革兰氏染色

2.9.1操作因素 • 1、涂片太厚 • 在涂片时细菌挑的太多，没法分开，在脱色时就不 能将第一步染上的结晶紫的颜色脱去，可能会使革 兰阴性菌也出现紫色，误认为革兰阳性菌。 • 2、脱色时间 • 阳性菌透性小，不易被脱色，阴性菌透性大，易脱 色；但这是在固定的时间条件下的结果，如果延长 脱色时间，也会使脱色剂渗透进阳性菌的细胞壁中， 使染上的结晶紫脱去颜色，最后染上复红的颜色， 变成革兰阴性菌。而脱色时间太短的话又会使阴性 菌染上的结晶紫不能完全脱色，出现紫色，误认为 革兰阳性菌。 • 3、固定方法 • 在实际操作中有的同学将玻片在火焰上烤的太久， 改变了细菌原有的通透性，会使细菌的染色性发生 变化。影响了染色的结果。
二、染色的目的与原理
• 细菌、真菌和其他微生物的细胞质是透明 的，不借助染色方法很难观察到这些微生 物。染色后有助于细菌的观察与菌种的鉴 别。 • 细菌细胞通常带负电荷,简单染色时采用已 知的、带正电荷的碱性染料与菌体细胞黏 附使菌体着色。经染色后的细菌细胞与背 景形成鲜明对比，更清楚易辨。
三、染色方法
2.9影响因素
• 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色 程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为 阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染 为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果， 如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分 菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 • 具体有以下因素会影响到染色结果： 1操作因素 2细菌因素 3染液因素
2.4具体操作步骤：
2.4.1涂片：左手持菌液试管，右手持接种环， 用接种环从试管培养液中取一环菌，从酒 精灯外焰穿过，于载玻片中央涂成薄层 （事先在背面做好标记圆圈）即可，或先 滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环 从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混 合均匀，涂成一薄层。拔或塞试管塞时， 应将试管口通过火焰略加烧灼，最后将接 种环在火焰上烧灼灭菌。
2.7实验原理：
① G+细菌的细胞壁
2.7实验原理
② Gˉ细菌的细胞壁 • Gˉ细菌细胞壁比G+细菌细胞壁薄而结构较 复杂，分外膜和肽聚糖层。肽聚糖层和外 膜的内层之间通过脂蛋白连接起来。细胞 壁和细胞质膜之间有一个明显的空间，称 为壁膜间隙 。 • 外膜的基本成分是脂多糖（ LPS ），还含 有蛋白质。许多G-细菌对高等生物有致病 性是由LPS的成分决定的，它的毒性组分常 称为内毒素
作业：
• 1、革兰染色的实验原理 • 2、革兰染色的影响因素
2.5固定的目的 • ① 杀死微生物，固定其细胞结 构； • ② 保证菌体能牢固地粘附在载 玻片上，以免水洗时被水冲掉； • ③ 改变菌体对染料的通透性， 一般死细胞原生质容易着色。
2.6实验现象：
• 染色后菌体呈蓝紫色的，称为“革兰阳 性菌”；菌体是伊红色，称“革兰阴性 菌”。无论阳性菌还是阴性菌，都有杆 菌和球菌。葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿 假单胞菌是临床最为常见的病原菌。葡 萄球菌属于革兰阳性菌，大肠杆菌属于 革兰阴性菌。除大肠杆菌以外，临床较 常见的肠杆菌科细菌还有变形杆菌属， 沙门菌属、克霉白菌属；铜绿假单胞菌 是临床常见的较耐药革兰阴性杆菌。
格兰染色Mp4
作业：
• 1、染色标本的制备方法 • 2、革兰染色的具体步骤 • 3、革兰染色的医学意义
2.7实验原理：
• 细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透 性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和 结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后 形成不溶性复合物，乙醇能使它溶解，所以染色 的前二步结果是一样的，但在G+细胞中，乙醇还 能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结 晶紫和碘的复合物分子太大，不能通过细胞壁， 保持着紫色。在Gˉ细胞中，乙醇处理不但破坏了 胞壁外膜，还可能损伤肽聚糖层和细胞质膜，于 是被乙醇溶解的结晶紫和碘的复合物从细胞中渗 漏出来，当再用衬托的染色液复染时，显现红色。 红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但 被紫色盖没，红色显示不出来。
毒性反应
免疫原性 甲醛液处理
对组织细胞有选择性毒害效应 引起特殊临床表现
强，刺激宿主产生抗毒素 脱毒成类毒素
各菌的毒性效应相似引起发热、白 细胞增多、微循环障碍、休克等
弱 不形成类毒素
2.7实验原理：
① G-细菌的细胞壁
细菌芽孢模式图
细菌生长曲线图
2.8革兰染色的医学意义 ：
• 1、可以协助鉴定细菌 • 2、为临床使用抗生素提供依据 • 3、有助于了解分析细菌的致病性
2.9.2细菌因素 • 1、细菌培养时间: 细菌的典型形态、染色 性是在对数生长期，取这时的细菌做革兰 染色可以反应细菌的真实的染色性。如果 细菌培养时间太长，变成了老龄菌，染色 性就会发生变化，可能会使革兰阳性菌染 成革兰阴性菌。 • 2、培养基的成分: 一般认为革兰阳性菌体 内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合 物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢， 不易脱色。但是如果培养基中缺乏核蛋白 质镁盐就不能合成菌体成分的核蛋白质镁 盐，细菌与碘和结晶紫的复合物结合就不 牢固，容易脱色，可能会使革兰阳性菌染 成革兰阴性菌。
2.9.3染液因素 1、碘液： 碘液作为媒染剂能增加染料与被染物的 亲和力。如果碘液放置时间太长，或经日光照射 失效，失去媒染剂的作用，就可能使结晶紫与细 菌结合的不牢固，容易被脱色，使革兰阳性菌染 成革兰阴性菌。 2、结晶紫 ：ห้องสมุดไป่ตู้晶紫的浓度太高，就会使染上的颜 色不容易被酒精脱色，可能会使革兰阴性菌染成 革兰阳性菌。 3、酒精： 酒精作为脱色剂，革兰染色的脱色酒精 浓度为95% ，在此浓度下革兰阳性菌染上的结晶 紫不易被脱去，保留紫色，革兰阴性菌染上的结 晶紫容易被脱去，最后呈红色。但当酒精的浓度 为70% 时，它的脱色能力最强，可能使革兰阳性 菌染上的结晶紫也被脱去，使革兰阳性菌染成革 兰阴性菌。
• 1、单染色法：仅用一种染料对细菌进 行染色，操作简单。可观察细菌的形 态、大小及排列，但不能显示细菌的 结构及染色特性。分为染色、水洗、 干燥三个步骤。染色剂为亚甲蓝或碱 性复红染色液。
三、染色方法
• 2、复染色法：用两种或以上的碱性染 料先后对细菌进行染色。可观察细菌 的形态、大小及排列，能显示细菌的 结构及染色特性，还有鉴别细菌的作 用。常用革兰染色法。通过此法染色， 可将细菌鉴别为革兰阳性菌（G+）和 革兰阴性菌（G-）两大类。丹麦细菌 学家G.Gram发明而得名。
革兰染色
一、染色标本的制备
1、涂片：载玻片上滴加生理盐水一滴，接种环取待检 菌培养物少许，研入无菌生理盐水中，形成一个极薄的 均匀的菌膜，直径在1cm左右为宜。如果时液体培养物 则直接取少许菌液涂成菌膜。 2、干燥：室温自然干燥即可。也可在远离火焰上方的 空气中干燥。切记不可太近火焰，以免烤焦废弃。 3、固定：一般用加热法固定。将载玻片迅速来回通过 火焰3次，以玻片触及皮肤热而不烫为度。这样可以使 菌体粘附于载玻片上。加热还可杀死细菌，改变细菌细 胞膜的通透性，易于染色。也可用甲醇、乙醇等化学药 品固定。
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2.3、意义：
（1）鉴别细菌:用此染色法可将所有细菌分为两大 类,这样可将致病菌的范围缩小,然后再进一步鉴 定。 (2)选择药物:革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌在细胞 壁等结构上有很大差别,因而对抗生素的敏感性不 同。例如大多数阳性菌对青霉素敏感大多数阴性 菌对青霉素不敏感(脑膜炎球菌等除外),可供临床 实践中选用抗菌药物的参考。 (3)与致病性的关系:大多数革兰氏阳性菌的致病物 质主要为外毒素;而大多数革兰氏阴性菌的致病物 质主要为内毒素.
• 2.1实验材料：大肠埃希菌，金 黄色葡萄球菌18-24h培养物； 草酸铵结晶紫染液；沙黄染液； 生理盐水；95%乙醇；卢戈碘 液；二甲苯；接种环；酒精灯； 显微镜等。
2.2、染色方法：包括初染、媒染、脱色、复染、
• • • 镜检、结果分析等步骤。 初染染料为碱性染料，常用结晶紫。 媒染剂的作用是增强染料与细菌的亲和力，更好 地加强染料与细胞的结合。常用碘液。 脱色剂帮助染料从被染色的细胞中脱色。利用细 菌对染料脱色的难易程度不同，而将细菌加以区 分。革兰阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰阴 性细菌则易被脱色。常用丙酮或乙醇。 复染液也是一种碱性染料，目的是使脱色的细菌 重新染上另一种颜色，以便与未脱色菌进行比较。 常用沙黄染液或蕃红花红溶液
细菌外毒素与内毒素的区别
外毒素（exotoxin）
产生菌 存在部位 化学成份 稳定性 毒性作用 多数革兰氏阳性菌少数革兰氏 阴性菌 多数活菌分泌出，少数菌裂解 后释出 蛋白质 60℃半小时被破坏 强
内毒素（endotoxin）
多数革兰氏阴性菌少数革兰氏阳性 （如苏云金芽孢杆菌） 细胞壁组分，菌裂解后释出 脂多糖 160℃2-4小时被破坏 较弱
具体操作步骤：
2.4.4. 染色： （1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水 洗。 （3）脱色：将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用 95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止， 约20—30秒，立即用水冲净酒精。 （4）复染：用番红液染1—2分钟，水洗。 （5） 镜检：干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红 色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰 氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性 （6） 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混 合制片，作革兰氏染色对比。
• 具体操作步骤：
2.4.2干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可 在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿 靠近火焰。 2.4.3固定：常用高温进行固定。即手持载玻 片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快 速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片 温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮 肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。
细菌结构模式图
2.7实验原理：
① G+细菌的细胞壁 • G+细菌细胞壁具有较厚（20-80nm）而致 密的肽聚糖层，多达20层，占细胞壁成分 的60%～90%，它同细胞膜的外层紧密相 连 ；有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸。细 胞生长中有自溶素（酶类）起作用，磷壁 酸对自溶素有调节功能，阻止胞壁过度降 解和壁溶。如果细胞壁的肽聚糖层被消溶， G+细胞成为原生质体（protoplasts），细 胞壁不复存在，而只存留细胞膜。除链球 菌外，大多数G+细菌细胞壁中含极少蛋白 质。