力的细胞(如干细胞),由于细胞不断的增殖, 细胞总就是处于从G1 、S、G2 与M 期的连续的细胞周期中。
在细胞周期的各阶段, 细胞分别进行着DNA 复制、蛋白质合成及细胞分裂等重要的生理活动。
每一阶段都就是下一阶段的准备期, 真核细胞可以在启动下一个周期前监测与一个细胞周期顺利完成相关的生化事件,这包括各种体内外因素威胁下游事件进行时可逆地将细胞周期阻滞在特定的生理阶段的能力,而这种特定的生理阶段称为检定点(checkpoint) 。
只有前一阶段的生理活动完成后,才能通过称为检定点的阶段,进入周期的下一步,一些突发事件引发的细胞反应能影响驱动细胞周期前进的因子,从而使细胞周期停滞在检定点, 这被称为细胞周期阻滞(cell cycle arrest)。
比较相应的细胞G1 、S、G2 期差异有无统计学意义,才能说有无细胞周期阻滞。
【医药】PI染色检测细胞周期PROTOCOL(共3页)
【医药】PI染色检测细胞周期PROTOCOL共3页）PI染色检测细胞周期protocol1、离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。
2、加入预冷70聽醇，于4?固定过夜，或-20?长期固定（4?过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20?，有资料说-20?可以保存一个月，个人建议尽量在最短时间内检测，有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等最后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕，没有特地去比较保存时间对检测结果的影响）。
3、细胞染色离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mL RNase A, 0.2% Triton X-100）4? 避光孵育30 分钟（PI 我是直接用PBS配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNA酶现加，但有时不加发现对实验结果也没太大的影响）。
4、流式分析以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。
分析时，使用FL2-W和FL2-A显示，去除联体细胞，具体如下图。
-■- 9■-■---k-■-k^LZ-'RV细胞周期流式后一般分为 G0/G1,S,G2/M 期三部份，如果有凋亡，在 G0/G1期 前面有个凋亡峰（也称sub-G0期）,而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面 还有细胞碎片峰FWRS ”T ：i 畀 a?4 EFJfi •财 J IS 皿了 TVi 「，1 rv,- f “吓 OiDl>d 1 0£ CK? TDI ・G M Z9X*r JS 7C DI •谅：13.0? *41 9! 4S 钏.岂：5 5 i&t*L.ls >PIWH ：芒.殆戈 伽• |i*D 0 I? W吋 fl. 413 S "t J”-3 1心 % lF"T“rnW If, a i ev^>*^er-- i M 耳i 〔严 |c T "' h Ki C F± nN I £ - 3KS l.*O>结果解读G0/G1期细胞占总的61.2%,峰位于横座标的45.76G2/M 期占13.07，峰位于横座标的91.43S 期占25.73G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2）峰的变异系数为4.54%（好）细胞碎片为0.48%,细胞聚集体有0.06%。
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤(仅供参照)
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。
↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管↓提前一天网上预约↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。
↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱↓液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）↓荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析图片拷贝：直接Ctrl+C。
运用ModFit LT进行手动分析
运用ModFit LT进行手动分析如ModFit LT在自动分析过程中无法正确确定峰值的位置或样本的倍型，或者你希望自己选择分析的模式，那么你可以用手动分析来实现。
Φ在工具栏中点击File，选定所要分析的数据文件，单击OpenΦ选择用于DNA分析的参数：FL2-AΦ设门。
软件最多允许同时设两个门，点击Gate 1或2前的小方框，然后单击Define the Gate，选择合适的X轴和Y轴，将门移动到所要分析的细胞群上，单击OKΦ单击工具栏中的Mod键或选择Analysis菜单中的Choose Model在这个对话窗口中需要你来描述你所得到的样本的信息，比如说，样本的类型，有无异倍体等。
每一个有关的资料都会影响到最终分析模式的选择。
═>选择碎片拟合的模式：新鲜/冻存，石蜡切片，没有碎片（不进行碎片分析）；═>选择倍型：异倍体，二倍体，四倍体；═>若有异倍体，则须确定是一个还是两个异倍体；═>选择细胞聚集体分析模式：有聚集体，没有聚集体，或自动检测（软件自行判断有无需要拟合聚集体）；═>选择是否拟合二倍体的S期：如异倍体的G0/G1期峰与二倍体G0/G1期峰明显分开,我们对每一个细胞周期的S期都能够进行拟合，则选择Fit Diploid S；如异倍体的G0/G1期峰与二倍体G0/G1期峰靠得非常近，则选择No Diploid S；═>选择能否看得见明显的G2/M期峰：Visible G2/M，Indistinct G2/M（软件将自动把G2/M期峰的位置固定在两倍于G0/G1期峰的位置；═>选择是否拟合凋亡：Fit Apoptosis，No Apoptosis；═>选择有无标准参照物：No Standards，One Standard，Two Standards；═>根据这些资料，软件选择分析的模式并将其显示在对话窗的下部；═>单击OK确认并关掉对话窗。
细胞周期分析软件modfitlt操作说明.doc
4. 应用ModFitLT 软体分析DNA 直方图4.1 概述ModFitLT 是由美国VeritySoftwareHouse 公司设计，专门用於流式细胞术中进行细胞周期分析的软体。
它通过对DNA 含量直方图进行曲线拟合，能快速计算出分析细胞周期各时相细胞的含量、G1/S/G2M 细胞的百分比，并测量肿瘤细胞的DNA 指数DNAIndex、及析凋亡细胞亚二倍体所占的比例。
此外，2.0 版本还增加了“同步化分析”和“增殖分析”的功能，可分别进行同步化细胞和增殖细胞的研究SynchronizedorDrug‐PerturbedCells，对於研究凋亡细胞生物学与药理的同仁，实为一大利器。
本软体有苹果电脑与PCWin98/NT 两种版本，皆内建有65 种数学模型，可弹性运用以因应不同的DNA 直方图分析。
从事直方图分析时ModiFitLT 软体允许使用者应用四种基本方式操作:1AutomaticAnalysis2ManualAnalysis3Synchronization 精灵4Proliferation 精灵。
以下之范例练习可让您熟悉ModiFitLT 软体的四种基本分析功能，我们将以四个已储存之数据档案来练习DNA 直方图之分析。
这四个数据档案之档名及样品资料如下：档案名样品SampleLM.FCS4.2 自动分析1. 从苹果功能表下进入ModFitLT 以启动该软体，并在随后出现的对话方框上按OK 。
ModFitLT 软体有一套S 期评估功能，可以依照您所制定的范围，评估该样品中SPhase 比例是属於少量、中度或多量的，并在报告中显示出可信度。
软体若还没有被实验室其他人设置过，那麽当你进行分析时，将会出现一个关於S 期评估的询问方框，提供了3 个选项：马上设置S 期的临界值；以后再提醒我设置S 期的临界值；不需要启动S 期评估这项功能。
若你需要这项评估，你必须输入你们实验室获得的具有统计意义的各种组织的二倍体或者异倍体的S 期的临界值，如没有，则不必启动这项功能。
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。
↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管↓提前一天网上预约↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。
↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱↓液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）↓荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析——Flowjo 软件分析图片拷贝：直接Ctrl+CFCM-DNA 量分析 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量分布组方图分为三部分，即 G0/1、S 、G2M 。
用ModFit软件分析DNA倍体和细胞周期
• 影响CV的因素主要包括两方面： 仪器因素（如液流、光路、机器 调试等）和样本制备及染色过程 对标本的人为影响。
DNA检测的常用术语
2. DNA指数（DNA index，DI）和倍体（Ploidy）
• DI指的是肿瘤样本G0/G1峰的平均道数与人正常二倍体G0/G1 峰的平均道数之间的比值。
• DI为1 意味着二倍体（2c）（一般正常范围为0.9~1.1）。
• 倍体（Ploidy）：原指染色体数目。流式中用来描述总的DNA 含量。
• 二倍体细胞有正常细胞的DNA含量但不除外染色体异常。 • DI为1.9-2.1 的细胞为四倍体（CV为5%时）。在二倍体和四
倍体区域之外的统称异倍体。
结果分析
Aneuploid 1: 47.55 % An1 G1: 93.05 % at 49.83 An1 G2: 0.00 % at 99.67 An1 S: 6.95 % G2/G1: 2.00 %CV: 2.13 DI: 1.08
Aneuploid 2: 5.70 % An2 G1: 94.97 % t 55.72 An2 G2: 5.03 % at 103.44 An2 S: 0.00 % G2/G1: 1.86 %CV: 4.52 DI: 1.21
MM 骨髓
Diploid: 64.50 % Dip G1: 92.45 % at 49.24 Dip G2: 2.30 % at 98.48 Dip S: 5.26 % G2/G1: 2.00 %CV: 3.21
Aneuploid 1: 35.50 % An1 G1: 97.69 % at 58.53 An1 G2: 0.00 % at 123.89 An1 S: 2.31 % G2/G1: 2.12 %CV: 3.14 DI: 1.19
用ModFit软件分析DNA倍体和细胞周期
对未来研究的建议
深入研究DNA倍体异质性的机制
DNA倍体异质性是肿瘤细胞的一个重要特征，但目前对其产生机制仍不清楚。未来研究可以进一步探讨DNA倍体异 质性的产生原因和生物学意义。
比较不同组织或个体的DNA倍体分布
为了更好地理解DNA倍体分布的生物学意义，未来研究可以比较不同组织或个体的DNA倍体分布，以寻找可能的组 织或个体特异性模式。
可视化效果好
modfit软件提供了丰富的可 视化工具，能够将分析结果 以图表、图像等形式直观地 呈现出来。
适用范围广
该软件适用于各种不同类型 的细胞，包括肿瘤细胞、正 常细胞等。
实际应用案例分析
在肿瘤研究中的应用
通过分析肿瘤细胞的DNA倍体和细胞 周期，可以了解肿瘤细胞的增殖状态、 恶性程度及对治疗的反应等，有助于 肿瘤的诊断和治疗。
理解modfit软件在分析中的作用
modfit软件是一款专门用于分析细胞周期和DNA倍体数据的软件，通过该软件可以对细胞周期和DNA倍体进行 定性和定量分析，从而对细胞的生长和增殖状态进行评估。
modfit软件简介
软件功能
modfit软件可以对细胞周期和DNA倍体数据进行模型拟合，提供定性分析和定量分析两种方式 ，支持多种图像处理和数据分析功能。
结合其他技术进行深入分析
为了更全面地了解细胞的生物学特性，未来研究可以结合其他技术，如基因表达分析、蛋白质组学等， 对细胞进行更深入的分析。
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感谢您的观看
用户社区
建立更活跃的用户社区，促进用户之 间的交流和分享经验，推动modfit软
件的持续发展。
05 结论
主要发现
要点一
DNA倍体的分布
PI染色检测细胞周期试验步骤
.
染色检测细胞周期：protocolPI）消化收集对数生长期细胞（加热处含EDTA1、收集细胞：胰酶（*6个），吸取旧10理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×（根据培养皿大小决定量，PBS培养基到一个新离心管里；少量常温也要收集到上述离PBSPBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的然后胰酶消化心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS】；而不是成片脱落）显微镜下观察细胞呈单个，（注意一定要消化完全，后利用旧培养基中和胰酶；离心(1000r/300g 5min)收集细胞沉淀。
PBS清洗细胞两次。
2、用预冷的重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮预冷的PBS3、固定细胞：用0.5ml乙醇终无水乙醇(1.2ml预冷的99.7%成单细胞，再将重悬细胞加入浓度70%)，吹打混匀以免细胞团聚，4℃固定至过夜。
2H1.84、细胞染色：离心（1000r/300g）收集固定的细胞，以5min才把细胞离mL的7000rpm(第一次实验时用PBS 洗细胞一次，离心1再次获取细胞沉淀后加入但最后流式结果显示细胞没有碎)心下来，30避光染色lPI，最后加入400μ30minlRNaseA00μ于37℃水浴℃均可）min（常温或4P用染色剂（据样本数，500uL 【有的试剂盒说明是：每个样本加入Triton 、A PI BS临时配好总量，其中50ug/ml、RNase 100ug/mL 染色30分钟】避光4）X-100
0.2% ℃、流式分析52
/ 1
.
结果用细胞万个细胞，2-3以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数
去FL2-A显示，和使用分析。
周期拟和软件ModFit分析时，FL2-w 除联体细胞。
2
/ 2。
ModFitLT细胞周期的分析软件
Re:[原创]ModFit LT----细胞周期的分析软件二、运用ModFit LT进行手动分析如ModFit LT在自动分析过程中无法正确确定峰值的位置或样本的倍型，或者你希望自己选择分析的模式，那么你可以用手动分析来实现。
在工具栏中点击File，选定所要分析的数据文件，单击Open选择用于DNA分析的参数：FL2-A设门。
软件最多允许同时设两个门，点击Gate 1或2前的小方框，然后单击Define the Gate，选择合适的X轴和Y轴，将门移动到所要分析的细胞群上，单击OK 单击工具栏中的Mod键或选择Analysis菜单中的Choose Model在这个对话窗口中需要你来描述你所得到的样本的信息，比如说，样本的类型，有无异倍体等。
每一个有关的资料都会影响到最终分析模式的选择。
═>选择碎片拟合的模式：新鲜/冻存，石蜡切片，没有碎片（不进行碎片分析）；═>选择倍型：异倍体，二倍体，四倍体；═>若有异倍体，则须确定是一个还是两个异倍体；═>选择细胞聚集体分析模式：有聚集体，没有聚集体，或自动检测（软件自行判断有无需要拟合聚集体）；═>选择是否拟合二倍体的S期：如异倍体的G0/G1期峰与二倍体G0/G1期峰明显分开,我们对每一个细胞周期的S期都能够进行拟合，则选择Fit Diploid S；如异倍体的G0/G1期峰与二倍体G0/G1期峰靠得非常近，则选择No Diploid S；═>选择能否看得见明显的G2/M期峰：Visible G2/M，Indistinct G2/M（软件将自动把G2/M期峰的位置固定在两倍于G0/G1期峰的位置；═>选择是否拟合凋亡：Fit Apoptosis，No Apoptosis；═>选择有无标准参照物：No Standards，One Standard，Two Standards；═>根据这些资料，软件选择分析的模式并将其显示在对话窗的下部；═>单击OK确认并关掉对话窗。
细胞周期实验：从protocol到数据分析（附免费软件）
细胞周期实验：从protocol到数据分析（附免费软件）细胞周期，是指细胞从⼀次分裂完成开始到下⼀次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。
细胞间期⼜分为C0期、G1期、S期、G2期；细胞分裂期即M期。
G0/G1期：G1期，细胞体积逐渐增⼤，细胞开始RNA和蛋⽩质的合成，DNA含量保持⼆倍体状态，G0期是脱离细胞周期暂时停⽌分裂的⼀个阶段。
但在⼀定适宜刺激下，⼜可进⼊周期，从DNA含量上⽆法区分G0与G1期。
S期：在这⼀阶段完成DNA的合成以及合成与DNA组装构成染⾊质等有关的组蛋⽩。
DNA含量在此时期增加，介于G1期和G2期之间。
G2/M期：G2期是DNA复制结束和开始有丝分裂之间的间隙。
从DNA含量上同样⽆法区分G2期和M期。
细胞周期的检测-------------DNA含量的变化检测细胞周期最常⽤的⽅法就是检测细胞DNA含量，正常⽣长的细胞都会经历分裂过程，G0/G1期是两倍体时期，S期DNA开始合成，到G2/M期，细胞处于四倍体时期，之后细胞⼀分为⼆，进⼊下⼀个细胞周期。
特性染料固定破膜特点激光细胞膜不通透性PI/RNase是最常⽤蓝黄绿激光DAPI是CV值最⼩紫外激光⼀、实验操作：PI/RNase染⾊法：以悬浮细胞为例1、离⼼收集细胞，弃上清，⽤预冷的PBS洗涤2次；2、细胞固定：⽤残留的少许PBS混匀沉淀，缓慢加⼊-20°C预冷的70%⼄醇，边加边摇匀，避免细胞粘连在⼀起，置于-20°C冰箱固定4h以上；3、细胞染⾊：350g离⼼5min，弃上清，⽤2ml的PBS洗涤2次，按照10^6 cells 加⼊500µlPBS，含50µg/ml的 PI，100µg/ml的RNaseA，4°C避光孵育15min-30min（可将PI直接⽤PBS配成⼯作浓度，RNaseA现加进去）；4、上机分析：由于PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团，建议过滤后再上机分析，同时别忘了检查流式仪器的状态，⼀般低速收集2-3万个细胞即可。