液相色谱柱的清洗

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液相色谱柱维护保养及仪器冲洗

液相色谱柱维护保养及仪器冲洗注意：每个色谱柱使用之前都要阅读一下使用说明书;色谱柱维护保养是很重要的,关系到色谱柱的使用寿命和检测结果的准确性,所以任何人用过色谱柱之后,一定要对色谱柱进行保养,管理人员和使用者互相监督;总的原则是色谱柱要轻拿轻放,避免损坏填料；另外没有使用的情况下,一定要保证两端的堵头封好;对于具体的色谱柱,下面列出常用色谱柱维护保养的具体方法和注意事项,以便使用者参考;min缓慢升高到min不接检测器冲洗色谱柱30分钟后,将色谱柱与检测器连上,流速调为ml/min冲洗色谱柱60分钟,然后不断降低有机相的比例如80%、50%、10%甲醇或乙腈各冲洗至少30分钟;若色谱柱暂时不用,则将色谱柱保存在高比例有机相中如80%甲醇或乙腈,或者参考该色谱柱使用说明书中建议的溶剂中；色谱柱使用时应用与分析流动相相同比例的有机溶剂将缓冲盐溶液换成水冲洗色谱柱15分钟,然后再换成流动相进行样品分析;样品分析完后,色谱柱维护与保养方法：流动相中若含酸、碱、盐类物质,则要先用10%甲醇或乙腈冲洗,min的流速冲洗至少30min,再用80%甲醇或乙腈冲洗至少30min,柱子保存在80%甲醇或乙腈里具体问题具体分析,洗脱程序可以是梯度洗脱程序,注意如果最后色谱柱保存的是高有机相,第二天用之前一定要用高水相过渡一下,再换成流动相;如柱子长时间未用,则柱子保存在100%的甲醇或乙腈里;对于含有离子对试剂的流动相如庚烷磺酸钠和十二烷基磺酸钠等,柱子应采用梯度洗脱,一般用乙腈-水系统水：90-10；乙腈：10-90冲洗时间要稍长些,然后保存于90%乙腈;需要特别强调的是,目前所有的C18柱均不能用纯水进行长时间1小时以上冲洗,除非有专门耐水的专用柱,否则,用纯水长时间冲洗色谱柱,会导致色谱柱的固定相流失和相塌陷,损坏色谱柱;大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2~8,有的pH稳定范围会宽,具体pH稳定范围参照色谱柱说明书,当分析条件的pH值偏小或偏大时,可选择pH稳定范围宽的柱子进行分析,否则,会损坏色谱柱;在每次进行样品分析时,要保证流动相包括盐、缓冲盐、酸等与色谱系统及柱内的保存液要互溶,如不能互溶,则需要用一定比例的有机溶剂不低于10%或与分析流动相相当的有机溶剂对柱子进行过渡,否则,流动相中的盐会在系统与柱内析出,影响样品分析或损坏柱子;硅胶柱、正相手性色谱柱包括AS-H、AD-H、OD-H系列,5DMB、5TBB系列,OA 系列如OA-3100、OA-3300对于未启用的新的色谱柱,在保证系统是正相的情况下,可先用异丙醇小流速流速为~min冲洗色谱柱约15分钟,然后换上正相流动相平衡进行色谱分析;硅胶柱及正相手性柱不能过水相对于sepax系列的硅胶柱,可以过低比例的水相有机相不低于50%,接上色谱柱之前要保证液相色谱系统中的所有管路为正相流动相如是不含盐的反相溶液如水/乙腈；水/甲醇,先用异丙醇冲洗所有管路,然后用正相流动相冲洗所有管路,最后再接上色谱柱；若反相流动相中含有缓冲盐如缓冲盐/乙腈；缓冲盐/甲醇,先用纯水冲洗HPLC系统,然后用异丙醇冲洗所有管路,最后用正相流动相冲洗,再接上色谱柱;使用结束后,先用异丙醇冲洗色谱系统与色谱柱,再用色谱级的正己烷冲洗色谱柱,或者直接用正己烷－异丙醇90：10冲洗,并保存在正己烷－异丙醇90：10中;如长时间未用,则保存在正己烷中;需要特别强调的是,冲洗硅胶柱时,不能用纯水或含水的有机溶剂或缓冲盐体系冲洗色谱柱,只能用纯有机溶剂冲洗色谱柱对于sepax系列的硅胶柱可以用不低于50%有机相冲洗色谱柱,最后保存在纯的有机溶剂中;在进行样品分析前,一定要保证流动相与色谱系统及色谱柱柱内的保存液要互溶,如不互溶,则需要用异丙醇过度,否则,会影响色谱系统与损坏柱子;反相手性色谱柱如：CHIRALCEL OZ-3R：同C18柱阴离子柱和阳离子柱：目前常见的阴子柱有waters IC-Pak TM anion,阳离子柱有磺酸基阳离子柱与waters阳离子交换柱钙型;对于waters IC-Pak TM anion 和waters阳离子交换柱钙型,新柱子使用前用高纯水小流速min缓慢升高到min冲洗约30分钟,然后再换成流动相平衡色谱柱;在冲洗色谱柱之前,要保证整个色谱系统为纯水相;对于磺酸基阳离子柱含有硅胶基柱的,使用前用甲醇或乙腈小流速冲洗30分钟,然后高纯水替换系统冲洗,然后接上色谱柱;分析完样品后,对于waters IC-Pak TM anion和waters阳离子交换柱钙型用高纯水冲洗色谱柱,色谱柱最后保存在纯化水中;对于磺酸基阳离子柱,用50%的乙腈或甲醇冲洗色谱柱30分钟,最后保存在甲醇或乙腈中参照柱子说明书;冲洗所用流速根据柱子耐压情况进行调整;需要特别强调的是waters IC-Pak TM anion和waters阳离子交换柱钙型是不能过有机相纯有机溶剂或有机溶液,否则会损坏色谱柱;氨基柱、氰基柱、苯基柱及C8柱目前所使用的氨基柱、氰基柱、苯基柱及C8柱基本都是使用反相系统,其操作方法与维护保养与C18相同;对于新碰到的别的型号的色谱柱,如本规程没有说明时,要参照色谱柱说明书具体问题具体分析;液相仪器的冲洗1、冲洗色谱系统具体情况具体分析,可针对缓冲盐浓度较高的流动相一般做完试验冲洗完色谱柱后,换上两通,将各通道放于10%乙腈中冲洗至少30分钟若原色谱系统中流动相含盐,则用高纯水有时候用温水效果更好冲洗至少30分钟后再用10%乙腈冲洗;若仪器长时间不用,则将仪器保存于80%乙腈中; 2、清洗进样针、柱塞杆洗针液应选择能较好溶解样品的溶剂如该样品在70%甲醇中溶解,则洗针液应选择70%甲醇或更高比例的甲醇；清洗柱塞杆的溶剂为了清洗流动相中析出的盐,一般选择低比例的有机相,如10%甲醇或乙腈;3、仪器的钝化色谱泵溶剂过滤头、进出口阀及管路包括进样器和检测池若被污染,系统应做清洗和钝化处理;一般采用30%磷酸水溶液作为清洗剂,用6mol/L硝酸作为钝化剂,先清洗再钝化;清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢;钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜;30%磷酸水溶液制备：取85%浓磷酸35ml与65ml水混匀;6mol/L硝酸的制备：取浓硝酸40ml与60ml水混匀;方法：将色谱柱取下,用两通连接进样器和检测器,将所有吸滤头放入高纯水中,以min流速过渡至少30分钟,待管路中有机溶剂洗脱干净；再换用30%磷酸清洗系统约45分钟,再换高纯水冲洗,直至出口水pH值约为6～7用pH试纸测试,清洗完成；然后换用6mol/L硝酸冲洗系统约45分钟,再换高纯水冲洗,直至出口水pH值约为6～7,钝化完成;用纯甲醇过渡,浸润泵头及管路,备用;。

岛津液相色谱仪的日常维护与注意事项

岛津液相色谱仪的日常维护与注意事项岛津液相色谱仪的日常维护与注意事项一、日常维护：1. 定期清洗单向阀：将单向阀卸下，一般先用纯净水超声10分钟，然后用异丙醇超声10分钟；也可直接用异丙醇超声10分钟。

2．定期清洗吸滤头：将吸滤头卸下，一般先用纯净水超声10分钟，然后用异丙醇超声10分钟；也可直接用异丙醇超声10分钟。

3．定期冲洗检测池：把色谱柱卸下，在流速1.0ml/min的状态下先用纯净水冲洗30分钟，然后再用30%磷酸（色谱级）冲洗30分钟左右，再用超纯水冲洗至流出液为中性，最后用甲醇冲洗，待用。

二、注意事项：1. 开始进样前30分钟开氘灯即可，节约灯的能量和使用时间。

2. 流动相的使用和注意事项：①所用流动相必须预先滤过和脱气，流动相一般贮存于玻璃不锈钢容器内。

贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化。

磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要长期贮存。

容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。

②配制流动相用水需为娃哈哈牌纯净水或经超声过滤后的纯化水，流动相配制好后先用直径为5cm，孔径为0.45ｕm的滤膜，通过沙芯过滤器的过滤，然后在超声仪上超声。

③不得将装流动相的容器直接放置与超声仪内，需放与筛网上进行超声。

3. 六通阀的使用和维护注意事项：①样品溶液进样前必须用滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。

②转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。

③为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。

通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。

4. 色谱柱柱压升高的主要因素：① LC-10AT/20AT/10ATPlus泵的单向阀堵塞。

②色谱柱的入口筛板堵塞。

③吸滤头堵塞。

④ PEEK管接口处堵塞。

5. 色谱柱柱压不稳的因素：①泵内有空气。

液相色谱柱清洗活化再生

1.色谱柱的活化30个柱体积，然后用甲醇/乙腈：水（50:50）冲洗10个柱体积，然后再用流动相平衡30柱体积。

=9：1冲洗30倍柱体积，再流动相平衡30个柱体积。

100%甲醇或乙腈冲洗30个柱体积，然后转换到流动相平衡。

用于反相色谱时，先用异丙醇或乙醇冲洗色谱柱50-100个柱体积，然后用甲醇/乙腈：水（50:50）冲洗10个柱体积，然后再用流动相平衡30柱体积。

50倍柱体积50/50乙腈/水活化平衡，然后再用流动相平衡30柱体积。

2.色谱柱的清洗保存和再生清洗：如使用缓冲盐，先用高比例水相冲洗30个柱体积，然后再转换到80%有机相冲洗30个柱体积。

再生：用95%水，甲醇，异丙醇，甲醇，95%水分别冲洗30个柱体积，在第一次用95%水时，进样10次100 μL DMSO。

清洗：100%乙醇0.3ml/min 3h，再用正己烷：异丙醇=9：1冲洗30倍柱体积并保存。

再生：根据不同类型正相柱选择。

[常规正己烷/异丙醇的柱子，乙醇（0.1%三氟乙酸）0.3ml/min 3h，乙醇0.3ml/min 3h，乙醇（0.1%二乙胺）0.3ml/min 3h，乙醇0.3ml/min 3h，正己烷：异丙醇=9：1冲洗30倍柱体积]清洗：用100%水冲洗30个柱体积去除盐，然后用100%甲醇或乙腈冲洗30个柱体积后保存在50%甲醇或乙腈中。

再生：先用高浓度盐的缓冲液清洗（浓度可以是5-10倍，不超过1M），然后再用100%水洗，50%乙腈或甲醇保存。

清洗：反相使用时同反相C18色谱柱，如短期不用，可用95%甲醇或乙腈保存;长期不用时需用异丙醇置换，最后用正己烷保存。

再生: NH2柱用于反相条件时，NH2键会水解，先用含1.0%NH3的乙腈-水(50:50)溶液冲洗30个柱体积，乙腈-水(50:50)冲洗30个柱体积，95%水/5%乙腈冲洗30个柱体积，异丙醇冲洗30个柱体积，95%乙腈/5%水冲洗30个柱体积并保存。

色谱柱冲洗方法

色谱柱冲洗方法（最新版4篇）篇1 目录1.色谱柱冲洗的必要性2.色谱柱冲洗的方法2.1 水冲洗法2.2 有机溶剂冲洗法2.3 缓冲盐冲洗法2.4 反冲法3.色谱柱冲洗的注意事项篇1正文色谱柱是液相色谱系统中的核心部件，它在样品分离过程中起着至关重要的作用。

然而，在色谱柱使用过程中，柱内可能会积累一些脏物或盐析物，影响色谱柱的分离效果。

因此，对色谱柱进行定期冲洗是非常必要的。

下面我们将介绍几种常见的色谱柱冲洗方法。

首先，水冲洗法是最常用的色谱柱冲洗方法。

此方法操作简便，只需将色谱柱连接到水流系统上，使用纯水进行冲洗。

篇2 目录一、色谱柱冲洗的必要性二、色谱柱冲洗的方法1.水冲洗法2.纯有机相冲洗法3.缓冲盐冲洗法4.反冲法5.专用清洗剂冲洗法三、不同类型色谱柱的冲洗方法1.反相色谱柱2.正相色谱柱3.离子交换色谱柱4.凝胶渗透色谱柱四、色谱柱冲洗的注意事项篇2正文色谱柱是高效液相色谱系统中的核心部件，其在样品分离过程中起到关键作用。

然而，在长时间的使用过程中，色谱柱内部可能会积累一些脏物，影响色谱柱的分离效果。

因此，对色谱柱进行定期冲洗是非常必要的。

色谱柱冲洗的方法有很多种，下面我们分别进行介绍：1.水冲洗法：这是一种最常用的色谱柱冲洗方法。

使用纯水或含有少量缓冲盐的水进行冲洗，可以有效去除色谱柱内部的脏物。

对于反相色谱柱，可以使用纯水或甲醇/水混合溶液进行冲洗。

2.纯有机相冲洗法：在冲洗色谱柱时，可以使用纯有机溶剂（如乙腈、甲醇等）来代替水相。

这种方法适用于具有疏水性的色谱柱，如 C18、C8 等。

3.缓冲盐冲洗法：在冲洗过程中，可以加入一定浓度的缓冲盐，以保持色谱柱内部的离子强度。

这种方法适用于离子交换色谱柱和凝胶渗透色谱柱。

4.反冲法：这是一种比较彻底的冲洗方法，可以有效去除色谱柱内部的沉淀物。

在反冲过程中，需要将色谱柱的流动相改为反向，并提高流速。

然而，反冲过程可能会对色谱柱造成一定程度的损伤，因此需要谨慎操作。

液相色谱柱的清洗和再生

冼4—16小时
用25℃的20:80的乙腈
水溶液以0.1ml/min的
流速反向冲冼4小时
用25℃的20:80的乙腈
水溶液以0.1ml/min的
流速反向冲冼4小时
钠离子型
用85℃的0.1mol/L 的
NaNO3溶液以0.1ml/min
的流速反向冲冼4—16小
时
用水冲冼至平衡。
正相再生
适合于主要使用正相流动相的多孔石墨化碳柱。
用50ml二氯甲烷以1ml/min流速冲洗。
用50ml甲醇以1ml/min流速冲洗。
用50ml水以1ml/min流速冲洗。
用50ml 0.1mol/L盐酸以1ml/min流速冲洗。
用50ml水以流速1ml/min冲洗。
用25℃的20:80的乙腈
水溶液以0.1ml/min的
流速反向冲冼4小时
用65℃的20:80的
ACN:0.01NH2SO4溶液
以0.1ml/min的流速反
向冲冼4小时
钙离子型
用25℃的0.1mol/L pH6.3
的Ca(NO3)2溶液以
0.1ml/min的流速反向冲
用95%甲醇水溶液冲洗重新平衡。
将色谱柱改为正向。
作者：英国的R.Plumb-Glaxo
强有机溶剂再生
适合于水相分析极性或离子类分析物。
用50ml丙酮以1ml/min流速冲洗。
用120ml二丁醚以1ml/min流速冲洗。
用50ml丙酮以1ml/min流速冲洗。
7 带金属抗衡离子的聚合物填料
基质是带金属抗衡离子的聚合物色谱柱，有三种再生方法，每种方法详细列于下表：

制备液相色谱系统安全操作及保养规程

制备液相色谱系统安全操作及保养规程制备液相色谱系统是一种非常常用的实验仪器，它因其高分辨率、广泛的分离能力和快速的分离速度而受到化学实验室和分析实验室的欢迎。

但是，在使用制备液相色谱系统时，必须遵守特定的安全操作规程并进行定期的保养，以确保设备的正常运行和操作人员的安全。

安全操作规程1. 仪器放置制备液相色谱系统应放置在安静、通风、干燥、洁净的环境中，远离热源和震动。

同时应确保设备摆放平稳，避免晃动。

2. 操作前的准备工作在进行任何操作前，应检查所有配件和管道的连接是否松散、漏气或漏液。

同时应确认溶剂储罐、进样器和检测器中的溶剂是否充足，以及各部分的工作压力是否正常。

3. 操作步骤在操作制备液相色谱系统时，应按照以下步骤进行：•打开设备的电源，并检查仪器状态是否正常。

•检查进样器的峰宽参数是否正确，并将样品注射到进样器中。

•检查流动相管道是否连通，并将流动相泵的流量和压力参数设置到合适的范围内。

•打开检测器并检查是否正常工作。

•启动操作软件并进行数据采集。

•操作结束后，关闭仪器的电源。

4. 应急措施在操作制备液相色谱系统时，如遇到仪器异常状态或发生意外事故，应采取以下措施：•立即关闭设备的电源。

•停止进样和流程。

•将液相泵压力系统内的压力卸下。

•切勿试图修理设备并呼叫工作人员协助解决问题。

设备保养规程除了遵守安全操作规程外，定期保养设备也非常重要，这样可以保证仪器的长期稳定运行。

1. 冷却水降温器的保养定期清洁冷却水降温器的卫生管，并按照操作手册调整卫生管的阀门，以保持恒温水的正常流量和水温的稳定。

2. 溶剂过滤器和蒸发器的保养定期更换溶剂过滤器和蒸发器中的溶剂，以避免污染和积聚。

3. 液相泵和检测器保养液相泵和检测器应该根据操作手册进行定期维护和校准，以保证它们的精度和稳定性。

4. 液相色谱柱清洗对于液相色谱柱，应该根据使用情况定期进行清洗和保养，并按照操作手册调整进样量和流速参数。

5. 数据备份重要数据应该定期备份，以防止数据丢失或被损坏。

c18色谱柱冲洗方法

c18色谱柱冲洗方法C18色谱柱是一种常用的反相色谱柱，用于分离和分析各种有机物。

在使用过程中，由于样品的复杂性和柱子的不同寿命，需要进行定期的冲洗和维护，以保持色谱柱的性能和延长使用寿命。

C18色谱柱的冲洗方法主要包括前冲洗和后冲洗。

1.前冲洗：在使用新的C18色谱柱之前，首先需要进行前冲洗以清除潜在的杂质和柱子中的空隙。

前冲洗一般使用有机溶剂和水的混合物。

以下是一种常用的前冲洗方法：a.使用无机盐和有机溶剂制备一个50%的有机溶剂溶液。

常用的有机溶剂包括乙腈和甲醇等。

b.使用前述有机溶剂溶液和水制备50%的有机溶剂和50%的水的混合物。

c. 运行液相色谱系统，将50%有机溶液和50%的水的混合物以1mL/min的流速通过C18色谱柱进行前冲洗。

冲洗时间通常为15-30分钟。

2.后冲洗：后冲洗是指在使用C18色谱柱一段时间后，柱子表面可能会附着样品残留物，需要进行清洗以恢复柱子表面的性能。

以下是一种常用的后冲洗方法：a.使用90%甲醇和10%水的有机溶剂制备后冲洗溶液。

b. 运行液相色谱系统，将后冲洗溶液以1mL/min的流速通过C18色谱柱进行后冲洗。

后冲洗时间通常为30-60分钟。

3.再生：如果C18色谱柱因样品残留物和其他污染物而导致性能下降，可以考虑进行柱子的再生。

以下是一种常用的再生方法：a.使用90%甲醇和10%水的有机溶剂制备再生溶液。

b. 运行液相色谱系统，将再生溶液以1mL/min的流速通过C18色谱柱进行再生。

再生时间可以根据实际情况进行调整，通常为30-60分钟。

c.再生后，使用前述的前冲洗方法进行前冲洗，以确保柱子完全清洁。

值得注意的是，柱子的冲洗方法应该根据具体实验条件和样品的特性来确定。

在冲洗过程中，也要注意保持流速稳定，避免超过柱子的最大压力，以免对柱子造成损害。

总之，C18色谱柱的冲洗方法是保持色谱柱性能和延长使用寿命的重要步骤。

通过定期的前冲洗、后冲洗和再生，可以有效地清除样品残留物和污染物，使色谱柱保持良好的分离效果和稳定性能。

waters hss t3色谱柱说明书

waters hss t3色谱柱说明书摘要：一、Waters HSS T3 色谱柱简介二、Waters HSS T3 色谱柱的特点三、Waters HSS T3 色谱柱的应用范围四、Waters HSS T3 色谱柱的安装与使用五、Waters HSS T3 色谱柱的维护与保养正文：一、Waters HSS T3 色谱柱简介Waters HSS T3 色谱柱是一种高效、快速的液相色谱柱，由Waters 公司生产。

这款色谱柱采用了独特的HSS（High Speed Silica）技术，具有高柱效、高分辨率和快速分离等特点，广泛应用于药物分析、生物制药、环境监测等领域。

二、Waters HSS T3 色谱柱的特点1.高柱效：Waters HSS T3 色谱柱具有高柱效，可以提高分析速度和分离效果。

2.高分辨率：这款色谱柱的分辨率较高，能够对样品进行精细的分离和检测。

3.快速分离：Waters HSS T3 色谱柱采用了HSS 技术，可以实现快速分离，提高分析效率。

4.广泛的应用范围：这款色谱柱适用于多种样品的分析，包括药物分析、生物制药、环境监测等领域。

三、Waters HSS T3 色谱柱的应用范围Waters HSS T3 色谱柱主要用于药物分析、生物制药、环境监测等领域，可以对各种样品进行高效、快速的分离和检测。

四、Waters HSS T3 色谱柱的安装与使用1.安装：在安装Waters HSS T3 色谱柱时，需要先将色谱柱的两端用封口胶封好，然后将其插入色谱仪的进样口和检测器接口。

2.使用：使用Waters HSS T3 色谱柱进行分析时，需要按照以下步骤操作：（1）样品准备：将待分析的样品进行预处理，使其符合色谱分析的要求。

（2）样品进样：将样品溶液通过进样器注入色谱柱中。

（3）色谱分离：打开色谱仪的泵，使样品在色谱柱中进行分离。

（4）检测：分离后的样品通过检测器进行检测，得到色谱图。

液相色谱柱的清洗(活动za)

液相色谱柱的清洗一、液相色谱柱按基体成分的分类、硅胶基体：不键合任何化学基团的为硅胶柱，键合的化学基团有、、、氨基、氰基、苯基等。

、聚合物基体：常见的聚合物基体为聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇。

聚合物上再键合化学基团。

根据填料基体的成分不同可以分为：二、色谱柱常见问题的成因、硅羟基的死吸附：硅胶粒子表面存在硅羟基，这些硅羟基会吸附样品和流动相中的很多物质，当吸附达到饱和时就会出现柱效下降、峰形劣化的现象。

有些吸附是可逆的，可以通过清洗解决。

、重金属离子：重金属以金属氧化物的形式残存在硅胶粒子的表面,这些金属氧化物很容易与其它化合物形成螯合物,使其被氧化,造成峰形劣化。

、缓冲液中盐的析出：当流动相中含有缓冲盐溶液，而且分析结束后,如果没有先用水进行冲洗,而是直接用纯有机相冲洗,瞬间柱子中的微环境是高有机相、低水相。

这时流动相中的缓冲盐溶液极易析出盐份,将柱子堵塞,使柱压升高,柱效下降。

、色谱柱变干：如果对色谱柱保存不当,使色谱柱中的保存液全部挥发,柱子内部变干,造成色谱柱的损伤,会影响分离效果。

三、对色谱柱进行适当清洗的意义以上提到的部分故障可以通过适时、适当的清洗得到解决，恢复色谱柱的功能，延长色谱柱的使用寿命。

下面对比较常见的几种型号的色谱柱的清洗方法进行讨论，具体的冲洗方法要根据实际情况作适当的选择和调整。

当然，不同的用户和色谱产品厂商对自己的色谱柱会有不尽相同的处理方法。

四、新柱使用前的冲洗新柱在使用前应先认真阅读说明书及性能测试报告,了解柱子的性能指标。

分析用的流动相往往与柱子的保存试剂不同,故在分析样品之前,应使用合适的试剂将柱子中的保存试剂清洗出来。

要注意清洗用的流动相与保存溶剂的相溶性。

、反相柱如岛津、等柱保存在甲醇中,可用～倍柱体积的甲醇或乙腈来平衡色谱柱。

流速应缓慢提高,如开始～后可慢慢加快。

、正相柱或称极性色谱柱一般保存在正庚烷或正己烷中。

如果分析时的流动相含有极性溶剂,应使用乙醇或异丙醇冲洗,流速～ ,将保存液冲洗干净后,再用流动相平衡。

液相色谱柱的使用注意事项流动相和样品处理液相色谱操作规程

液相色谱柱的使用注意事项流动相和样品处理液相色谱操作规程液相色谱柱的使用注意事项：流动相和样品处理 1. 色谱柱使用前注意事项：色谱柱的储存液无特别说明，均为评价报告所示的流动相。

在使用前，确定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是液相色谱柱的使用注意事项：流动相和样品处理 1. 色谱柱使用前注意事项：色谱柱的储存液无特别说明，均为评价报告所示的流动相。

在使用前，确定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。

在反相色谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用10％左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很简单析出，堵塞色谱柱。

2. 流动相：1）在进行样品检测前，至少使用20倍柱体积流动相使色谱柱充分平衡。

流动相确定要使用色谱级别的溶剂。

如使用水相的缓冲液应当天配制以保持新鲜避开细菌产生。

2）流动相使用前需用微孔滤膜过滤,除去流动相中颗粒对色谱系统和色谱柱的损坏。

缓冲液与其他流动相混合后应重新过滤避开溶解度变化造成产生新的沉淀。

不应使用纯水作为流动相冲洗C18色谱柱，以免柱性能损坏（添加5％的有机溶剂冲洗色谱柱，同时可以达到对缓冲盐清洗的作用。

还可以使色谱柱更简单平衡）。

3）流动相需脱气后使用，可避开因气泡导致的泵和检测器的工作不正常。

假如测试时使用的流动相与色谱柱保存使用的流动相有较大区分，应当使用过度分布的形式进行平衡。

避开由于流动相的蓦地变化造成柱压加添过大或流动相缓冲盐结晶造成对色谱柱和仪器系统的损坏。

正相色谱柱比反相色谱柱需要更长的平衡时间。

4）流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯，配流动相的水*好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。

假如将所配得流动相再经过0.45μm的滤膜过滤一次则更好，尤其是含盐的流动相。

另外，装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应当定期清洗或更换。

5）以常规硅胶为基质的键合相填料通常的PH值适用范围是2.0—8.0，BDSC18适合于碱性化合物，PH值适用范围为2.0—10.0、当必需要在PH值适用范围的边界条件下使用色谱柱时，每次使用结束后立刻用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗，并完全置换掉原来所使用的流动相。

高效液相色谱管柱清洗流程

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高效液相色谱柱清洗与再生方法

第16卷第2期2010年06月分析测试技术与仪器ANALYS IS AND TEST I NG T EC HNOLOGY AND I N S TRUM ENTSV o l ume16N u mber2June2010专论(71~77)高效液相色谱柱清洗与再生方法刘翻,熊志超,张凌怡,张维冰(华东理工大学化学与分子工程学院,上海 200237)摘要:分别对反相、正相、离子交换、体积排阻及亲和等色谱柱的清洗与再生方法加以系统综述.使用适当的方法对受污染的色谱柱进行清洗与再生,可恢复其部分分离能力,延长使用寿命.对硅胶基质反相色谱柱,可选择一系列溶剂,按洗脱能力逐渐增强的顺序依次冲洗,或者使用二甲基甲酰胺、乙酰丙酮、S D S及盐酸胍等强洗脱试剂清洗;硅胶基质正相色谱柱用极性逐渐增强的溶剂系统冲洗;有机聚合物、石墨碳及氧化锆固定相色谱柱,用稀酸、稀碱和有机溶剂结合清洗,可将受污染的色谱柱柱效提高50%以上.关键词:高效液相色谱;色谱柱;清洗;再生中图分类号:O657.32文献标识码:A文章编号:1006 3757(2010)02 0071 07色谱作为一种高效的分离手段,自1906年Ts w ett创立至今百余年来得到了长足发展.高效液相色谱(H PLC)是20世纪60年代后期发展起来的一种色谱方法,已成为现代分离测定的重要手段,广泛运用于石油、化工、食品科学、环境及生物等几乎所有研究领域[1].色谱柱是色谱分离系统的"心脏",由于被分析样品种类繁多,加之样品基质复杂,色谱柱极易被污染,是导致柱压升高、分离能力下降的原因之一[2].通常,样品中含有一些对分析不利的物质,这些非目标物能被检测器检测到而形成色谱峰、气泡、基线漂移或负峰.其中保留值较弱的物质,一般能快速从色谱柱冲洗出来,对分析不产生干扰.中等保留强度的杂质能被缓慢冲洗出来,但对分析产生一定的干扰.强保留杂质通常难以被洗脱,多次上样后,聚集在柱头或色谱柱中.有的分析物甚至可能在使用时与填料发生相互作用.这些被吸附的杂质累积到一定程度后会形成新的伪固定相,从而改变色谱柱的性能.对于基质复杂的样品,一根色谱柱的使用寿命可能只有百余次.而且每种色谱柱适用的样品有限,一次错误进样甚至可能导致色谱柱失效.中国市场调查研究中心在中国反相色谱柱市场调查及投资策略分析报告中估计,中国每年消耗的分析型反相色谱柱达5万支[3].这些被污染的色谱柱有一部分经简单的方法进行清洗后,可恢复部分甚至大部分离能力,不仅节省资源,还能大大降低分离分析的成本.色谱柱的清洗与再生方面的研究具有十分重要的现实意义,也一直是色谱工作者和仪器厂商关注的热点.很多色谱专著介绍过色谱柱清洗与再生,并提出许多简单有效的方法,各色谱柱厂商也推荐对应其商品色谱柱的经验性方法.本文对液相色谱柱清洗和再生方法加以系统综述,并在此基础上对各种色谱柱的清洗和再生提出建议.1 反相色谱柱的清洗和再生反相色谱法是当今液相色谱法中应用最广泛的一种技术,它能分析非极性、可离子化和离子化样品,应用比例超过90%.随着HPLC技术的发展,色谱柱的种类也越来越多,除经典的键合硅胶固定相填充柱,还有如聚合物填充柱、聚合物整体柱及以氧化锆基质固定相为代表的其它无机基质固定相色谱柱.这些色谱柱因其固定相基质差异,具有不同的物收稿日期:2010-01-25; 修订日期:2010-03-25.基金项目:国家自然科学基金资助项目(20675083);国家重点基础研究发展规划(973)资助项目(o1CB5m202);科技部十一五国家科技支撑计划重大项目资助(2006BAF07B03).作者简介:刘翻(1983-),男,博士研究生,主要从事色谱研究工作.通讯联系人:张维冰,教授.E-m a i:l w e i bi ngzhang@理和化学性质及应用范围,其清洗与再生方式也存在一定差别.1.1 硅胶基质反相色谱柱的清洗与再生在反相色谱中,硅胶基质色谱柱使用比例达70%,被应用于各种样品的分析.清洗硅胶基质反相色谱柱,关键是弄清楚污染物的性质,并且能找到合适的溶剂将其洗脱.对于被不同样品污染的色谱柱,如常规样品污染、蛋白质污染及金属离子污染的色谱柱,具有对应的清洗和再生方法.1.1.1 常规样品污染色谱柱清洗与再生方法被常规样品污染的硅胶基质反相色谱柱,已有各种清洗与再生方法.其中最常用的是用20倍柱体积(这里柱体积指色谱柱内空腔体积,表1列出了常用规格分析柱柱体积[4])的乙腈!二氯甲烷!正己烷!二氯甲烷!乙腈冲洗色谱柱[5],或者用强度更弱的溶剂系统清洗,即:水!乙腈!氯仿(或异丙醇)!乙腈!水冲洗,其中水冲洗步骤可以省略[6].艾杰尔公司使用乙腈∀水(5∀95,V/V)!四氢呋喃!乙腈∀水(5∀95,V/V)冲洗10倍柱体积,此方法达到较为理想的结果,同时能大大节省时间.强酸和强碱溶液会导致硅胶基质填料溶解,但是在某些条件下使用稀酸可以将有机溶剂不能洗脱的污染物去除,如用甲醇!氯仿!甲醇冲洗20倍柱体积达不到清洗效果,可依次用20倍柱体积水、0.05m o l/L的硫酸和流动相溶液冲洗色谱柱,可取得良好效果.经过多次进样的色谱柱,用90%~100%的溶剂B(强洗脱溶剂)冲洗20倍体积即可清除污染物[7-9].当强洗脱溶剂无法洗脱时,则有必要用更强的一种或一系列溶剂清洗,即:100%甲醇!100%乙腈!乙腈∀异丙醇(75∀25,V/V)!100%异丙醇!100%二氯甲烷或100%正己烷.根据色谱柱具体使用情况,在清洗过程中可省略一个或多个有机溶剂[4].表1 不同柱长的H PLC色谱柱柱内死体积Table1 Colu m n volu m es of analytical col umn s柱尺寸/mm 柱内死体积/mL柱尺寸/mm柱内死体积/mL4.6#2502.54.6#1001.04.6#2002.04.6#500.54.6#1501.5除了以上这些方法之外,还有一些使用更强溶剂、耗费时间较短的方法.依利特公司用20倍柱体积的二氯甲烷∀甲醇(96∀4,V/V),加1%氢氧化铵冲洗,其中加入的氢氧化铵对聚集在柱头的污染物具有良好的清洗效果.二氯甲砜也被The m o公司用于色谱柱的清洗,具体方法是:在用水冲洗色谱柱同时进4等份的200 L二氯甲砜,然后依次用甲醇、氯仿和甲醇冲洗.用N,N-二甲基甲酰胺、丙酮依次冲洗色谱柱,可将色谱柱柱效提高约50%[10].这些方法耗时短,但使用的特殊溶剂,如氢氧化铵、二氯甲砜、N,N-二甲基甲酰胺等,均对色谱固定相有一定损伤.当色谱柱被严重污染,可在低于0.5mL/m i n的流速下用二甲基亚砜(D M SO)或50%二甲基甲酰胺-水冲洗色谱柱[4].实验证明在线清洗与再生的方法对非严重污染色谱柱非常有效,对污染特别严重的色谱柱不能达到理想效果,需将固定相从色谱柱内取出,进行清洗再生后重新装填.具体操作是:将色谱固定相从色谱柱内打出后,用甲醇浮选,去除其中细小的破碎颗粒;然后用二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇超声清洗;最后70∃水浴蒸干固定相,重新装填色谱柱.经该方法处理的色谱柱,性能可得到显著提高[10].由上述方法可以看出,一般清洗方法所用的溶剂系统,溶剂洗脱强度均逐渐增加,使用强疏水性溶剂(如氯仿和正己烷)溶解非极性物质如类脂和油类,这类物质往往是色谱柱污染的最主要原因.正如正相与反相系统替换时,必须使用过渡溶剂冲洗系统,在色谱柱清洗与再生过程中,也必须保证一系列溶剂中每种溶剂都均与下一个溶剂互混.异丙醇能与正己烷或二氯甲烷互溶,又与水相溶剂互溶,常在清洗过程中用作过渡溶剂.但是异丙醇粘度非常大,需使用较低的流速以免导致泵压过高.而使用过渡溶剂,清洗步骤繁琐,正如M ajors所说:这是一个繁杂而又非常耗时的过程[4].此时利用梯度系统进行过夜操作是最好的选择,但梯度操作的系统要求更高,对一个复杂的清洗方法往往需要四元甚至五元梯度系统.1.1.2 金属离子污染色谱柱的清洗当色谱柱被金属离子污染后,一般的清洗方法无法生效,需使用特殊的清洗方法.磷酸和0.1m ol/L柠檬酸对色谱柱上吸附的金属离子具有较好的清洗效果,因此常被人们用来清洗被金属离子污染的色谱柱[7].乙二胺四乙酸(EDTA)能同许多金属离子形成配合物,0.05m o l/L的EDTA水溶第2期刘翻,等:高效液相色谱柱清洗与再生方法液也可用来去除色谱柱中金属离子污染物[4].这些试剂虽然能去除金属污染物,但也存在一些缺陷,如水溶液对固定相的浸润性较差,清洗效果不太理想;磷酸对固定相上键合相有一定的破坏作用;EDTA 带入钠离子,对固定相性能产生影响.以乙酰丙酮-甲醇冲洗色谱柱,可以有效去除金属离子污染物,同时可避免上述不利影响.该方法操作步骤是:将固定相用乙酰丙酮超声清洗1~3m i n,然后以甲醇萃取出乙酰丙酮[10].对于键合色谱固定相,如果确认了填料表面官能团配基断裂流失,可将合适的硅烷化试剂通入色谱柱,在一定温度下使之与表面暴露的-OH活性基团反应,使硅烷分子中的烷基重新键合在失效的填料颗粒表面.这种原位重新键合的再生方法仅能恢复部分柱效,且对5 m填料再生后柱压力容易偏高[11].1.1.3 蛋白质污染色谱柱的清洗随着蛋白质组学的发展,反相色谱柱也被广泛运用于蛋白质和多肽的分离,蛋白质对反相色谱柱的污染已成为常见问题.蛋白质分子量大,同时具有亲水和疏水特性,对很多物理和化学因素敏感.一般情况下,纯有机溶剂如乙腈或甲醇不能很好溶解多肽和蛋白质,不能有效地清洗色谱柱,因而需要一些特殊的清洗方法.现常用方法是用不含缓冲盐的流动相!0.1% TFA(三氟乙酸)水溶液!乙腈∀异丙醇(1∀2,V/V,含0.1%TFA)!流动相冲洗20倍柱体积[12].或先用去除缓冲盐的流动相运行一个梯度洗脱程序(A: 0.1%的三氟乙酸水溶液;B:乙腈∀异丙醇=1∀2, V/V,内含0.1%三氟乙酸,30m i n内B由25%到100%);然后用0.1%稀硝酸∀异丙醇(1∀4,V/V)冲洗40倍柱体积,最后用10倍柱体积的水∀异丙醇(1∀4,V/V)冲洗色谱柱[13].当上述方法无效时,可使用一些苛刻的试剂,如盐酸胍、二甲基甲酰胺及表面活性剂等.如用50%异丙醇水溶液冲洗时,将6 m o l/L盐酸胍水溶液与异丙醇按1:l混合,进样250 L;或者用30%二甲基甲酰胺水溶液清洗,时间不超过30m i n,处理后反复用水、甲醇冲洗.在常规流动相冲洗色谱柱时注射500 L的1%十二烷基硫酸钠(SDS),然后用5%~95%乙腈/水(含0.1% TFA)梯度冲洗,去除蛋白污染物效果也较好[14]. W aters公司研究发现,反复注射200 L二甲亚砜可以有效去除蛋白类物质.甚至在一些特殊的情况下,若已确定蛋白质污染物种类,可将对应蛋白水解酶(如1%胰蛋白酶或木瓜蛋白酶)注入色谱柱,将蛋白质水解为肽,再用盐溶液洗脱.当确定色谱柱被蛋白质污染后,应首先尝试用含高比例强溶剂的流动相进行冲洗(溶剂B),或重复用三氟乙酸水溶液-三氟乙酸丙醇溶液的上升-下降梯度清洗和注射三氟乙酸清洗.如这些方法不能得到理想结果,可用表2中的溶剂从上往下进行冲洗(根据具体情况,可以省略其中几步).其中尿素和胍是为洗脱非特异性吸附的蛋白[14],使用后至少需用40-50倍柱体积的水冲洗色谱柱[4].表2 蛋白污染反相色谱柱常用清洗溶剂组成Tab le2 W ashing solvents for re m oving prote i naceous m ater i a l fro m HPLC reversed-phase co l umn s清洗溶剂溶剂配比乙酸1%水溶液三氟乙酸(T FA)1%水溶液0.1%T FA∀异丙醇40∀60(V/V)(黏度较大,需调整流速)三乙胺(TEA)∀异丙醇40∀60(V/V)(混合前用磷酸将三乙胺调至p H=2.5)尿素或胍水溶液5~8m o l/L(调节p H=6~8)氯化钠、磷酸钠或硫酸钠水溶液0.5~1.0m ol/L二甲亚砜(DM S O)∀水或二甲基甲酰胺∀水50∀50(V/V)总之,被污染的硅胶基质色谱柱,应根据污染物类型和污染程度选择合适的清洗与再生方法.被常规样品污染的反相硅胶键合色谱柱,现有常规清洗与再生方式大致相同,从极性溶剂清洗至非极性溶剂,然后恢复至极性溶剂状态.这些方法,一方面耗时长,另一方消耗溶剂量大,同时再生效果不一定好.使用一些特殊的强溶剂清洗,又对色谱柱填料造成损害.因此,清洗与再生色谱柱时应根据实际情况而定,对污染程度较轻的,用甲醇!二氯甲烷!甲醇分别冲洗20倍柱体积;污染较严重的色谱柱,使用甲醇!二氯甲烷!甲醇!0.05m o l/L硫酸各冲洗20倍柱体积,或者用甲醇!50%二甲基甲酰胺水溶液!丙酮!甲醇分别冲洗10倍柱体积,能取得较好效果同时耗费时间较短.对严重污染的色谱柱,可先依次用二甲基甲酰胺、丙酮、乙酰丙酮、甲醇冲洗20倍柱体积.如效果不理想,可将色谱填料从色谱柱中73分析测试技术与仪器第16卷取出,然后用甲醇浮选,去除填料中细小破碎颗粒;再用二甲基甲酰胺!丙酮!乙酰丙酮!甲醇超声清洗;最后重新装填.同时该方法还可去除金属离子污染物.蛋白质污染色谱柱,不论是用高浓度的磷酸盐溶液,还是用尿素或胍来清洗色谱柱,对色谱柱都会产生较大损伤,同时损害色谱仪器.使用注射1% SDS法清洗色谱柱,不仅节省时间,还能得到较好的效果,是现有清洗方法中较优的选择.1.2 有机高分子类反相色谱柱的清洗与再生有机高分子色谱柱,如其中最普通的聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)颗粒或整体材料装填的色谱柱,可在很宽的pH范围内使用(通常为p H= 1~13,有的可达p H=0~14),在反相色谱中被广泛应用,特别是生物样品分析[15].对被普通生物样品污染的有机高分子类反相色谱柱,The m o、依利特及艾杰尔等厂商推荐用1.0m ol/L的硝酸或氢氧化钠清洗.被难溶性蛋白(如膜蛋白、结构蛋白和病毒膜蛋白)污染的有机高分子色谱柱,需要苛刻的清洗条件,如用含3m o l/L盐酸胍的50%异丙醇水溶液在60∃下冲洗,或者依次用3~5倍柱体积100%的异丙醇、二氯甲烷、异丙醇、原始流动相冲洗,可取得良好效果[4].在淋洗液中添加浓度为6~ 8m ol/L的尿素或0.2%~0.3%的表面活性剂冲洗色谱柱,可去除其中强保留生物污染物.用0.5~ 1 0m o l/L氢氧化钠水溶液在室温下冲洗1h以上,可使色谱柱中微生物失活或将其洗脱.根据聚合物上键合的功能团不同,使用不同的清洗方法效果更佳(Shodex公司):没有键合功能团的有机高分子色谱柱用50m L二氧六环!乙腈或甲醇冲洗,或用含有0.1%TFA的异丙醇!100%流动相B!100%流动相A以一半工作流速冲洗5~10倍柱体积;键合磺酸基的有机高分子色谱柱,可用50mL乙腈和50mm o l/L氢氧化钠冲洗,或者注射20~50 L的0.5m o l/L氢氧化钠或2m o l/L硝酸清洗;键合苯基的有机高分子疏水性色谱柱,用洗脱溶剂在0.5mL/m in流速下反冲,并注射几次1~2 mL的0.1m ol/L氢氧化钠或30%硝酸;含丁基或乙基的甲基丙烯酸脂整体柱,可以在反流向情况下分别用10倍柱体积的1.0m o l/L氢氧化钠!水! 20%乙醇!工作缓冲液冲洗.应注意,虽然高交联聚合物具有好的机械稳定性,在水及有机溶剂中只发生极小的溶胀,在某些特殊的溶剂中其会溶解或发生大的收缩或膨胀,在使用一系列有机溶剂清洗聚合物柱前,最好先查阅说明书或咨询厂家.一般来说,受污染的有机高分子反相色谱柱可用50mL乙腈反冲,并辅以注射几次20~50 L1m o l/L氢氧化钠溶液或硝酸清洗.对强保留的蛋白质污染物,使用50%异丙醇并注射少量SDS清洗,然后用甲醇冲洗,可得到较好结果.1.3 石墨化碳和金属氧化物基质填料色谱柱清洗与再生氧化锆较硅胶惰性更强,涂敷了氧化锆的色谱填料,能够经受住苛刻的操作环境,如高的p H值和操作温度.由于其特殊的表面特性,碳酸、氟化物、磷酸根等离子会强烈地吸附于氧化锆色谱填料上.为将它们从色谱柱中清除,可以用酸、碱和有机溶剂结合清洗:50倍柱体积的20%乙腈!0.1m o l/L氢氧化钠水溶液或0.1m ol/L四甲基氢氧化铵水溶液! 10倍柱体积水!10倍柱体积的20%乙睛-0.1m o l/L硝酸!10倍柱体积水!20倍柱体积有机溶剂依次冲洗(Z ir Chr om公司).石墨化碳也被用作反相色谱柱填料,这种填料的性质不同于硅胶基质烷基键合相,其表面即是保留的基础,不再需其它表面改性.该类填料一般比烷基键合硅胶及多孔聚合物填料保留能力更强,常用于分析强亲水性物质.对受污染的石墨化碳色谱柱,在聚合物色谱柱清洗溶剂中加入20%的四氢呋喃,即可达到清洗与再生目的[4].不同的分析样品中具有不同的污染物,而这些污染在色谱柱上保留行为也不一致,对被分析不同样品的色谱柱,使用对应的清洗与再生方法具有更佳的效果.根据The m o公司介绍,对于分析不同样品的受污染石墨化碳反相色谱柱以下方法分别进行清洗,可显著提高被污染色谱柱的柱效:(1)离子类分析物:酸碱再生.将色谱柱反接,依次用50mL含0.1%三氟乙酸的四氢呋喃∀水(1∀1,V/V)溶液、含0.1%三乙胺或氢氧化钠的四氢呋喃∀水(1∀1,V/V)溶液、含0.1%三氟乙酸的四氢呋喃∀水(1∀1,V/V)溶液冲冼,然后用70倍柱体积的四氢呋喃冲洗,最后用95%甲醇水溶液重新平衡.(2)极性或离子型分析物:强有机溶剂再生.依次以50mL丙酮、120mL二丁醚、50mL丙酮冲洗色谱柱,最后用流动相平衡.(3)三氟乙酸的去除:用70倍柱体积四氢呋喃冲洗.74第2期刘翻,等:高效液相色谱柱清洗与再生方法(4)二乙胺的去除:用乙腈在75∃下冲洗120倍柱体积.2 正相色谱柱的清洗与再生通常正相色谱柱的清洗与再生方法与反相色谱柱用极性逐渐减弱的溶剂系统冲洗相反,其用极性逐渐增强的溶剂系统冲洗[16].根据The m o公司研究,硅胶、氧化铝、极性键合相色谱柱按以下方法冲洗:3-甲基戊烷或己烷!三氯乙烷!乙酸乙脂!丙酮!乙醇!水,然后以这些溶剂逆序冲洗,最后以流动相平衡.该方法从非极性溶剂缓慢过渡至极性溶剂水,然后逆序冲洗至非极性溶剂,对色谱柱损伤小,且具有良好的再生效果.然而该方法耗时长,消耗溶剂多,在很多时候应用较少,因此在具体应用过程中可省略其中一种或几种溶剂.Ag ilent公司使用的方法更简洁,用甲醇∀氯仿(50∀50,V/V)!乙酸乙酯反冲色谱柱,然后再按正方向用流动相平衡.常规硅胶或硅胶基质正相色谱柱,也可依次以四氢呋喃、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷和无苯正己烷冲洗40 ~60倍柱体积[15],或用5%~95%乙腈水溶液的60 m in梯度清洗,然后用30mL含2.5%二甲氧基丙烷和2.5%冰醋酸的正己烷溶液冲洗色谱柱,除去硅胶上吸附的水(艾杰尔公司).对强惰性的石墨化碳和有机聚合物正相柱,可以使用一些强酸或强碱清洗.Shodex及The m o公司用的稀酸和稀碱结合清洗法,可将有机聚合物正相柱上大部分污染物洗脱:5mL水!60mL的0 1 m o l/LH C l O4水溶液!5mL水!60m L的0.1mo l/L N a OH水溶液!5mL H2O在0.5mL/m i n流速下反向冲洗.使用0.1m o l/L盐酸与有机溶剂结合清洗石墨化碳柱,也具有良好的再生效果:二氯甲烷、甲醇、水、0.1mo l/L盐酸、水、甲醇、二氯甲烷,最后用流动相冲冼至平衡.3 离子交换色谱柱的清洗与再生离子交换色谱柱在极端pH范围和高盐浓度条件下长时间使用,或者分析蛋白等生物类样品后,盐离子及蛋白质会吸附于固定相表面,导致色谱柱分离能力下降,柱压升高,峰形变差.常用离子交换色谱柱的清洗与再生一般首先用纯水除去柱中盐,然后以有机溶剂(如甲醇)除去基于分配作用吸附在填料上的杂质,再用纯水冲洗色谱柱;或者用0.1m o l/L柠檬酸洗涤,然后用水洗去柠檬酸[4].阴、阳离子交换色谱柱性质存在一定差异,使用不同清洗方法可能会取得更好效果.如阴离子交换柱用水、3%的H2BO3或N a OH(非硅胶基质)冲洗,阳离子交换柱用水和酸冲洗.依利特及The m o公司均推荐用水!甲醇!氯仿冲洗阴离子交换色谱柱;阳离子交换色谱首先以水冲洗,并在冲洗过程中注射4等份200 L二甲基亚砜,再用四氢呋喃冲洗.硅胶基质离子交换色谱柱,限于硅胶的性质不能使用强酸或强碱清洗,树脂离子交换色谱柱则无此限制.对树脂离子交换色谱柱,高浓度的盐溶液(1~2m o l/L的N a C l溶液)即可恢复其大部分分离能力,油脂等少数与树脂紧密结合的物质可用低浓度酸或碱溶液(如0.1~0.2m o l/L的N a OH水溶液,20%~40%乙酸水溶液)冲洗除去.硅胶柱可用一定程序的水溶液清洗,亦可达到再生的目的: 0.5~1.0m ol/L的盐缓冲溶液!pH为2~3的缓冲溶液!添加水溶性有机溶剂(如10%~20%浓度的甲醇、乙腈、乙醇等)的缓冲溶液!添加8m o l/L尿素或非离子型表面活性剂的缓冲溶液[17].对于分析生物样品的离子交换色谱柱,可以使用一些特殊的方法进行清洗和再生.四氢呋喃-乙腈或甲醇冲洗可去除脂类;乙腈!丙醇!1%三氯乙酸进行梯度冲洗可去除蛋白质;在乙腈或甲醇冲洗同时反复注入四氢呋喃(100~200 L)可去除某些高疏水性化合物[18].通常吸附在固定相表面的酸性有机物用低p H缓冲液冲洗,碱性有机物用高p H缓冲液冲洗,然后依次用蒸馏水、甲醇、二氯甲烷、甲醇、水冲洗[16].离子交换柱中强吸附的蛋白质可使用蛋白酶去除:将2%的酶溶液700~800 L用高压泵注入色谱柱中,37∃反应24h,再先后用0.025 m ol/L磷酸盐缓冲溶液(p H7.1)和含0.5m o l/L NaC l的0.025m o l/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.1,流量0.5m L/m in)进行充分淋洗.该方法对已知被蛋白质污染十分严重的色谱柱,能取得非常好的效果,且重复性良好[18].对受污染的离子交换色谱柱,可根据色谱柱性质及具体污染情况,选择强酸性或强碱性溶液、高盐溶液、含有机溶剂的缓冲溶液、含尿素等溶剂或表面活性剂(非离子型表面活性剂)的缓冲溶液、某些蛋白质变性剂(如盐酸胍和尿素等)以及蛋白酶中一种或几种组合进行清洗和再生.4 体积排阻色谱柱的清洗与再生体积排阻色谱是基于分子尺寸大小将物质分离75的一种色谱模式,其使用的色谱固定相包括有机凝胶和无机凝胶固定相两大类.硅胶凝胶色谱柱在酸性条件下官能团会发生脱落,碱性条件下硅胶基质会发生溶解,故清洗时注意清洗液p H值,以免损坏色谱柱.有机聚合物凝胶柱耐受p H范围宽,可以用较极端p H的清洗液进行清洗:用稀氢氧化钠或非离子型去垢剂去除大部分的结合物质,如果污染物是一些难洗脱的蛋白质,则需要使用特殊清洗方法,用90%的乙醇、30%的乙腈或30%异丙醇在低流速下冲洗过夜除去疏水蛋白质.对亲水性蛋白质和肽,可用提取液、去污剂或1m ol/L乙酸低流速冲洗色谱柱过夜,甚至可将溶于0.1m o l/L乙酸和0.5 m o l/L N a C l中的1m g/mL胃蛋白酶注入色谱柱,在37∃孵育1h,再用平衡液冲洗色谱柱除去亲水蛋白质,然后以蛋白水解酶处理分解凝胶中剩余的痕量胃蛋白酶,再用水!甲醇!水冲洗[17,19].清洗与再生体积排阻色谱柱过程中,流速需低于50%最大推荐流速,每种溶液冲洗10~15倍柱体积即可,更换清洗溶剂时需用3~5倍柱体积去离子水将色谱柱冲洗干净.通常体积排阻色谱柱上离子性吸附的碱性杂质可用高浓度中性盐溶液(如0 5m o l/L硫酸钠溶液)去除;含有机溶剂(如10~ 20%的甲醇、乙腈、乙醇等)的缓冲溶液(如50 mmo l/L磷酸盐缓冲液,pH=7.0)可洗脱吸附的疏水性杂质;吸附最强的杂质,可在清洗溶剂中添加尿素、中性表面活性剂(6~8m o l/L的尿素或0.2~ 0 3%的中性表面活性剂)进行洗脱[20-21].5 其他色谱柱的清洗与再生高效液相色谱测定糖醇等物质的含量时,使用特殊的糖醇色谱柱,其价格及其昂贵.对受污染的糖醇色谱柱用0.2m ol/L硝酸钙溶液作为流动相,在85∃下,流速为0.2mL/m i n,反相冲洗色谱柱24h,然后在相同条件下用10~20倍柱体积水冲洗,可取得较好的再生效果,延长色谱柱使用寿命,降低分析成本[22].基于特异性吸附作用将物质分离的亲和色谱柱和手性色谱柱,可依据具体色谱柱的特性,选择合适的强洗脱液,在0.5mL/m i n流速下反向冲洗色谱柱.其它如亲水作用色谱柱和疏水作用色谱柱,根据其使用条件,参照对应色谱模式选择合适清洗与再生方法[23-24].6 结论被污染的色谱柱,根据其具体情况,应选择合适的清洗与再生方法进行清洗,一般可将其柱效提高50%以上.对硅胶基质反相柱,污染情况较轻时可选择一系列溶剂,按洗脱能力逐渐增强的顺序依次冲洗,如甲醇!二氯甲烷!甲醇!0.05m ol/L硫酸各冲洗20倍柱体积;当其被严重污染时,可依次用二甲基甲酰胺、丙酮、乙酰丙酮、甲醇冲洗20倍柱体积,或将色谱固定相从色谱柱中取出,用二甲基甲酰胺!丙酮!乙酰丙酮!甲醇超声清洗;被强吸附蛋白质污染,使用注射1%SDS法清洗,能得到较好的效果.硅胶基质正相色谱柱用极性逐渐增强的溶剂系统冲洗;有机聚合物、石墨化碳及氧化锆固定相色谱柱(正相或反相均可),用稀酸、稀碱和有机溶剂结合清洗.离子交换色谱柱和体积排阻色谱柱可用高浓度中性盐溶液、含有机溶剂的缓冲溶液及加有尿素、中性表面活性剂的缓冲液进行洗脱;严重污染时可使用强酸性或强碱性溶液(非硅胶基质色谱柱)、蛋白质变性剂以及蛋白酶进行清洗和再生.随着H PLC的发展,新型色谱柱层出不穷,用于分析特殊样品的专用色谱柱被大量应用与生产生活之中.鉴于现有色谱柱清洗与再生方法的局限性和繁杂性、各种专用色谱柱价格昂贵以及新型色谱柱多样性,预计未来色谱柱的清洗与再生方面研究在以下方面会成为热点:%开发使用溶剂少,较现有方法更简单有效的色谱柱清洗与再生方法;&针对各种专用色谱柱的清洗与再生方法;∋适用于新型及CEC等其它类型色谱柱的清洗与再生方法.参考文献:[1] 孙元社,李彤,张玉奎.色谱技术的现状及与人们日常生活的关系[J].科学仪器仪表,2007,9:69-73. [2] Snyde r L R,K irkland J J,G lajch J L.实用高效液相色谱法的建立[M].第2版.张玉奎,王杰,张维冰,译.北京:华文出版社,2001:237-239.[3] 中国市场调查研究中心.中国反相色谱柱市场发展及投资价值分析报告[EB/OL].[2009-12-04].htt p://www.c m rn.co /y jl y/content2-3988.sh t m.l[4] M a j o rs R E.The clean i ng and regeneration o f reversed-phase HPLC co l u m ns[J].LC-G C Europe,2003,16(7):404-409.[5] M a j o rs R E.W ash i ng R eversed-P hase Silica-Based。

高压液相色谱仪维护保养方法说明书

高压液相色谱仪维护保养方法说明书一、前言高压液相色谱仪是一种常用于分析和检测化学物质的仪器设备。

为了保证仪器的正常运行和准确性，定期的维护保养是必不可少的。

本文将详细介绍高压液相色谱仪的维护保养方法，以确保仪器的长期稳定工作。

二、日常维护1. 清洁外观高压液相色谱仪的外观应保持干净整洁，可以使用软布轻轻擦拭，注意避免使用腐蚀性或有颗粒的溶剂。

2. 防尘为了避免灰尘的进入和对仪器产生影响，可以在不使用时给仪器罩上专用的防尘罩。

3. 检查电源定期检查电源线，确认连接牢固，无任何异常情况，确保仪器供电的稳定性。

4. 示波器校准通过示波器校准确保色谱仪的工作稳定，并排除示波器故障对结果准确性的影响。

三、进样口的维护1. 定期抽洗每隔一段时间，使用高纯度溶剂进行进样口的抽洗，以去除残留物和杂质，保证进样口的正常运行。

2. 定期更换环境拦截器环境拦截器在防止进样口进入灰尘和空气中的杂质方面起着重要作用。

定期检查并更换环境拦截器可以确保进样口的稳定性和可靠性。

3. 防止化学反应避免化学反应发生在进样口周围，使用润滑剂或其他化学品时要小心谨慎，以免对进样口产生不可逆的损坏。

四、液相色谱柱的维护1. 检查柱后压力每次使用液相色谱仪之前，都应该检查柱后的压力。

如果压力突然增加，可能是柱损坏的迹象。

在这种情况下，应该及时更换新的色谱柱。

2. 合理使用流速控制流速在推荐范围内，避免使用过高的流速，以免对色谱柱造成磨损或损坏。

3. 定期的消除基线漂移基线漂移是色谱仪使用过程中常见的问题，定期的消除基线漂移可以提高分析结果的准确性。

使用厂家提供的方法进行基线漂移的消除。

五、液相泵的维护1. 定期更换密封圈液相泵的密封圈对泵的密封性能至关重要。

定期更换密封圈可以保证液相泵的正常工作。

2. 液相泵的清洗定期的清洗液相泵可以去除污垢和沉积物，确保泵的流量稳定。

3. 巡检活塞运动通过周期性地巡检活塞的运动，确保液相泵的精度和稳定性。

液相色谱仪使用注意事项

1岛津液相色谱仪使用注意事项1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。

2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。

3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。

4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。

对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。

5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。

6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。

7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。

8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。

清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。

9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。

10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。

11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。

12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。

更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。

液相色谱柱使用经验谈色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。

但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。

1、样品的前处理：a、最好使用流动相溶解样品。

b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

c、使用0.45µm的过滤膜过滤除去微粒杂质。

液相色谱仪日常维护办法

液相色谱仪日常维护办法概述液相色谱仪是一种常用的分析仪器，广泛应用于化学、生物、环境等领域。

为了保证色谱仪的正常运行和数据准确性，我们需要定期进行维护和保养工作。

本文将介绍液相色谱仪的日常维护办法，以帮助用户正确操作和保养仪器。

1. 检查系统在使用液相色谱仪之前，需要检查仪器的各个部件是否正常工作，特别是流动相供给系统和检测器：•检查流动相供给系统的泵是否正常运转，是否存在漏液或堵塞的情况。

•检查检测器的灵敏度是否正常，光源和检测器是否工作正常。

•检查色谱柱的连接是否牢固，并清洁柱端和柱头。

2. 清洗色谱柱液相色谱仪的色谱柱是关键部件之一，需要经常清洗和保养，以保证分离效果和柱寿命。

•使用高纯度甲醇或乙醇对色谱柱进行洗脱，去除残留样品和杂质。

•使用纯净水反向洗脱色谱柱，以去除有机溶剂和离子残留。

•用流动相溶液进行平衡，保证柱的稳定性和分离性能。

•在更换新的色谱柱时，应注意废弃旧柱时的环保处理。

3. 校准系统为了保证液相色谱仪的准确性和可靠性，在每次使用前都应进行校准。

主要包括：•校准流速：使用标准溶液进行流速校准，确保流速准确。

•校准波长：使用标准溶液进行波长校准，确保检测器波长准确。

•校准峰宽：使用标准样品进行峰宽校准，确保分离效果准确。

4. 检测器维护检测器是液相色谱仪的核心部件，其稳定性和准确性对分析结果影响很大。

需要定期进行以下维护：•清洁光源：使用纯净棉签轻轻擦拭光源窗口，去除灰尘和污垢。

•清洁流动池：使用纯净棉签沾取纯净水擦拭流动池表面，去除残留样品。

•定期更换灯泡：根据使用寿命更换灯泡，确保检测器的灵敏度和稳定性。

5. 数据处理和保存在完成实际分析后，及时处理和保存分析数据是非常重要的。

以下是一些常见的注意事项：•定期备份数据：将分析数据备份到云存储或其他介质，以防止数据丢失。

•数据归档：建立规范的数据归档体系，方便后续查询和追溯。

•数据报告：根据需要生成数据报告，包括关键参数、分析结果和结论。

液相色谱柱清洗和再生

高效液相色谱柱的清洗和再生1. 清洗反相色谱柱使用一段时间后，通常总会育一些物质吸附于柱子上，造成柱效下降，选择性改变，甚至柱压也会稍稍上升。

这时，可以以20倍柱体积或更多一些的强溶剂加以清洗。

例如，90%~100%的甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃等。

如果效果仍不理想，则可换用更强的溶剂清洗，例如，将系统逐步置换至乙酸乙酯、异丙醇、氯仿、烃类（如己烷、庚烷等）。

也可以在甲醇、乙腈等水溶性溶剂之后，改用50%DMSO或DMF水溶液加以清洗。

清洗几十倍柱体积后，在逐步置换返回原系统。

（常用的标准HPLC柱为Φ4.6mm×250mm，其内腔体积约为4.2mL）对于使用过缓冲液的柱子，必须先将体系中盐分去除干净，然后再以强溶剂清洗。

通常可以同浓度但不含缓冲液成分的流动相洗20倍柱体积，亦可直接以纯水洗至柱内无盐后再改换成强溶剂洗脱。

如使用了有UV吸收的溶剂（如氯代烃等），则需以低紫外吸收性的溶剂逐步置换，并在得到稳定的基线后才能正常使用。

有一些强溶剂，如DMSO、DMF等，黏度较高，使用时可能会造成较高的柱压，应注意不使其超过仪器的压力范围。

2. “掉头使用”由于柱子入口端的污染较为常见，因此，有时可以“掉头使用”，以便将固体污染物冲洗至柱外。

但是，新柱子不宜进行此操作，使过一段时间的柱子用用无妨。

但要注意：若入口端滤片孔径较大，则不可掉头使用，以免将填料冲走，破坏柱床结构；此外，掉头使用时宜卸下检测器，以免冲出来的污染物污染检测器。

3. 蛋白质分离用柱子清洗蛋白质分离用的柱子有其特殊性。

蛋白质分子量大，带有电荷，分子既有疏水部分也有亲水部分，对很多物理和化学因素敏感而易变性，也容易受霉菌和细菌的浸染而变性或分解。

因此，蛋白质分离用的柱子的损坏和性能降低也更为复杂。

一般情况下，蛋白质柱可用20倍体积以上的1%乙酸水溶液、0.1%三氟乙酸-丙醇（或异丙醇）（V/V, 40/60）、50%DMSO或DMF水溶液冲洗，若不奏效，则以水置换后改用0.5~1.0mol/L的中性盐（如NaCl或KCl溶液等）往往可以有效。