病毒的分离鉴定PPT演示幻灯片
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病毒学- 病毒的检验PPT课件
病毒学- 病毒的检验
常用的病毒检验方法包括：
一、病毒的分离鉴定 二、病毒感染性的检测 三、病毒颗粒检测 四、病毒的血清学检查 五、病毒的分子(蛋白和核酸)检测
一、病毒的分离鉴定
病毒的分离与鉴定可为病毒感染提供最为直 接的病原学证据，同时可为进一步的病毒学 研究提供材料。 病毒的分离和鉴定（含义）：指从病人、带 毒者、外界环境中采集标本经过适当的处理, 采用一系列物理、化学、生物学等手段,将病 毒从标本中分离出来,并通过有关特异性方法 鉴定属于何种病毒,这一方法称为病毒的分离 与鉴定。
（2）鸡胚培养法
鸡胚对多种病毒敏感。 不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异 很大,因此选择适当的接种途径是病毒分离成 功的关键。 一般采用孵化9～14天的鸡胚，根据病毒种类 不同，将病毒标本 接种于鸡胚的不同部位， 最常用的鸡胚接种部位有：尿囊腔、绒毛尿 囊膜、卵黄囊和羊膜腔等。
（3）细胞培养 (cell culture)法或 组织培养法 (tissue culture)
病毒的分离与鉴定包括：
1病毒的形态学观察→4、 病毒的理化特性测定→5、病毒的血清
学鉴定及病毒的分子生物学鉴定等基本
过程。
（一）标本的采取与送检
病料采集适当与否,直接影响病毒的检测结果。 一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌 物或粪便等,主要因动物及病毒的种类而异, 例如检测犬细小病毒或轮状病毒,一般应采腹泻 幼犬或犊牛的粪便;
标本处理：
采集样本在接种细胞、鸡胚或动物之前,都需要做适 当的处理,以保证病毒分离的成功几率。 采集的器官或组织样本：如肺脏、脑、肝、脾、淋巴 结等,可取一小块进行充分研磨,加入含青、链霉素的 Hanks液,离心取上清液作为接种物; 鼻液、脓汁、乳汁等分泌物或渗出液、粪便,应加入 高浓度的抗生素,充分混匀后,置4℃冰箱内处理2~4h 或过夜,离心后取上清做接种用; 咽喉拭子在取样后应迅速将其浸泡入含有2%小牛血 清和一定浓度的青、链霉素的Hanks液中,充分刷洗 棉拭子,反复冻融3~5次,离心后取上清液作为接种材料。
常用的病毒检验方法包括：
一、病毒的分离鉴定 二、病毒感染性的检测 三、病毒颗粒检测 四、病毒的血清学检查 五、病毒的分子(蛋白和核酸)检测
一、病毒的分离鉴定
病毒的分离与鉴定可为病毒感染提供最为直 接的病原学证据，同时可为进一步的病毒学 研究提供材料。 病毒的分离和鉴定（含义）：指从病人、带 毒者、外界环境中采集标本经过适当的处理, 采用一系列物理、化学、生物学等手段,将病 毒从标本中分离出来,并通过有关特异性方法 鉴定属于何种病毒,这一方法称为病毒的分离 与鉴定。
（2）鸡胚培养法
鸡胚对多种病毒敏感。 不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异 很大,因此选择适当的接种途径是病毒分离成 功的关键。 一般采用孵化9～14天的鸡胚，根据病毒种类 不同，将病毒标本 接种于鸡胚的不同部位， 最常用的鸡胚接种部位有：尿囊腔、绒毛尿 囊膜、卵黄囊和羊膜腔等。
（3）细胞培养 (cell culture)法或 组织培养法 (tissue culture)
病毒的分离与鉴定包括：
1病毒的形态学观察→4、 病毒的理化特性测定→5、病毒的血清
学鉴定及病毒的分子生物学鉴定等基本
过程。
（一）标本的采取与送检
病料采集适当与否,直接影响病毒的检测结果。 一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌 物或粪便等,主要因动物及病毒的种类而异, 例如检测犬细小病毒或轮状病毒,一般应采腹泻 幼犬或犊牛的粪便;
标本处理：
采集样本在接种细胞、鸡胚或动物之前,都需要做适 当的处理,以保证病毒分离的成功几率。 采集的器官或组织样本：如肺脏、脑、肝、脾、淋巴 结等,可取一小块进行充分研磨,加入含青、链霉素的 Hanks液,离心取上清液作为接种物; 鼻液、脓汁、乳汁等分泌物或渗出液、粪便,应加入 高浓度的抗生素,充分混匀后,置4℃冰箱内处理2~4h 或过夜,离心后取上清做接种用; 咽喉拭子在取样后应迅速将其浸泡入含有2%小牛血 清和一定浓度的青、链霉素的Hanks液中,充分刷洗 棉拭子,反复冻融3~5次,离心后取上清液作为接种材料。
病毒学病毒的检验ppt文档
常见病毒常用实验动物及接种途径
P37
பைடு நூலகம்
实验动物采血
在动物实验的期间或结束时采集动物血液检测病毒或特 异性抗体。
实验动物采血分为致死性采血和非致死性采血两种。 致死性采血是指尽量采集动物血,直至动物死亡。 非致死性采血是指采集一定量的动物血而不致动物死亡。 对采血动物,应在禁食24h后采血。采血应无菌操作。 不同动物采用不同的采血方法。常用的有心脏采血法、
咽喉拭子在取样后应迅速将其浸泡入含有2%小牛血 清和一定浓度的青、链霉素的Hanks液中,充分刷洗 棉拭子,反复冻融3~5次,离心后取上清液作为接种材料。
（二）病毒的分离与培养
细胞培养、鸡胚和实验动物可用于病毒的分离与培养, 其中细胞培养是用于病毒分离与培养最常用的方法。
用于病毒分离与培养的细胞有原代细胞、二倍体细胞 株和传代细胞系,一般说来,本动物的原代细胞最为敏 感,但不如传代细胞方便易得.
病毒的分离与鉴定包括：
1、病毒材料的采集与准备 →2、病毒的 分离与培养→3、病毒的形态学观察→4、 病毒的理化特性测定→5、病毒的血清 学鉴定及病毒的分子生物学鉴定等基本 过程。
（一）标本的采取与送检
病料采集适当与否,直接影响病毒的检测结果。 一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌
物或粪便等,主要因动物及病毒的种类而异, 例如检测犬细小病毒或轮状病毒,一般应采腹泻
标本处理：
采集样本在接种细胞、鸡胚或动物之前,都需要做适 当的处理,以保证病毒分离的成功几率。
采集的器官或组织样本：如肺脏、脑、肝、脾、淋巴 结等,可取一小块进行充分研磨,加入含青、链霉素的 Hanks液,离心取上清液作为接种物;
鼻液、脓汁、乳汁等分泌物或渗出液、粪便,应加入 高浓度的抗生素,充分混匀后,置4℃冰箱内处理2~4h 或过夜,离心后取上清做接种用;
《病毒的检测》课件
病毒的危害
病毒可以引起各种疾病， 包括感冒、流感、艾滋病 等，对人类和动物健康造 成威胁。
病毒的分类
DNA病毒
DNA病毒以DNA为遗传物质， 感染宿主细胞后，将其DNA 插入宿主细胞的染色体中。
RNA病毒
RNA病毒以RNA为遗传物质， 感染宿主细胞后，将其RNA 整合到宿主细胞的核酸中。
逆转录病毒
快速检测法
快速检测法通过对病毒的核酸、蛋白 质或特定抗原的特异性检测，快速确 定样本中是否存在病毒。
病毒检测实验
1 实验前准备
准备实验室材料、培养 细胞、制备病毒样本， 并按照实验方案进行实 验。
2 病毒检测实验步骤
将病毒样本加入培养细 胞中，观察细胞的形态 和行为变化，以确定是 否存在病毒感染。
未来病毒检测将更加快速、准确和便捷，为疾病的预防和治疗提欢迎大家来到《病毒的检测》PPT课件。在这个课程中，我们将介绍病毒的 特征、分类和检测方法，以及进行病毒检测实验的步骤和结果分析。
概述
什么是病毒
病毒是一种微生物，由蛋 白质和核酸构成，无法独 立进行自我复制，需要感 染宿主细胞。
病毒的特征
病毒具有很小的体积和简 单的结构，可以感染各种 生物，包括人类、动物和 植物。
3 实验结果分析
根据细胞的形态和行为 变化，判断样本中是否 存在病毒，并分析病毒 的类型和浓度。
结语
病毒检测的意义
病毒检测可以帮助我们了解病毒的传播途径和危害，为疾病的预防和治疗提供依据。
病毒检测在防控疫情中的作用
病毒检测可以快速发现感染者，控制疫情的扩散，保护公共卫生安全。
未来病毒检测的发展方向
逆转录病毒包含逆转录酶， 能将自己的RNA转录成DNA， 然后将其插入宿主细胞的染 色体。
微生物实验十 流感病毒的分离培养 PPT课件
• （二）、接种样本 • 将标记好的鸡胚的气室朝上放置在照蛋器上。 • （2）用75％酒精消毒鸡胚，用无菌镊子在气室 端钻孔，再无菌眼科剪剪开10x6mm窗口。 • (3)用注射器吸800µl标本。 • (4)从窗口中滴入无菌的液体石蜡，轻轻晃动鸡胚， 让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯 下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺 入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿， 当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而 动，即可注射200µl标本。将针头退出至½ 寸，将 另外200µl标本注入鸡胚尿囊腔。每个样本接种2全装置中 • (6)用消毒过的医用胶布封口 • (7)33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床 采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养 2天。 • 注意：鸡胚进行病毒分离培养时，每天检 查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚， 认为是非特异死亡应弃去
+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不
二、流感病毒分离之鸡胚培养法
• （一）、检视标记鸡胚 • （1）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 • 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带 或淤血块 • 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 • 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚 • 胎的另一面形成明显的界限 • （2）标记出鸡胚的气室与尿囊的界限 • （3）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发 育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
• • • • •
6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液 7、临床样品0.5mL 8、1mL无菌移液管 9、10mL无菌移液管 10、15mL无菌离心管
• • • • •
（三）实验步骤 1、准备病毒生长液 （1）细胞维持液准备 500mL D-MEM液中加入 ①青、链霉素母液 5mL（终浓度达： 100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素） • ②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度： 0.2%） • ③HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度： 25mM）
第七章2病毒分离鉴定PPT课件
优点：技术简单、来源充沛、价格低廉、数量可 大、不需特殊设备 。
缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的 病毒。
编辑版pppt
14
(三）细胞培养
细胞培养(cell culture)是指利用机械、酶或化 学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至 2～4个细胞团悬液进行培养。
根据细胞的类型和培养 细胞代数的不同，可将 其分为两种。
有血凝素（HA）的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现 象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，原理是 相应抗体与病毒结合后，阻止病毒表面HA与红细胞结合.
血凝试验
血凝抑制试验
编辑版pppt
32
四、 电子显微镜检查
病毒的很多特征如大小、形态、结构等 必须借助电子显微镜进行检查。对于目前尚 难培养而形态又非常典型的病毒，可直接从 感染组织或分泌液，或者接种病料的鸡胚和 细胞培养收获的材料作电子显微镜检查，直 接观察病毒粒子。
编辑版pppt
33
透射电子显微镜
编辑版pppt
34
1. 正染法：超薄切片法
取材
戊二醛 固定
四氧化锇
清洗与 脱水
切片
染色
铀染 铅染
浸透 包埋 聚合
编辑版pppt
35
鸡痘病毒（超薄切片）
编辑版pppt
36
超薄切片法的优缺点：
优点：可观察病毒形态和形态发生过程 缺点：操作复杂，费时，但标本可长时间保存
测定抗体
潜伏期及前驱期 刚发病或急性期
较难查见 最多查见
未增多
未增多或增多 不明显
恢复期及康复期
很难查见
明显增多 （常超过4倍）
编辑版pppt
2
一、标本的处理
缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的 病毒。
编辑版pppt
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(三）细胞培养
细胞培养(cell culture)是指利用机械、酶或化 学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至 2～4个细胞团悬液进行培养。
根据细胞的类型和培养 细胞代数的不同，可将 其分为两种。
有血凝素（HA）的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现 象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，原理是 相应抗体与病毒结合后，阻止病毒表面HA与红细胞结合.
血凝试验
血凝抑制试验
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四、 电子显微镜检查
病毒的很多特征如大小、形态、结构等 必须借助电子显微镜进行检查。对于目前尚 难培养而形态又非常典型的病毒，可直接从 感染组织或分泌液，或者接种病料的鸡胚和 细胞培养收获的材料作电子显微镜检查，直 接观察病毒粒子。
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透射电子显微镜
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1. 正染法：超薄切片法
取材
戊二醛 固定
四氧化锇
清洗与 脱水
切片
染色
铀染 铅染
浸透 包埋 聚合
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鸡痘病毒（超薄切片）
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超薄切片法的优缺点：
优点：可观察病毒形态和形态发生过程 缺点：操作复杂，费时，但标本可长时间保存
测定抗体
潜伏期及前驱期 刚发病或急性期
较难查见 最多查见
未增多
未增多或增多 不明显
恢复期及康复期
很难查见
明显增多 （常超过4倍）
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一、标本的处理
MDCK细胞分离流感病毒ppt课件
• 人流感病毒最初是通过雪貂分离出，但雪貂繁 殖慢，量少，价钱昂贵并难饲养，故无法加以 广泛应用。上世纪30年代中开始，多用鸡胚来 分离流感病毒。
2021/5/30
其实过期
10
• 近来由于PCR技术突习猛进地发展，发现了 通过鸡胚所分离到的流感病毒，其抗原性与 原始标本的有所不同，而通过MDCK细胞分离 出的，其抗原性与原始标本的相似。近来由 于“O”相毒株的重现，MDCK等一些细胞对 “O”相毒株的敏感性大大超出鸡胚的敏感 性。因此，MDCK等一些细胞已成为各流感病 毒分离不可缺少的一种宿主系统。
1
一、组织培养概况
（一）组织培养定义
组织或细胞培养是指从机体中取 出组织或细胞，模拟机体内的生理条 件在体外进行培养，使之生存和生长。
2021/5/30
其实过期
2
（二）、组织培养的原理
组织培养主要是为病毒易感的组织细胞提供一个 良好的生存环境，使细胞对环境产生适应性，获得生 长繁殖的能力。
病毒在敏感细胞中繁殖，常可引起细胞代谢等方 面的变化，可出现细胞病变并释放病毒到维持液中， 这种情况可用细胞病变、色变法及检测维持液中病毒 抗原的方法，判定病毒的存在及滴度。
• 0.25%胰酶和Versene消化液
• 双抗(青、链霉素)或庆大霉素和抗真 菌素
• 胎牛或小牛血清
2021/5/30
其实过期
12
• （1）细胞生长液配制
90ml Eagle’s 液 + 含 终 浓 度 为 100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素+10ml小 牛 血 清 +2ml 5.6%NaHCO3 PH 调 至 7.27.4。
• （6）收获及红细胞凝集活性（HA）检查：当CPE出现 +++～++++号时进行收获，由于CPE无法证实就是流感 病毒所造成。最后还得看维持液中是否有红细胞凝集 活 性 （ HA ） ， 出 现 细 胞 凝 集 的 为 阳 性 标 本 ， 收获所有的维持液进行病毒鉴定，也可暂冻存之 。
2021/5/30
其实过期
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• 近来由于PCR技术突习猛进地发展，发现了 通过鸡胚所分离到的流感病毒，其抗原性与 原始标本的有所不同，而通过MDCK细胞分离 出的，其抗原性与原始标本的相似。近来由 于“O”相毒株的重现，MDCK等一些细胞对 “O”相毒株的敏感性大大超出鸡胚的敏感 性。因此，MDCK等一些细胞已成为各流感病 毒分离不可缺少的一种宿主系统。
1
一、组织培养概况
（一）组织培养定义
组织或细胞培养是指从机体中取 出组织或细胞，模拟机体内的生理条 件在体外进行培养，使之生存和生长。
2021/5/30
其实过期
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（二）、组织培养的原理
组织培养主要是为病毒易感的组织细胞提供一个 良好的生存环境，使细胞对环境产生适应性，获得生 长繁殖的能力。
病毒在敏感细胞中繁殖，常可引起细胞代谢等方 面的变化，可出现细胞病变并释放病毒到维持液中， 这种情况可用细胞病变、色变法及检测维持液中病毒 抗原的方法，判定病毒的存在及滴度。
• 0.25%胰酶和Versene消化液
• 双抗(青、链霉素)或庆大霉素和抗真 菌素
• 胎牛或小牛血清
2021/5/30
其实过期
12
• （1）细胞生长液配制
90ml Eagle’s 液 + 含 终 浓 度 为 100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素+10ml小 牛 血 清 +2ml 5.6%NaHCO3 PH 调 至 7.27.4。
• （6）收获及红细胞凝集活性（HA）检查：当CPE出现 +++～++++号时进行收获，由于CPE无法证实就是流感 病毒所造成。最后还得看维持液中是否有红细胞凝集 活 性 （ HA ） ， 出 现 细 胞 凝 集 的 为 阳 性 标 本 ， 收获所有的维持液进行病毒鉴定，也可暂冻存之 。
病毒分离鉴定54页PPT
61、奢侈是舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
Hale Waihona Puke 谢谢！病毒分离鉴定
21、没有人陪你走一辈子，所以你要 适应孤 独，没 有人会 帮你一 辈子， 所以你 要奋斗 一生。 22、当眼泪流尽的时候，留下的应该 是坚强 。 23、要改变命运，首先改变自己。
24、勇气很有理由被当作人类德性之 首，因 为这种 德性保 证了所 有其余 的德性 。--温 斯顿． 丘吉尔 。 25、梯子的梯阶从来不是用来搁脚的 ，它只 是让人 们的脚 放上一 段时间 ，以便 让别一 只脚能 够再往 上登。
病毒的分离鉴定
病毒的分离与鉴定要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则：①从患病者体内分离出病毒；②在实验动物或寄主细胞中可以培养；③证明这种培养物具有滤过性；④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症；⑤能重新分离出病毒。
1. 病毒的分离1.1 标本的处理1.1.1 标本的收集a）粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000X g, 4C离心6min 。
b）拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml 运载培养基中，将棉拭子中的液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000X g 4C离心30min。
c）组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的PBS制备成20%的悬液，3000X g 4C离心30min。
1.1.2 除菌处理a）粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4C过夜。
b）鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4C作用4小时c）对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4 C过夜除菌。
1.2病毒的分离培养病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。
根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。
1.2.1鸡胚接种a）鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质量上的一致b）孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行，气室向上，孵育的最适温度为38--39C，相对湿度为40—70%，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。
c）检卵：鸡卵孵育4〜5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二天一次）。
①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。
②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。
③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。
病毒的分离与鉴定(一)ppt课件
9
7
病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种
实验材料 (1)脑炎病毒悬液. (2)小白鼠(3W龄). (3)1ml的注射器、针头. (4)碘酒、酒精棉球. 实验方法: (1)以左手将小白鼠头部和体部固定于台面. (2)用碘酒、酒精棉球消毒头部右侧眼、耳间部位
8
病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种
(3)以1ml的注射器抽提病毒悬液,以右手持注射器, 将针头向眼外与耳根连线中点略偏向耳的方向刺 入颅腔,约进针2~3mm,注入量0.02~0.03ml. (4)注射完毕,将用过之物煮沸消毒. 实验结果: 接种后每日观察动物2次.动物一般在接种后3-4d后 开始发病,食欲减退,活动迟缓,耸毛、震颤、卷曲、 尾强直,逐渐导致麻痹、瘫痪而死亡.
实验九
1
病毒的分离与鉴定（一）
1、病毒的培养与鉴定 2、病毒的CPE过程 3、病毒的电镜照片观察 4、流感病毒的分离鉴定（一）
（1）鸡胚尿囊腔接种法 （2）病毒的动物接种法－小白鼠脑内
接种
2
流感病毒的分离鉴定
（1）鸡胚尿囊腔接种法 （2）病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种 目的：熟悉人工培养病毒的常用方法及其操 作技术。
(+)
(—)
作血凝抑制试验 盲传鸡胚两代，仍为
阴性时报告阴性
5
实验方法：
(1)取孵育10~12d鸡胚, 在检卵灯下画出气室 界线,于胚胎附近无大 血管处画出标记作为 注射入口. (2)将卵置于卵架上,消 毒标记处,用无菌剪刀法：
(3)用灭菌注射器吸取流感病毒液 0.2ml,由小孔刺入0.5cm后,进行注射. (4)注射后,用无菌胶布 封孔,置35度温箱孵育. (5)每日在灯下检视鸡 胚情况(若鸡胚在接种 后24h内死亡为非特异 性死亡,应弃之).
7
病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种
实验材料 (1)脑炎病毒悬液. (2)小白鼠(3W龄). (3)1ml的注射器、针头. (4)碘酒、酒精棉球. 实验方法: (1)以左手将小白鼠头部和体部固定于台面. (2)用碘酒、酒精棉球消毒头部右侧眼、耳间部位
8
病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种
(3)以1ml的注射器抽提病毒悬液,以右手持注射器, 将针头向眼外与耳根连线中点略偏向耳的方向刺 入颅腔,约进针2~3mm,注入量0.02~0.03ml. (4)注射完毕,将用过之物煮沸消毒. 实验结果: 接种后每日观察动物2次.动物一般在接种后3-4d后 开始发病,食欲减退,活动迟缓,耸毛、震颤、卷曲、 尾强直,逐渐导致麻痹、瘫痪而死亡.
实验九
1
病毒的分离与鉴定（一）
1、病毒的培养与鉴定 2、病毒的CPE过程 3、病毒的电镜照片观察 4、流感病毒的分离鉴定（一）
（1）鸡胚尿囊腔接种法 （2）病毒的动物接种法－小白鼠脑内
接种
2
流感病毒的分离鉴定
（1）鸡胚尿囊腔接种法 （2）病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种 目的：熟悉人工培养病毒的常用方法及其操 作技术。
(+)
(—)
作血凝抑制试验 盲传鸡胚两代，仍为
阴性时报告阴性
5
实验方法：
(1)取孵育10~12d鸡胚, 在检卵灯下画出气室 界线,于胚胎附近无大 血管处画出标记作为 注射入口. (2)将卵置于卵架上,消 毒标记处,用无菌剪刀法：
(3)用灭菌注射器吸取流感病毒液 0.2ml,由小孔刺入0.5cm后,进行注射. (4)注射后,用无菌胶布 封孔,置35度温箱孵育. (5)每日在灯下检视鸡 胚情况(若鸡胚在接种 后24h内死亡为非特异 性死亡,应弃之).
流感的病毒分离和鉴定知识培训课件
分离后病毒的保存与运
低温保存
将分离到的病毒保存在低温环境 下，如-70℃或液氮中，以保持病 毒的活性。
包装与运输
根据国家相关规定，对病毒样本 进行包装和运输，确保安全可靠 。
分离技术的优缺点
细胞培养法的优点是操作简便、敏感性高，缺点是细胞株的来源和质量可能影响实 验结果。
鸡胚接种法的优点是操作简便、成本低，缺点是鸡胚的来源和质量可能影响实验结 果。
碎片。
病毒分离
将处理后的样本接种到敏感细胞 或鸡胚中，进行病毒的分离培养
。
病毒鉴定
通过病毒形态观察、免疫学检测 、核酸检测等方法对分离的病毒
进行鉴定。
实验操作中的常见问题与处理
样本污染
在实验操作过程中，要严格控制样本 的采集、运输和预处理，避免交叉污 染。如发生样本污染，应立即停止实 验，重新采集样本。
病毒鉴定的应用场景与选择
总结词
根据不同的应用场景选择合适的鉴定方法。
详细描述
在流感病毒的分离与鉴定过程中，应根据实际需求和应用场景选择合适的鉴定方法。形态学鉴定方法简单、快速 ，适用于初步筛选；免疫学鉴定方法特异性强、灵敏度高，适用于病毒抗原和抗体的检测；分子生物学鉴定方法 准确度高、分型能力强，适用于病毒核酸序列的分析。
免疫学方法的优点是灵敏度高、特异性强，缺点是抗体试剂的质量和实验操作可能 影响实验结果。
03
流感病毒鉴定技术
形态学鉴定
总结词
通过观察病毒形态、大小、染色特性 等指标，对病毒进行初步鉴定。
详细描述
形态学鉴定通常采用显微镜观察病毒 粒子，了解其形状、大小、染色特性 等特征，从而对病毒进行初步分类和 鉴定。
的竞争力。
法律法规要求
病毒感染实验诊断ppt课件
②不出现细胞病变现象。 ③细胞培养液pH的变化。
2.中和试验
病毒与特异性抗体进行免疫反应， 使病毒失去感染性，在细胞培养 和活的机体内不出现病变的试验。 常用细胞培养进行中和试验。如 果特异性抗体能中和病毒，使之 失去感染性，不出现细胞病变效 应，则该病毒为特异性抗体的同 型病毒，
用于病毒的分型诊断最具敏感和 准确性。也可用于检查患者病后 或人工免疫后，机体血清中抗体 增加情况。
2．电子显微镜检查 (1)电镜直接检查：早期病毒感染标 本的病毒颗粒。如“秋季泻”患儿 粪便中的轮状病毒、甲肝患者粪 便中的HAV，疱疹病毒的疱疹液， HBV患者血清，均可观察到特征性 病毒颗粒。
(2)免疫电镜检查：在标本中加入 抗体。使病毒聚集成块负染观 察，更易发现病毒体，灵敏度 可提高100倍。
9．免疫荧光抗体染色
将感染细胞固定，用特异抗血 清荧光标记染色，在荧光显微镜 下，可见细胞内荧光，即可确定 型别。
第三节病毒感染快速诊断
通过测定病毒的特异标志成分，如 特殊形态、特异的抗原成分及病毒 的核酸，早期确认病毒的感染，是 病毒学诊断的重大发展。
一、形态学检查
1．光学显微镜 观察病毒感染细胞出现的包涵体。 根据特点可作出辅助诊断。狂犬病 病毒在脑细胞出现嗜酸性的圆形或 椭圆形包涵体，称为内基小体。巨 细胞病毒在上皮细胞的细胞核内出 现周围绕有一轮晕似“猫头鹰眼”样 大型嗜酸性包涵体。
5．聚合酶链反应(PCR)
选择病毒的特异保守片段作为靶基 因，进行引物设计和扩增可诊断病 毒性感染。选择病毒的易变区，结 合RFLP，测序等技术可以对病毒进 行分型和突变的研究。
(1可通过RT-PCR技术， 将RNA逆转录为cDNA，再进行 PCR扩增。
传代细胞系
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一般在72 ℃进行（Taq酶最适温度），延伸时间随扩 增片段长短而定；
4、循环中的变性步骤：循环中一般95℃，30秒足
已使各种靶DNA序列完全变性，变性时间过长损害酶 活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败；
5、循环数：大多数PCR含25-35个循环，过多易产
生非特异条带；
6、最后延伸：在最后一个循环后，反应在72 ℃维持
PCR技术的工作原理
1、预变性（Initial denaturation）： 模板DNA
完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5 分钟；
2、引物退火（Primer annealing）：退火温度一
般需要凭实验经验决定，退火温度对PCR的特异性有 较大影响；
3、引物延伸（Primer elongation）：引物延伸
结
中
晶
性
紫
红
染
染
色
色
8
（二）病毒理化性质及血清学鉴定
1）病毒核酸类型的测定 2）理化性状的检测：大小及结构、衣壳对称类型、有无包膜等 3）血清学鉴定 ELISA；IFA；
9
（三）病毒分子生物学鉴定
阳性分离物上清 提取总RNA
反转录合成cDNA
PCR扩增 直接测序或克隆测序
10
什么是聚合酶链式反应
在进行相关实验的时候一定要严格按步骤 操作；
实验过程中一定要做好严格防护。
7
二、病毒的鉴定
（一）病毒的数量与感染性测定
1）蚀斑（plaque）测定
可进行病毒的分离纯化； 蚀斑形成单位（plaque forming unit, PFU）
2）50%感染量或50%组织感染量（ID50或TCID50）测定
汉坦病毒敏感的培养细胞 首先发现人肺癌细胞（A549） 其他敏感细胞： Vero-E6、2BS、RL、CEC等
4
细胞病变 （CPE ）：
1、分布均匀的小 颗粒状破坏病变； 2、局灶状小颗粒 状破坏； 3、细胞圆化，呈 局灶性葡萄状的堆 积； 4、细胞融合。
圆缩；
脱落；
聚集；
破碎；
5
3．鸡胚培养
4．蚊虫分离病毒法
优点：对大多数病毒均较敏感，其病毒繁 殖量较高； 来源方便、经济，管理方便；
缺点：操作不当污染，导致胚胎死亡；
经口感染 胸腔接种
优点：病毒可长时间保存在蚊体内； 蚊虫饲养较实验动物容易，数 量大；
缺点：必须经常了解蚊子体内是否确 已带毒；
6
强调点：实验室生物安全
实验室安全是重中之重，如果实验室的条 件不具备，建议不要开展病毒分离工作；
PCR
分
析mRNA的最通用、最快速、
析 原
理
最简便的方法，该方法是对
示 意
图
PCR反应进5
*目前有5种技术用于实时定量PCR
其中最经济、简便的技术是利用荧光染料（如SYBR Green ）与双链DNA分子结合发光的特性，指示扩增产 物的增加；
其他4种方法都是以荧光染料标记的寡核苷酸为探针 与正确的扩增子杂交，包括5’核酸酶法（即人们熟知的 TaqManTM）、分子信标、ScropionsTM和探针杂交法， 它们拥有更强的特异性，可以避免对PCR后溶解曲线的 需求，以及后续的Southern杂交或对扩增子的测序鉴定， 但是成本较高。
“全程冷链”
2
1．动物接种
➢动物分离病毒法：乳小白鼠（3日龄）
✓优点：很敏感，易掌握；病毒可随传代次数的增加而增强，有利于病毒分离；
✓缺点：小白鼠本身存在多种病毒性疾病，往往会影响结果；小鼠也可能存在个体差
异；
实验动物的观察：
接种途径：
动物的发育、活动力、食欲和粪便
•脑内接种 •皮下接种
特殊症状：震颤、弓背、不安、嗜睡、 瘫痪、抽搐等直至死亡
•皮内接种
有些实验还需测量动物的体温和体重
•腹腔接种
•肌肉接种
•静脉接种
3
2．组织培养
（1）原代和次代细胞培养 （2）二倍体细胞培养 （3）传代细胞培养 （4）病毒在培养细胞中增殖的指标
1）细胞病变 2）红细胞吸附 3）干扰现象 4）细胞代谢的改变
➢组织培养分离法： ✓没有隐性感染 ✓没有免疫能力的抵抗力 ✓接种量大 ✓培养条件易于控制 ✓加速病毒的分离过程
➢ 该方法适合对待测样品进行初步 筛选，目前已广泛被实时定量 PCR替代。
14
2．实时定量PCR
SYBR Green
➢ 常用于mRNA的定量分析
➢实 时 定 量 PCR (Real-time
实
Quantitative Polymerase chain
时 定
量
Reaction,RQ-PCR) 是 定 量 分
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）
是一种在体外特异地扩增已知基因的方法； 由K. Mullis于1983年建立； 可用于分析基因及其产物的水平变化； 可进行实时、定量分析； 可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列
的相互作用。
11
PCR操作过程
13
1．反转录PCR
Trans反转录酶系列
➢ 可用于mRNA的半定量分析
➢ 反 转 录 PCR (reverse transcription-PCR，RT-PCR) 是 一种简单、快捷地对RNA进行定 性、定量分析的方法。它是以 mRNA为模板，体外扩增cDNA， 再以cDNA为模板进行特定基因转 录 产 物 的 PCR 扩 增 。 RT-PCR 技 术一般用于RNA的定性分析；如 果设置阳性参照，则可对待测 RNA样品进行半定量分析。
病毒分离鉴定与 常用序列分析软件简介
云南省地方病防治所 病毒立克次体病防治科
冯云 E-mail:ynfy428@
2012.5.30
1
一、病毒的分离
➢ 标本的处理 ➢ 病毒的分离
蚊虫；蜱；蠓等； 血清；脑脊液等； 动物组织标本（脑，肺，脾等） 动物接种 组织培养 鸡胚培养 蚊虫饲养分离病毒
16
3.DNA芯片技术
DNA芯片（DNA chip） 在固相支持物上有序固化寡 核苷酸或DNA探针，与待测 荧光标记样品进行杂交； 通过对杂交信号的检测、比 较和分析，得出样品的遗传 信息(基因序列及表达)； 亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。
5-15分钟，使引物延伸完全，并使单链产物退火成双 链。
12
PCR的各种变体
反向PCR（Inverse PCR，IPCR） 不对称PCR（Asymmetric PCR） 多重PCR 荧光定量PCR（Q-PCR） 反转录PCR（Reverse transcription PCR，RTPCR） 巢式PCR（NEST PCR） 递减PCR（Touchdown PCR）
4、循环中的变性步骤：循环中一般95℃，30秒足
已使各种靶DNA序列完全变性，变性时间过长损害酶 活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败；
5、循环数：大多数PCR含25-35个循环，过多易产
生非特异条带；
6、最后延伸：在最后一个循环后，反应在72 ℃维持
PCR技术的工作原理
1、预变性（Initial denaturation）： 模板DNA
完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5 分钟；
2、引物退火（Primer annealing）：退火温度一
般需要凭实验经验决定，退火温度对PCR的特异性有 较大影响；
3、引物延伸（Primer elongation）：引物延伸
结
中
晶
性
紫
红
染
染
色
色
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（二）病毒理化性质及血清学鉴定
1）病毒核酸类型的测定 2）理化性状的检测：大小及结构、衣壳对称类型、有无包膜等 3）血清学鉴定 ELISA；IFA；
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（三）病毒分子生物学鉴定
阳性分离物上清 提取总RNA
反转录合成cDNA
PCR扩增 直接测序或克隆测序
10
什么是聚合酶链式反应
在进行相关实验的时候一定要严格按步骤 操作；
实验过程中一定要做好严格防护。
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二、病毒的鉴定
（一）病毒的数量与感染性测定
1）蚀斑（plaque）测定
可进行病毒的分离纯化； 蚀斑形成单位（plaque forming unit, PFU）
2）50%感染量或50%组织感染量（ID50或TCID50）测定
汉坦病毒敏感的培养细胞 首先发现人肺癌细胞（A549） 其他敏感细胞： Vero-E6、2BS、RL、CEC等
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细胞病变 （CPE ）：
1、分布均匀的小 颗粒状破坏病变； 2、局灶状小颗粒 状破坏； 3、细胞圆化，呈 局灶性葡萄状的堆 积； 4、细胞融合。
圆缩；
脱落；
聚集；
破碎；
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3．鸡胚培养
4．蚊虫分离病毒法
优点：对大多数病毒均较敏感，其病毒繁 殖量较高； 来源方便、经济，管理方便；
缺点：操作不当污染，导致胚胎死亡；
经口感染 胸腔接种
优点：病毒可长时间保存在蚊体内； 蚊虫饲养较实验动物容易，数 量大；
缺点：必须经常了解蚊子体内是否确 已带毒；
6
强调点：实验室生物安全
实验室安全是重中之重，如果实验室的条 件不具备，建议不要开展病毒分离工作；
PCR
分
析mRNA的最通用、最快速、
析 原
理
最简便的方法，该方法是对
示 意
图
PCR反应进5
*目前有5种技术用于实时定量PCR
其中最经济、简便的技术是利用荧光染料（如SYBR Green ）与双链DNA分子结合发光的特性，指示扩增产 物的增加；
其他4种方法都是以荧光染料标记的寡核苷酸为探针 与正确的扩增子杂交，包括5’核酸酶法（即人们熟知的 TaqManTM）、分子信标、ScropionsTM和探针杂交法， 它们拥有更强的特异性，可以避免对PCR后溶解曲线的 需求，以及后续的Southern杂交或对扩增子的测序鉴定， 但是成本较高。
“全程冷链”
2
1．动物接种
➢动物分离病毒法：乳小白鼠（3日龄）
✓优点：很敏感，易掌握；病毒可随传代次数的增加而增强，有利于病毒分离；
✓缺点：小白鼠本身存在多种病毒性疾病，往往会影响结果；小鼠也可能存在个体差
异；
实验动物的观察：
接种途径：
动物的发育、活动力、食欲和粪便
•脑内接种 •皮下接种
特殊症状：震颤、弓背、不安、嗜睡、 瘫痪、抽搐等直至死亡
•皮内接种
有些实验还需测量动物的体温和体重
•腹腔接种
•肌肉接种
•静脉接种
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2．组织培养
（1）原代和次代细胞培养 （2）二倍体细胞培养 （3）传代细胞培养 （4）病毒在培养细胞中增殖的指标
1）细胞病变 2）红细胞吸附 3）干扰现象 4）细胞代谢的改变
➢组织培养分离法： ✓没有隐性感染 ✓没有免疫能力的抵抗力 ✓接种量大 ✓培养条件易于控制 ✓加速病毒的分离过程
➢ 该方法适合对待测样品进行初步 筛选，目前已广泛被实时定量 PCR替代。
14
2．实时定量PCR
SYBR Green
➢ 常用于mRNA的定量分析
➢实 时 定 量 PCR (Real-time
实
Quantitative Polymerase chain
时 定
量
Reaction,RQ-PCR) 是 定 量 分
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）
是一种在体外特异地扩增已知基因的方法； 由K. Mullis于1983年建立； 可用于分析基因及其产物的水平变化； 可进行实时、定量分析； 可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列
的相互作用。
11
PCR操作过程
13
1．反转录PCR
Trans反转录酶系列
➢ 可用于mRNA的半定量分析
➢ 反 转 录 PCR (reverse transcription-PCR，RT-PCR) 是 一种简单、快捷地对RNA进行定 性、定量分析的方法。它是以 mRNA为模板，体外扩增cDNA， 再以cDNA为模板进行特定基因转 录 产 物 的 PCR 扩 增 。 RT-PCR 技 术一般用于RNA的定性分析；如 果设置阳性参照，则可对待测 RNA样品进行半定量分析。
病毒分离鉴定与 常用序列分析软件简介
云南省地方病防治所 病毒立克次体病防治科
冯云 E-mail:ynfy428@
2012.5.30
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一、病毒的分离
➢ 标本的处理 ➢ 病毒的分离
蚊虫；蜱；蠓等； 血清；脑脊液等； 动物组织标本（脑，肺，脾等） 动物接种 组织培养 鸡胚培养 蚊虫饲养分离病毒
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3.DNA芯片技术
DNA芯片（DNA chip） 在固相支持物上有序固化寡 核苷酸或DNA探针，与待测 荧光标记样品进行杂交； 通过对杂交信号的检测、比 较和分析，得出样品的遗传 信息(基因序列及表达)； 亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。
5-15分钟，使引物延伸完全，并使单链产物退火成双 链。
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PCR的各种变体
反向PCR（Inverse PCR，IPCR） 不对称PCR（Asymmetric PCR） 多重PCR 荧光定量PCR（Q-PCR） 反转录PCR（Reverse transcription PCR，RTPCR） 巢式PCR（NEST PCR） 递减PCR（Touchdown PCR）