流感病毒实验室检测 PPT

标本的接收
• 接收标本时必须核对送检表 • 流感监测网络实验室的工作人员接到标本
后，24小时内将“流感/人禽流感监测病例 标本原始登记送检表”（表2）录入到“监 测信息系统”
标本的处理
• 标本送至实验室后，立即进行处理，未加 抗菌素的加入适量的抗菌素。
• 将原始标本一分为三份，一份（1ml）用于
MDCK细胞病毒分离
CPE出现时间与感染病毒的型别、毒株的差 异、感染量的大小和MDCK细胞的敏感性 有关
每日观察细胞病变(CPE) 标本接种后7天还未出现CPE，维持液经HA
试验阴性者，继续盲传1～2代后，HA试验 仍为阴性者，则MDCK细胞病毒分离为阴 性，标本可弃去
细胞病变图
鸡胚病毒分离
流感病毒实验室检测技术 及盲样考核结果分析
湖南省疾病预防控制中心
微生物检验科
2013-12-27
流感监测目的
• （一）监测流感活动水平和流行动态；
• （二）及时发现流感病毒变异并作出预警；
• （三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测 和推荐提供依据。
流感监测内容
• （一）流感样病例监测 • （二）流感样病例暴发疫情监测
• 冻存的标本，尽量避免其反复冻融，在冷 藏条件下送到实验室
实验室生物安全要求
季节性流感病毒分离鉴定在生物安全Ⅱ级 实验室进行。
流感病毒分离鉴定及其它检测过程中所有 能够产生感染性气溶胶的过程必须在生物 安全Ⅱ级实验室的生物安全柜里操作。
用灭活的抗原进行血清学检测时可以在生 物安全Ⅰ级实验室进行
流感样病例监测标本采集
• 采集对象： 流感样病例
发热（体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者
• 采集时间：病人发病的头3天内采集 • 采集地点：国家级流感样病例监测哨点医院
• 采集数量：根据就诊ILI病例数的多少，每家
哨点医院每周至少采集5～15份流感样病例的
标本(根据流行季节、流行强度、防控工作需要实时 调整）
标本准备 检卵 标本接种于9日龄鸡胚 33℃～35℃培养72小时
鸡胚分离方法-试剂准备
鸡胚分离方法-标记鸡胚
鸡胚分离方法
■ 接种病毒方法
◆ 单腔接种
盲种
◆双腔接种
灯下接种
开窗接种
鸡胚分离流程（1）
◆将标记好的鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，通常每个样 本接种3个鸡胚
◆用70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10x6mm 窗口 ◆用注射器吸200µl处理过的临床标本，装上16 号针头 ◆从窗口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让 液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯下即 可清楚 的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的 鄂下胸前， 用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚 随着针头的拨动而动，即可注射100µl标本。将针头退出至 ½ 寸，将另外100 µl标本 注入鸡胚尿囊腔
核酸检测
荧光定量PCR
荧光定量PCR
荧光定量PCR
• 反应体系和条件
• 试剂：Invitrogen SuperScript® III Platinum® One-Step Quantitative Kit （公司： Invitrogen，货号：11732-020或 11745-100）
– 分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶 和DNA酶)
根据使用的细胞瓶的大小，决定接种 量，一般的小细胞瓶接种0.5ml的临 床标本
24小时后，观察细胞病变。当细 胞病变为3+或4+时，即75～100% 细胞出现病变时进行收获，收获 之前将细胞冻融1～2次，以提高 收获标本的病毒滴度。即使无细 胞病变也应该于第7天收获 （细胞 病变情况：细胞病变的特征是细 胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细 胞核固缩或破裂，严重时细胞部 分或全部脱落 ）
荧光PCR结果－可疑样品
病毒分离-MDCK细胞
标本接种MDCK细胞 33－35℃培养 每日观察细胞病变(CPE)
MDCK细胞收获
接种流程
清洗MDCK 细胞
Hank’s液清洗细胞，一般清洗2遍
临床采样标本接种细胞
流
程
33－35度吸附1－2小时
图
Hank’s液清洗细胞
加入病毒生长液，33－35度培养箱培养
暴发疫情标本采集
常规
➢咽拭子 ➢鼻拭子 ➢痰液
采集标本类型
特殊
鼻咽/呼吸道吸取物 鼻洗液 呼吸道灌洗液 肺组织活检标本 尸检标本
采样液
• 常用的采样液有：PH 7.4-7.6的Hank’s液或 MEM；
• 标本采集后应立即放入适当的采样液中低 温保存，同时加入抗菌素（入庆大霉素 50 mg/mL，多粘菌素B 250μg/mL ）
鸡胚分离流程（2）
鸡胚分离流程（3）
鸡胚病毒鉴定
鸡胚收获
HA试验
经HA试验阴性者，将羊水和尿囊液混合，继 续盲传1代（72小时），如仍为阴性，则鸡胚 病毒分离为阴性，标本可弃去
病毒鉴定
• 红细胞凝集 • 红细胞凝集抑制试验
病毒鉴定流程
红细胞凝集试验 4个凝集单位配制“回滴”
红细胞凝集抑制试验 判定流感病毒型别
红细胞凝集试验（HA）
红细胞
适用范围
终浓度 （％） 孔底部形 状 孵育时间 细胞对照
鸡
流感和禽流 感病毒 0.5（1%）
U或V型
30min 细胞沉积成 圆点状，倾 斜时细胞向 下流成泪滴 状
MDCK细胞接种，一份（1ml）用于鸡胚接
种，一份（1ml）保存待复核。（根据检测 程序实时调整）
实验室检测
◆核酸检测
◆病毒分离和鉴定：鸡胚分离和细胞培养 ◆胶体金快速检测
检测流程
临床标本ຫໍສະໝຸດ Baidu集
流感病毒核酸检测阳性
接种MDCK细胞
接种鸡胚
红细胞凝集试验
红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒 寄送国家流感中心
咽拭子采集
• 咽拭子
•
用灭菌棉签（最好用聚丙烯纤维头的
塑料杆拭子）擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，
将棉签头部浸入含3-4ml采集液的管中，尾
部弃去，旋紧管盖。
• 标本采集后应在4℃条件下，尽快（哨点监 测48小时疫情24小时内）运送至流感监测网 络实验室
• 未能送至实验室的，应置-70℃或以下保存， 一周内送实验室
– 正反向引物 (40μM) – 双重标记探针(10μM)
• 反应条件：逆转录50℃ 30min→95 ℃ 2min →（95 ℃ 15s → 55 ℃ 30s*）×45
• 反应体系为25ul • 注：*在55 度这一步骤中要收集荧光信号
（FAM）
荧光PCR结果－阳性样品
荧光PCR结果－阴性样品