发光免疫技术

发光免疫分析技术
发光现象
一种物质由电子 激发态回复到基 态时，释放出的
能 量 表 现 为光的
发射，称为发光 。
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化学发光免疫技术
发光酶免疫分析
化学发光免疫分析
电化学发光免疫分析
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发光酶免疫分析
酶免疫分析的发光底物
辣根过氧化物酶 鲁米诺及其衍生物
对-羟基苯乙酸(HPA)
碱性磷酸酶
4-甲氧基-4-甲基-4-(3-磷酸氧基)-苯基1,2-二氧乙烷(AMPPD) 4-甲基伞酮磷酸盐(4-MUP)
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鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）
碱性缓冲液中直接发光
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HPA
激发后发射荧光
450nm
350nm
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AMPPD
碱性缓冲液中直接发光
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4-MUP
激Байду номын сангаас后发射荧光
448nm
360nm
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二价三联吡啶钌阳极表面被氧化，形成三价
三联吡啶钌（强氧化剂），被自由基TPA还原
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电化学发光原理
激发后三联吡啶钌不稳定回到基态并发光
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标记物的制备
三联吡啶钌[Ru(bpy)32+作为电化学 发光分析的标记物，分子中含有N羟基琥珀酰胺（-NHS）可以抗体、 抗原分子中的氨基结合形成稳定化 合物。 三丙胺（TPA）作为电子供体，参 与电极表面的氧化还原反应。
双抗体夹心化学发光酶免疫分析
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双抗体夹心荧光酶免疫分析
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仪器设备
直接检测
鲁米诺（HRP） VITROS Eci 全自动增强化学发光免 疫分析系统（ABS、发光增强剂） 金刚烷（AP） Lumi-Phos 480 （美国lumingen公司）
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（直接）化学发光免疫分析
标记抗原在溶液中转动速度快，偏振荧 光强度大。若待测抗原浓度高，与标记 抗原竞争，抗体结合待测抗原无荧光素 标记，荧光强度减弱。
化学发光免疫分析
标记物具有较低本底，发光过程简 单； 容易进行标记物制备且稳定； 磁性微粒为固相材料，易于包被和 自动化分离； 瞬间发光，对检测仪器要求高；
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应用
血清学乙肝表面抗原，以前诊断是 否感染HBV用酶法，酶法缺陷为低 表面抗原携带者漏检，化学发光免 疫分析技术具有高灵敏度和线性范 围宽的特点，在病原学诊断方面比 酶法高。
化学发光剂
吖啶酯（AE)
碱性条件下含有过 氧化氢溶液中发光 （470nm）
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制备吖啶酯标记物
利用N-羟基琥珀酰亚胺，活化抗原或抗 体分子中的羧基，再与吖啶酯中的氨基 结合形成酰胺键。
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双抗体夹心化学发光免疫分析
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直接化学发光免疫分析
吖啶酯发光的氧化反应简单快速： 具备较低背景，确保敏感度； 吖啶酯容易标记，稳定也保存： 瞬间发光，持续时间短，对仪器性能要
求较高；
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电化学发光免疫分析
发光剂
三联吡啶钌作为发光剂
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发光剂
三联吡啶钌
吡啶（氮杂苯） 联吡啶 N羟基琥珀酰亚胺（NSH）修饰 三联吡啶钌活性衍生物
三丙胺（TPA）
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电化学发光原理
TPA失去电子发生氧化成阳离子自由
基后再失去质子成为自由基TPA（强还原剂）
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电化学发光原理
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电化学发光免疫分析（双抗体夹心）
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检测原理
光线通过偏振 滤光片后，形 成一个方向的 平面光称为偏 振光。
偏振光(蓝光,485nm)
荧光物质
偏振荧光(绿光,525nm～550nm)
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检测原理
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检测原理
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检测原理
荧光在特定偏振面的强度与示踪物激发 时转动的速度呈反比，转动的速度与分 子量大小呈反比。