多糖类药物的分析11-12-5

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（2）、部分酸水解、碱水解 选择温和的条件水解多糖，使糖链中某 种类型的键特异性地打断。
（3）、乙酰解 多糖经过乙酰解反应（醋酐、冰醋酸） 可生成乙酰化单糖和寡糖
33Leabharlann （4）、甲醇解

多糖链在80－100℃条件下与无水甲醇反 应能将糖链变成组成单糖的甲基糖苷。
甲基糖苷能转化为三甲基硅醚衍生物或乙 酰基衍生物，进行气相色谱分析。
生色底物法

抗Xa因子活性测定
以溶液吸收度和浓度的 对数，照生物检定统计 法中量反应平行线测定 法计算出供试品的抗Xa 因子活性 可 信 限 率 ( FL%) 不 得 大于10%。
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第五节、多糖类药物的结构分析

单糖组成 糖苷键连接方式 糖苷键连接位置
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（一）多糖组成单糖的分析
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第三节 多糖的分子量测定

凝胶色谱法 粘度法 超离心法 高效液相色谱
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凝胶层析法


凝胶层析法：将分子量不同 的蛋白质通过一定孔径的凝 胶固定相，由于各组分流经 体积的差异，使不同分子量 的组分得以分离。 最先淋出的是最大的分子。
Kd = 0， Ve= V0 ； Kd = 1 ， Ve= V0+Vi ； 0＜Kd＜1，Ve=V0+KdVi 。
氮:用发酵法制备右旋糖酐时，发酵滤液中存 在着微量蛋白质。

50
氮

取本品0.2 g，置50 ml凯氏烧瓶中，加硫酸1 ml，加热消化至供试品成黑色油状物，放冷， 加 30%过氧化氢溶液 2 ml，加热消化至溶液 澄清，冷却至20℃以下，加水10 ml，滴加管 中，再用水稀释至刻度，缓缓加碱性碘化汞钾 试液2 ml，随加随摇匀；如显色，与标准硫酸 铵溶液(每1 ml相当于10 μg的N)1.4 ml加硫 酸0.5 ml用同一方法处理后颜色比较，不得更 深(0.007%)。
CH2OH O OH OH O
CH2OH 直链淀粉 O OH OH O
O OH
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纤维素
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多糖的理化性质



旋光性 硫酸蒽酮反应（620nm） 硫酸苯酚反应(490nm) 氨基己糖——乙酰丙酮(525nm) 糖醛酸——硫酸咔唑(520nm)
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第二节 多糖的纯度测定

（一）超离心法 （二）电泳法 （三）凝胶色谱法 （四）旋光法

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生物测定法——肝素测定方法

标准品稀释液的配制:精密量取标准品溶液，按高、中、 低剂量组（ ds1 、ds2、 ds3 ）用0.9%氯化钠溶液配成 三种浓度的稀释液，相邻两浓度的比值为1:0.7。 供试品稀释液的配制：按供试品的标示量或估计效价 （AT），照标准品溶液与稀释液的配制法配成高、中、 低（ dT1 、dT2、 dT3 ）三种浓度的稀释液。 各管凝结时间换算成对数，照生物检定统计法中的量反 应平行线测定法计算效价及实验误差。 可信限率（FL%）不得大于5%。
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蒽酮法测定糖含量（总糖）

原理：多糖在浓硫酸中 水解后，进一步脱水生 产糠醛类衍生物，与蒽 酮作用形成蓝色化合物， 620nm进行比色测定。
特点：10-100μg范围 内其颜色的深浅与糖含 量成正比。 灵敏度高。
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生物测定法－肝素测定

美国药典采用羊血浆法。 即比较肝素标准品和供 试品延长血浆凝结时间 的作用来测定肝素的效 价。



常用的衍生物有： 三甲硅烷（TMS）衍生物 三氟乙酰（TEA）衍生物 乙酰（AC）衍生物 甲基（Me）衍生物
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二、糖苷键连接方式的测定


红外光谱——糖苷键类型
确定吡喃糖糖苷键时，用红外光谱，在890cm-1 处有特征吸收者，示有β-型糖苷键，在840cm-1 处有特征吸收者，示有α-型糖苷键。
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第四节、多糖的含量测定

比色法（硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、 硫酸苯酚法、蒽酮法）
生物测定法（肝素钠）


生色底物法（低分子量肝素钠）
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乙酰丙酮法（elson-morgan）
——氨基己糖

原理： 氨基己糖在碱性条件下 加热，可与乙酰丙酮缩 合成吡咯衍生物，该衍 生物与对－二甲氨基苯 甲醛反应，反应物呈红 色，于 525nm 测定吸 收度。


核磁共振谱——糖苷键（α型或β型）。
H-NMR谱中的化学位移δ5.4 和δ 5.1 ，有两个 信号说明分子结构中的糖苷键为α型，如有δ 4.53说明有β型。
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三、糖苷键连接位置的测定


（一）、高碘酸氧化、Smith 降解 （二）、甲基化反应产物分析 （三）、乙酰解后质谱分析
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（一）高碘酸氧化、Smith降解
临床上使用的是平均分子量为 16000~24000 ， 32000~42000和64000~76000的右旋糖酐20、 右旋糖酐40和右旋糖酐70，它们均是用做代血浆。
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一、结构与理化性质


右旋糖酐的结构：它主要由葡萄糖 （ 1 → 6 ） α- 糖苷键连接而成，同时含有 (1 → 3) α- 和 (1 → 4) α- 糖苷键连接形成的 分支结构。 右旋糖酐为白色无定形粉末，无臭、无味， 易溶于热水。 右旋糖酐溶于水后形成有一定粘度的胶体 溶液，在乙醇等有机溶剂中不溶。
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生色底物法原理－肝素、低分子肝素

当蛋白酶（FⅩa）从生色底物分裂出pNA时，发色 物的产生量与剩余的酶量成正比，与肝素效价成反比。


405 nm测定。
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生色底物



Bz：苯甲酰，Pip：哌啶酰， Tos：甲苯磺酰； 对-硝基苯胺（pNA）。 酰胺分解法（amidolytic method）。 当蛋白酶从生色底物分裂出pNA时，发色物的产 生量与剩余的酶量成正比，与肝素效价成反比。 。 405 nm测定。 28
分子离子峰如有二乙酰葡萄糖或二乙酰单糖 碎片峰，表明有支链结构。

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实例：右旋糖酐（dextran）



右旋糖酐，又称葡聚糖，是若干个葡萄糖脱水形成 的聚合物。 微生物多糖，也是第一个工业化的微生物多糖，是 由肠膜明串珠菌（ Leuconostoc mesenteroides） 发酵产生的。 产物的分子量很大，经水解后，用不同浓度乙醇多 定分级沉淀，得到中、低、小分子量的右旋糖酐成 品。

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（5）、酶降解

分为外切糖苷酶和内切糖苷酶。
外切糖苷酶：切下多糖非还原末端的一个 单糖，并对单糖组成和糖苷键有专一性要 求。 内切糖苷酶可水解糖链内部的糖苷键，释 放多糖链片断以利于结构分析。
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2、单糖的分离鉴定

气相色谱法 高效液相色谱法
气相色谱法与质谱分 析连用
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气相色谱法
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凝胶色谱法


方法： Sephadex G-200，多糖标准品 分部收集，硫酸 - 苯酚检测，分别求得洗 脱体积Ve， Ve与 1gM之间存在着线性关 系，绘制标准曲线。 Ve=-KlogM+C 将待测样品上柱，待测多糖Ve。 通过标准曲线求出待测多糖分子量。
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粘度法、超离心法
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硫酸咔唑法测糖含量

硫酸咔唑法—己糖醛酸测定 在浓硫酸中，己糖醛酸与咔 唑溶液反应生成的反应物呈 红色。 520nm比色


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硫酸苯酚法测定糖含量（总糖）

原理：多糖在浓硫酸作 用下水解成单糖，该单 糖在强酸性条件下，与 苯酚反应生成橙色衍生 物。 它在490nm处有最大吸 收，其吸光度与浓度呈 线性关系。
多糖类药物的分析
一、概述 二、多糖的纯度测定 三、多糖分子量测定 四、多糖的含量测定 五、多糖类药物的结构分析
1
第一节 概述
1．从动物来源的多糖。 2．从微生物来源的多糖。 3．从植物来源的多糖。 4. 从海洋生物来源的多糖。

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组成分类：

均一多糖 不均一多糖:不同类型的单糖缩合而成 粘多糖：含氮的不均一多糖 结合糖：肽聚糖、糖蛋白(glycoproteins)和蛋 白聚糖 糖蛋白通过糖肽键(carbohydrate-peptide linkage) 将糖链和肽链两部分连接起来,连接方式主要分 为β -构型的N-糖苷键和α -构型的O-糖苷键.
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二、鉴别

右旋糖酐经碱性水解后产生葡萄糖， 葡萄糖可使Cu2+还原为红色氧化亚铜 沉淀。
操作方法：取本品0.2 g，加水5 ml 溶解后，加氢氧化钠试液2 ml与硫酸 铜试液数滴，加热后变成红棕色沉淀 。
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三、检查

右旋糖酐的检查项目较多，其中氯化物、重 金属、干燥失重、炽灼残渣的检查参见中国 药典2000年版二部附录，此外还有氮、分子 量与分子量分布的检查。
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分子量与分子量分布

右旋糖酐20： 3500 —— 7万 右旋糖酐40： 5000 ——12万 右旋糖酐70： 15000 ——18.5万

原理： 选择性的氧化降解反应，能够作用于多糖分子 中1，2—二羟基和1，2，3—三羟基，生成 过碘酸氧化产物；此产物用硼氢化钠还原后， 再用酸水解，生成相应的醛、甲酸。
室温下用稀无机酸水解还原产物。
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1，2连接的糖苷键

1，2连接的糖苷键经高碘酸氧化后的产物 用硼氢化钠还原得到稳定的多羟基化合物， 再用稀盐酸水解，得到甘油及甘油醛。 方程式：