基因组改组构建柔红霉素高产菌株

基因组改组构建柔红霉素高产菌株

作者：潘淑勇

来源：《科技创新导报》 2011年第23期

潘淑勇

(鲁南制药集团有限公司山东临沂 276006)

摘要:目的:构建高产菌株,提高柔红霉素发酵效价。方法:使用基因组改组法,用摇瓶测试

发酵效价。结果:使柔红霉素效价提高105%。结论:使用基因组改组的方法可以大幅度的提高柔

红霉素发酵效价。

关键词:柔红霉素菌株基因组重排

中图分类号:R2 文献标识码:A 文章编号:1674-

098X(2011)08(b)-0051-02

临床上盐酸柔红霉素是治疗急性非淋巴细胞性白血病的一线药物,对儿童白血病也有良好的缓解作用,30年没有被其他药物取代。在制药领域是去甲氧柔红霉素、阿霉素和表阿霉素的合

成起始原料。随着人类的癌症发病率逐年提高,盐酸柔红霉素的市场容量也在快速上升,2009年

被收录到《国家基本医疗保险药品目录》。然而较低的发酵效价造成了昂贵的生产成本,致使售价居高不下。降低生产成本,减少患者的负担是我们当前迫切需要解决的问题。

2002年建立的基因组改组(genome shuffling)技术,应用多亲本递近融合(recursive fusion),定向筛选具有重要表型特征改变的突变体,已经成功地用于工业微生物多基因控制表型的改良[1～4]。高雯采用紫外诱变和基因组改组相结合的方法构建柔红霉素高产菌株,使发酵单位提高60%[5]。刘连碧等使用链霉素抗性筛选法,提高柔红霉素发酵单位50%[6]。本次研究将

采用盐酸胍和紫外联合诱变与基因组改组相结合的方法,并使用链霉素抗性筛选法进行柔红霉素高产菌株的构建。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

亲本:S-07A:发酵效价为1000mg/L。保存于鲁南制药科研部。

1.1.2 融合培养基及试剂[7]

亚硝基胍(NTG),甲醇(AR),0.9%生理盐水,YEME液体培养基,10.3%蔗糖溶液,TSA平板,P缓

冲液,10mg/ml溶菌酶溶液(用P缓冲液溶解),25% PEG4000(用P缓冲液溶解),R2软琼脂,R2YE

平板。

TM缓冲液(Tris-马来酸缓冲液):Tris0.121g,马来酸0.116g,纯化水20ml调节pH6.0,121℃灭菌5min。

种子摇瓶培养基:玉米淀粉4.0％,葡萄糖1.0％,麸皮1.0％,麸质粉0.5％,KH2PO4

0.1％,(NH4)2SO4 0.1％,CaCO3 0.4％,pH自然。装60ml于500ml摇瓶中,121℃灭菌30min。

发酵摇瓶培养基:玉米淀粉7.0%,麸皮1.0%,麸质粉0.5%,KH2PO4 0.1%,(NH4)2SO4

1.0%,CaCO3 0.8%;pH自然。装30ml于250ml摇瓶中,121℃灭菌30min。

1.1.3色谱条件

高压液相色谱Agilent C18色谱柱(53mm*7mm,3μm);流动相:15mmol/L的磷酸二氢钾－乙

腈(1∶1);柱温25℃;流速1.0ml/min;检测波长:254nm。

1.2 方法

1.2.1 菌种诱变

取菌种S-07A甘油管2支融化后分别用紫外和NTG进行诱变。紫外诱变:15W,254nm,距离

30cm紫外灯下,缓慢转动诱变1min。将菌液离心,弃上清,用生理盐水悬浮为2ml菌液。NTG诱变:将菌液离心,弃上清,加入1ml TM缓冲液,分散均匀,称取1mg NTG并用1滴甲醇溶解后加入

菌丝悬浮液中,于30℃摇床中220rpm诱变120min。将菌液离心,弃上清,用生理盐水洗涤3次后悬浮为2ml菌液。

1.2.2 菌丝体制备

将2种经过诱变的菌种都进行以下操作:接种菌液2ml于装量60ml含6μg/ml链霉素YEME

的500ml三角瓶中,于29℃摇床中220rpm培养42h。吸取菌液3ml接种于装量30ml含有0.5%

甘氨酸的YEME250ml三角瓶中,于29℃摇床中220rpm培养42h。镜检确定无菌。

将菌液倒入50ml无菌离心管,5000rpm,10min,弃上清。用10ml 10.3%蔗糖溶液洗涤菌丝体

一次,弃上清。再加10ml 10.3%蔗糖溶液用漩涡振荡将菌丝分散均匀,分装于1.5ml离心管中,

每管装1ml。取1管涂布TSA平板作无菌检查。其他管离心,弃上清,于-20℃保存。

1.2.3 原生质体制备

取3个小离心管,用1ml P缓冲液分散菌丝、洗涤、离心、弃上清。加800μl P缓冲液漩

涡振荡使菌丝分散均匀,再加入200μl 10mg/ml溶菌酶溶液,充分混匀,于30℃水浴酶解90min。500rpm离心5min,将上部原生质体悬浮液转移到另一只无菌1.5ml离心管中,3000rpm离心

10min沉淀原生质体,弃上清。用1ml P缓冲液洗涤一次,弃上清。加500μl P缓冲液,用血球

计数板计数,并配成107个/ml的原生质体溶液。

1.2.4 原生质体灭活

将紫外诱变和NTG诱变菌株原生质体等量混合后分为2份,取1份置于60℃水浴中处理

120min灭活,另一份置于冰水浴中处理120min。

1.2.5 原生质体融合

将2种不同处理的菌液混合,3000rpm离心10min,弃上清。然后加入1ml P缓冲液,充分悬浮,3000rpm离心10min,弃上清。重复以上步骤一次。彻底甩干留在管底的液滴。

轻敲管壁,打散沉淀。加入0.5ml 25% PEG4000(30℃水浴保温),充分悬浮。室温放置1min。加0.5ml P缓冲液稀释,3000rpm离心10min,弃上清。用P缓冲液洗涤一次,3000rpm离心10min,