蛋白质组学,质谱,iTRAQ

44,733 publications (2001--2012)
影响因子 5.113 4.505 4.878 7.398 3.635 1.97 3.685 3.179 年文章 493 426 301 265 211 57 56 6 投稿难易 较难 较难 命中率约50% 较难 较易 较易 一般 命中率约80% 一审周期 较快 平均2月 平均1月 一般,3-6周 平均2月 较慢,6-12周 较慢,6-12周 > 12周或约稿
（4）鉴定与注释蛋白质
通过肽指纹图谱与 数据库搜寻匹配
部分肽段的二级质谱信 息与数据库搜寻匹配
搜索软件Mascot
4、蛋白质生物信息学分析
生物信息学在蛋白组研究中的应用
常用的生物信息学网站
差异表达蛋白点的质谱鉴定
编 蛋白点 差异倍数 登录号 染色体定位号 蛋白功能 号 1 601 -3.77899 gi|257304073 LOC_Os01g44220 glucose-1-phosphate adenylyltransferase large subunit 2 613 -4.06071 gi|215981467 LOC_Os01g44220 glucose-1-phosphate adenylyltransferase large subunit 3 614 -2.73375 gi|257304073 LOC_Os01g44220 glucose-1-phosphate adenylyltransferase large subunit 4 669 -2.06514 gi|300544743 LOC_Os08g25734 glucose-1-phosphate adenylyltransferase large subunit 5 731 -2.09161 gi|259428287 LOC_Os10g25130 aminotransferase, classes I and II, domain containing protein 6 744 -2.11623 gi|217076017 LOC_Os06g04200 starch synthase 7 774 -4.15864 gi|257663652 LOC_Os03g07570 aminotransferase 8 809 -4.07149 gi|256535956 LOC_Os06g04200 starch synthase 9 870 -2.60834 gi|125582731 LOC_Os02g38210 elongation factor Tu 10 885 -2.03805 gi|125564240 LOC_Os09g32290 FAD dependent oxidoreductase domain containing protein
从mRNA表达水平并不能预测蛋白表达水平
蛋白质合成、降解、加工、修饰调控过程，需要蛋白质组分析
2、蛋白质组学发展历史
1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白组研究中 心（Australia Proteome Analysis Facility）。
我国从1997年开始开展蛋白质组研究，是较早倡导 和开展蛋白质组学的主要国家之一。
研究方法
蛋白质组学应用领域
蛋白质组学应用
Proteomics by PubMed Protemics
缩写名/全名 J PROTEOME RES PROTEOMICS J PROTEOMICS MOL CELL PROTEOMICS BBA-PROTEINS PROTEOM PROTEOM CLIN APPL EXPERT REV PROTEOMIC CURR PROTEOMICS
KEGG PATHWAY KEGG PATHWAY KEGG PATHWAY
osa00710
LOC_Os25130.1 LOC_Os07260.1 LOC_Os44220.1 LOC_Os25734.2 LOC_Os44220.1 LOC_Os25734.2
77 / 2905
osa00520
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第二向：SDS-PAGE
蛋白质染色 考马斯亮蓝染色法、银染法、荧光染色法（Cy3，Cy5）
考马斯亮蓝染色法
银染法
一次良好的2-DE分析
染色比较
显色方法 灵敏度 优点 缺点
考染
200ng
操作简便，价格低 灵敏性差，所需 廉，便于后续鉴定 上样量大 灵敏性好，所需样 操作复杂，不利 品少 于后续鉴定 定量定性较好，便 仪器试剂昂贵 于后续鉴定
银染
0.1ng
荧光
1ng
（2）新型非凝胶电泳分离技术
克服双向（2-D）电泳中难以分离鉴定的高分子量 （>100KD）、低分子量（<10KD）、极酸性、极碱 性和疏水性强的蛋白进行有效分离，与质谱联用。
蛋白质组分离方法的优、缺点
类别 优点 缺点 只能分析可溶性蛋白，操 2-DE 成本低，重复性较好 作繁琐，工作量大，需要 蛋白样品量较大 可分离样品分子大小差异较大的蛋 HPLC 2D-LC 白质、低丰度蛋白质及疏水性蛋白 质，易与质谱连接，高灵敏度，分 析速度快，自动化程度高 成本高
2001年2月9日宣告成立国际人类蛋白组组织（HUPO）
2001年我国蛋白质组研究进入快速发展新阶段，设立 了“973”和“863”项目
3、蛋白质组学研究
生物学问题：蛋白质表达变化
翻译后修饰
蛋白Βιβλιοθήκη Baidu-蛋白质互作
其他研究内容
蛋白质组学研究的技术平台和生物信息学 蛋白分离技术 鉴定技术 分析软件 数据库
DeltaC n 预打分得分 该肽段在预打分结果中排名 理论谱与实验谱的离子匹配 数 | 理论谱中离子数 该肽段对应的蛋白 该肽段对应的蛋白群数
蛋白质组学与抗逆性
主要内容
一、蛋白质组学概念及发展 二、蛋白质组研究方法 三、蛋白质组学在非生物逆境中的应用
1、概念
？
蛋白质组与基因组区别
基因组是静态的， 一个有机体发生、 发展、衰亡，不同 细胞、组织基因组 是基本稳定不变
蛋白质组是动态的， 作为基因组表达的产 物随时间、地点、环 境条件变化。
osa00500
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（二）蛋白质组学新技术
双向荧光差异电泳（two－dimensional difference gel electrophoresis，2D－DIGE） 同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ） 非标记定量蛋白质组技术（label-free quantitative proteomics） 磷酸化蛋白质组学(phosphoproteome）
多肽体外标记
iTRAQ试剂包括三部分（以4标为例）： 报告基团：相对分子质量分别为114、115、116和117 平衡基团：相对分子质量分别为31、30、29 和28，保证同一肽段质荷比相等 肽反应标记基团：能与肽N端及赖氨酸侧链发生共价连接而标记肽段，几乎 可以标记所有蛋白质。
在质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记（8标）的不同样本中的同一蛋白质表 现为相同的质荷比。在串联质谱中，报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之 间的键断裂，质量平衡基团丢失，带不同同位素标签的同一多肽产生质量为113121Da的报告离子，根据报告离子的丰度可获得样品间相同肽段的定量信息，再经 过软件处理得到蛋白质的定量信息。
3、蛋白质鉴定技术
蛋白质鉴定过程
（1） 图像扫描分析
质谱分析 （3）
自动质谱点样
胶内蛋白质酶解
蛋白点挖取
（2）
（1）凝胶图像处理
分析软件
（2）差异蛋白酶切
胶内蛋白质酶解
蛋白点挖取
（3）质谱分析 原理
质谱技术发展过程
质谱分类 • 一级质谱(肽质量指纹图谱) • 二级质谱
一级质谱
横坐标:保留时间
唯一肽段数 鉴定的肽段数 搜索到的蛋白
蛋白鉴定覆盖率
蛋白理论分子量 蛋白理论等电点 搜索到的蛋白可能有多个gi号，取最典型的gi号，选取次序为：sp > ref > first gi_number
这三个蛋白鉴定了完全相同的肽段，因此归为同一个group，称为一个鉴定蛋白 群
搜索的质谱文件 肽段电荷数 搜索到的肽段 肽段理论质荷比 理论质荷比与实际检 测到的质荷比的差值 该肽段在该质谱文件 搜索结果中排名 XCorr
Result 鉴定蛋白的数目 有定量信息蛋白的数目 鉴定唯一肽段的数目 Protein Group Quantification Unique peptide 1254 1243 5660
（FDR≤0.01）
LC-MS/MS质谱分析LC液相图谱
纵 坐 标 ： 肽 段 离 子 相 对 强 度
主要内容
一、蛋白质组学概念及发展 二、蛋白质组研究方法 三、蛋白质组学在非生物逆境中的应用
（一）经典蛋白质组学研究方法 （二）蛋白质组学新方法
（一）经典蛋白质组学研究路线
1、样品处理
通常采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行分析；也 可以进行样品预分级，对不同组分蛋白进行研究：
2、蛋白质分离技术
iTRAQ ：Isotope Tagging for Relative and Absolute protein Quantitation 由美国应用生物系统公司ABI 研发的一种多肽体外标记技 术。该技术采用4种或8种同位素的标签，通过特异性标记 多肽的氨基基团，进行串联质谱分析，可同时比较4种或8 种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。
离子化的肽段经质谱仪，因相对分子质量差异而被分 离，产生含有不同峰值的肽质量指纹图谱。
通过PMF与已知数据库（NCBI、EBI）理论期望蛋白 酶肽段比较，根据匹配程度得分推测理论蛋白。
二级质谱
串联质谱或MS／MS谱，将2个一级质谱连接在一起构 成，可以更精确、更灵敏地分析蛋白样品。 通过第一级质谱检测后，选择特定的肽段，与惰性气体 （如氮气）碰撞，对肽段进一步离解，检测氨基酸序列。
双向荧光差异电泳（DIGE）过程
特点
荧光染料Cy3和Cy5标记两组蛋白，Cy2标记所有组别蛋白的混合物作 为内标；三组蛋白混合电泳分离，通过不同激光扫描，在同一张凝胶上得 到三组蛋白图谱。
对照 处理
2D DIGE具有高灵敏度的特性
良好的重复性和较高的准确率
（二）蛋白质组学新技术
双向荧光差异电泳（two－dimensional difference gel electrophoresis，2D－DIGE） 同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ） 非标记定量蛋白质组技术（label-free quantitative proteomics） 磷酸化蛋白质组学(phosphoproteome）
差异表达蛋白分类
差异蛋白生物途径分析表
生物途径 Alanine, aspartate and glutamate metabolism 数据库 KEGG PATHWAY ID 样本数 LOC_Os25130.1 LOC_Os07570.1 背景数
osa00250
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Carbon fixation in photosynthetic organisms Amino sugar and nucleotide sugar metabolism Starch and sucrose metabolism
电喷射离子井飞行时间 质谱（ESI－TOF MS）
基质辅助激光解析飞行时间 质谱（MALDI－TOF MS）
电喷射离子井飞行时间质谱（ESI－TOF MS）
基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI－TOF MS）
肽质量指纹图谱（peptide mass fingerprinting，PMF）
凝胶分离技术： •双向凝胶电泳（2-DE） •双向荧光差异电泳(DIGE)
应用最广泛、最成熟
新型非凝胶电泳： •液相色谱法（LC） •毛细管电泳（CE）
（1）双向凝胶电泳（2-DE）
第一向：等电聚焦（IEF） 根据蛋白质的电荷差异将蛋白质分离
第一向：等电聚焦（IEF）
第二向：SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 根据蛋白质的分子量差异将蛋白质分离