第三章：病毒感染力的滴定

室温放置直至琼脂糖凝固，或于4℃冰箱放置几 室温放置直至琼脂糖凝固，或于4℃冰箱放置几 4℃ 分钟至琼脂糖凝固，然后于37℃ 分钟至琼脂糖凝固，然后于37℃ 5% CO2培养箱 继续培养。 继续培养。 每天于显微镜下观察细胞病变情况。 每天于显微镜下观察细胞病变情况。 出现空斑后（ ），用含钙 镁的PBS 用含钙、 PBS将 出现空斑后（2-3天），用含钙、镁的PBS将 0.1%的中性红贮存液10倍稀释后滴加到细胞培 0.1%的中性红贮存液10倍稀释后滴加到细胞培 的中性红贮存液10 养板上。 养板上。 培养箱中作用1h 吸弃染液， 1h， 于37℃ 5% CO2培养箱中作用1h，吸弃染液，继 续于温箱中培养2 3h。 续于温箱中培养2-3h。
TCID50的计算方法
Calculation of TCID50 • Use of Reed & Muench method (if 50 ul of virus dilution is added to each well)
Reed-Muench两氏法 Reed-Muench两氏法
病毒液 CPE孔数 孔数 稀释度 10-1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 8 8 7 3 1 0 无CPE 孔数 0 0 1 5 7 8 累 计 CPE孔数 无CPE孔数 孔数 孔数 27 19 11 4 1 0 0 0 1 6 13 21 出现CPE孔 孔 出现 所占的% 所占的 100（27/27） （ ） 100（19/19） （ ） 91.6 （11/12） 11/12） 40（4/10） （ ） 0.7（1/14） （ ） 0（0/21） （ ）
=L-d(slgTCID50=L-d(s-0.5) L: 最高稀释度的对数 D：稀释度对数之间的差 S：阳性孔比率总和 375lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5) =-3.875 TCID50=10-3.875/0.1ml
二、病毒蚀斑技术 病毒蚀斑（ 病毒蚀斑（plaque) 又称空斑， 又称空斑 ， 指病毒在已长成的单层细胞上形 成的局限性病灶。 成的局限性病灶。
病毒TCID 一、病毒TCID50的测定 操作步骤
在青霉素瓶中将病毒作连续10倍的稀释，从10-1在青霉素瓶中将病毒作连续10倍的稀释， 10倍的稀释 10-10。 将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中 ， 每一 将稀释好的病毒接种到 96孔微量培养板中 96孔微量培养板中， 稀释度作8 每孔接种100 100µl 稀释度作8孔，每孔接种100 l。 在每孔加入细胞悬液100 l 使细胞量达到3 在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到3×105 100 /ml。 个/ml。
距离此例× 稀释度对数之间的差+ lgTCID50= 距离此例 × 稀释度对数之间的差 + 高于 50% 50%病变率的稀释度的对数 =0.8×(-1)+(-3) )+(=-3.8 TCID50=10-3.8／0.1ml
Karber法 法 病毒液稀释度 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 出现CPE孔的比率 出现CPE孔的比率 CPE 8/8=1 8/8=1 7/8=0.875 3/8=0.375 1/8=0.125 0/8=0
将培养板置37℃ 培养箱吸附1h 吸弃病毒液， 1h， 将培养板置37℃ 5% CO2培养箱吸附1h，吸弃病毒液， 用含钙、镁的PBS（pH7.4） 用含钙、镁的PBS（pH7.4）洗3次。 PBS 1.6%-2%的低熔点琼脂糖 融化后降温至38 42℃， 的低熔点琼脂糖， 38取1.6%-2%的低熔点琼脂糖，融化后降温至38-42℃， 与等量预热至38-42℃含6%-10%犊牛血清的无酚红 与等量预热至38-42℃含6%-10%犊牛血清的无酚红 38 DMEM混合，注入细胞培养板中。 DMEM混合，注入细胞培养板中。 混合
距离比例＝ 高于50 病变率的百分数-50% 50% 距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于 50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数） 50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数） 50 91. 50） 91. 40） ＝（91.6-50）/（91.6-40） ＝ 0.8
•挑取空斑于200μL维持液中，反复冻融3次，接 挑取空斑于200μL维持液中，反复冻融3 200μL维持液中
种于PK-15细胞已长成单层的24孔细胞培养板， 种于PK-15细胞已长成单层的24孔细胞培养板， PK 细胞已长成单层的24孔细胞培养板 再于37℃ 培养箱培养至完全发生病变。 再于37℃ 5% CO2培养箱培养至完全发生病变。
第三章
病毒感染力的滴定
测定病毒感染力的方法: 测定病毒感染力的方法:
半数致死量LD dose） 半数致死量LD50（50% lethal dose） 半数鸡胚感染量EID 半数鸡胚感染量EID50 (egg 50% infective dose) 半数细胞培养物感染量TCID 半数细胞培养物感染量TCID50（tissue culture 50% infective dose) 蚀斑形成单位（ unit，PFU） 蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）
噬斑形成单位（ PFU） 噬斑形成单位（plaque forming unit, PFU） 概念： 概念： 每毫升病毒悬液中所含的蚀斑数， 每毫升病毒悬液中所含的蚀斑数，即病毒悬液 中的感染性病毒浓度。 中的感染性病毒浓度。 计算方法： 计算方法： 如用PRV接种PK 15细胞 每孔接种了0.4ml 0.4ml， 如用PRV接种PK-15细胞，每孔接种了0.4ml，结 PRV接种PK- 细胞， 孔形成了208个空斑， 208个空斑 孔形成了22个空斑， 22个空斑 果10-5孔形成了208个空斑，而10-6孔形成了22个空斑， 则该病毒在PK-15细胞上的空斑形成单位（PFU） 则该病毒在PK-15细胞上的空斑形成单位（PFU）为： PK 细胞上的空斑形成单位 /ml。 22× /0.4ml=5.5× 22×106/0.4ml=5.5×107个/ml。
原理： 原理：适当稀释的病毒悬液接种经长成单层的敏感 细胞后，在覆盖的固体或半固体介质（琼脂糖、 细胞后，在覆盖的固体或半固体介质（琼脂糖、甲基 纤维素）的作用下，病毒在最初感染的细胞内增殖后， 纤维素）的作用下，病毒在最初感染的细胞内增殖后， 只能进而感染并破坏临近的细胞，经过几个增殖周期 只能进而感染并破坏临近的细胞， 形成一个局限性的肉眼可见的病变细胞区， 后，形成一个局限性的肉眼可见的病变细胞区，即局 限性的病灶。 限性的病灶。
TK-突变株与野毒形成的空斑的比较
左图为E 左图为Ea株亲本形成的空斑 图为E TK缺失突变株形成的空斑 右图为Ea株TK缺失突变株形成的空斑
如果是测定PFU， 如果是测定PFU，则直接记取一定稀释度的病 PFU 毒所形成的空斑数，然后根据公式计算PFU。 毒所形成的空斑数，然后根据公式计算PFU。 PFU 如果是作病毒纯化
通过PCR或其它方法进行鉴定，取阳性者再作下 通过PCR或其它方法进行鉴定， PCR或其它方法进行鉴定 一轮空斑纯化。如此3 一轮空斑纯化。如此3-5轮空斑纯化后即可得到 纯化的病毒粒子。 纯化的病毒粒子。
噬斑技术的应用： 噬斑技术的应用：
Байду номын сангаас
用于病毒纯化： 用于病毒纯化：挑选病毒的克隆株 测定病毒悬液中感染病毒的含量
设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。 设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。 逐日观察并记录结果，一般需要观察5 逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。 结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法 两氏法或Karber 结果的计算， Reed-Muench两氏法或Karber法
plaques
Procedures
操作步骤
将敏感细胞在平皿或6 将敏感细胞在平皿或6孔板内培养成单层 吸弃培养液，加入含钙、镁的PBS（pH7.4） 吸弃培养液，加入含钙、镁的PBS（pH7.4）洗1-2 PBS 次。 用维持液将病毒液作连续10倍的稀释，选择适当稀 用维持液将病毒液作连续10倍的稀释， 10倍的稀释 释度的病毒悬液接种培养孔内的单层细胞， 释度的病毒悬液接种培养孔内的单层细胞，接种量 约为原培养液的1/10-1/5，以覆盖住细胞单层为宜， 约为原培养液的1/10-1/5，以覆盖住细胞单层为宜， 1/10 每个稀释度接种2 每个稀释度接种2-3孔。
• 一般的毒种纯化：收集病变的细胞悬液，测定 一般的毒种纯化：收集病变的细胞悬液，
TCID50，然后选TCID50较高者再作几轮空斑纯化， 然后选TCID 较高者再作几轮空斑纯化， 获得高滴度的病毒，扩大培养后作种用。 获得高滴度的病毒，扩大培养后作种用。
• 筛选重组病毒：收集病变的细胞或病毒悬液， 筛选重组病毒：收集病变的细胞或病毒悬液，