食品理化检验—第2章 薄层色谱法(TLC)

相。按键合有机硅烷的官能团分为极性键合相及非极
性键合相。
键合有机分子中含有某种极性基团，和 普通硅胶比，吸附活性降低。
键合相表面都是极性很小的烃基，最
常用的硅就胶是的十分八烷离基效键率合的硅高胶低。与其粒度、孔径及表面
积等几何结构有关。
（2）氧化铝 用氧化铝可分离萜类、生物碱类、脂肪类
及芳香族化合物，因制备方法和处理方法的差 别，氧化铝有弱碱性（pH=9~10)、酸性 (pH=4~5)及中性(pH=7~7.5)之分，因此其使用 范围也有所不同。
察到不同颜色的斑点；对可见光和紫外光都不吸收， 也没有合适的显色方法的化合物可以用荧光猝灭技术 进行检测。
光学检出法的使用范围： 光学检出法使用方便，被检出物质不被破坏，
适用于双向展开，多次展开等的定位，也宜应用于 洗脱定量时定位，是平面色谱定位的首选方法。
2、蒸气检出法 （1）利用一些物质的蒸气与样品作用生产不同颜 色或产生荧光。此法不会改变化合物性质，灵敏 度高，是薄层定位常用的简便方法。
它在薄层色谱法中的应用范围仅次于硅胶。
（3）其他固定相
①纤维素 按其用途不同分为普通纤维素（天然纤维
素、高纯度纤维素、微晶纤维素）、乙酰化纤 维素和离子交换纤维素。
②另外还包括聚酰胺，葡聚糖凝胶（亲水性葡 聚糖凝胶、亲脂性葡聚糖凝胶和葡聚糖凝胶离 子交换剂）和硅藻土等固定相。
2、粘合剂及添加剂
（1）粘合剂 理想的粘合剂要求亲水性好、粘结力强
薄层色谱法(TLC)
一、薄层色谱法的概述
（一）平面色谱法的概念 平面色谱法是将固定相涂布于平面载板上，
流动相借毛细管作用流经固定相，使被分离后 的物质保留在固定相上的一种色谱方法。
平面色谱
纸色谱 薄层色谱
薄层色谱法是将被分离物质点在将固定相均
匀涂布于玻璃板、铝箔或塑料片上形成的薄层上
而进行分离的。
（1）溶剂的分类 展开剂是由单一或混合溶剂组成的，因此溶剂
的性质是溶剂分类的基础，溶剂分类是确定展开剂 组成的基础。
溶剂分成6类：第Ⅰ类为电子授受体溶 剂；第Ⅱ类为质子给予体溶剂；第Ⅲ类为 强质子给予体溶剂；第Ⅳ类为质子受体溶 剂；第Ⅴ类为偶极作用力溶剂；第Ⅵ类为 惰性溶剂（即非极性溶剂）。
（2）溶剂强度
1、固定相
（1）硅胶 普通硅胶和改性硅胶两种类型。
①普通硅胶 硅胶为多孔性无定形粉末，表面有硅醇基成弱
酸性（pH=4.5)，通过硅原子上的-OH基与极性化合 物或不饱和化合物形成氢键而表现其吸附性能。有 效的硅醇基数目越多，其吸附能力越强。
② 改性硅胶
改性硅胶是借化学反应的方法，将有机分子以共
价键连接在硅胶的硅醇基上，因此称为化学键合固定
二、薄层色谱法的技术参数
薄层色谱法的技术参数包括分配系数与容量因 子，理论塔板数与塔板高度，分离度，保留值等。
薄层色谱保留值表示方式有：比移值（Rf) 比移值是溶质移动距离与流动相移动距
离之比，是薄层色谱的基本定性参数。
当Rf=0时，表示组分留在 原点未被展开；当Rf=1时，表 示组分随展开剂至前沿，即组 分不被固定相吸附，所以Rf值 只能在0~1之间。通常Rf值在 0.2~0.8之间较适宜。
吸附剂及预制板包装上部分符号及含义
符号
G H R P W Ｆ254,365 F254s 40,60,….
含义
以石膏作粘合剂 无外加粘合剂
特别纯化的 制备用
水可湿性的 荧光指示剂激发波长 抗酸性荧光指示剂
平均孔径
3、薄层板的制备方法
薄层板包括有预制板和手工制板两种。
（1）预制板 预制板使用方便，涂布均匀，薄层光滑及有很
线性展开：上行展开、下行展开、双向展开、 近水平展开、水平展开。
1. 溶剂蒸发面积大， 展开时易饱和
2. 展开速度快 3. 展开溶剂用量大 4. 溶剂易浸没点样点
近水平展开
上行展开
3、展开剂
展开剂又可称为溶剂系统、流动相或洗脱剂， 是在平面色谱法中用作流动相的液体。理想的展开 剂分离样品得到的Rf值应在0.2~0.8之间。
这种方法是通过一种或几种试剂与被检物质产生 化学反应，生成有色物质，是平面色谱广泛应用的 定位方法。
（1）显色方法：
喷雾显色、浸渍显色、超压衍生化等。 喷雾显色的显色剂溶液以气溶胶的形式均匀的喷 洒在薄层上。
喷雾显色法务必在通 风柜中进行。
自动喷雾器适用于定 量。手动喷雾器用于定量 分析时可能因喷雾不均匀 而产生较大误差。
手工制的硅胶或氧化铝薄层板，涂布晾干 后有时必须经过活化才能使用。
薄层板活化的原因
薄层活度大小受大气相对湿度的影响， 吸附剂表面能可逆地吸收水分。如果大气湿 度过大，薄层活度过低，对分离效果会产生 影响。
为了提高薄层活度则必须将室温晾干的 薄层板在点样前根据活度要求在一定温度下 活化。一般晾干后的薄层板在105~120℃条件 下干燥0.5~1h。
好的牢度，预制板有用玻璃板，塑料片或铝箔作为 载板，使薄层附着在上面，塑料片或铝箔的预制板 还有裁剪方便的优点。常用于薄层定量。
（2）手工制板 手工制板一般分为不含粘合剂的软板及
含粘合剂的硬板两种。
软 上用板手干是工法将制吸涂板附成所剂均用直匀的接的玻于薄璃玻层板璃即板可一般 为使用5c，m×但软20板cm疏，松1，0c操m×作不20方cm 或便 用，硬20因板cm此。×目2前0c很m少的使2m用m，厚主的要玻 璃板，要求板面平整，洗净后
几种不同点样方式的比较
A
B
C
A.长5~60mm，内径为0.2~0.05mm的熔融石英管；
B.微量注射器，机械控制，接触板面点样；
C.同B，用步进马达控制操作；
D.同B，完全用计算机控制点样。
方式 A B C D
优点 价廉 很精密 很精密 很精密
D
缺点 精密度差 需要仪器 仪器复杂 仪器很复杂
（三）展开
（二）薄层色谱与高效液相色谱的比较
色谱系统 展开方式 流速控制 平衡时间 分析样品 样品量 板高（μm） 有效板数 检测方式 溶剂用量 溶剂更换 固定相
薄层色谱
开放式 展开 吸附剂的毛细管作用 短 可同时分析多个样品 高 30 <600 静态 少 易 一次弃去
高效液相色谱
闭路 洗脱 由泵调节 不定 每次一个样品 低 2~5 ~5000 动态 多 难 反复使用
且具有化学惰性。 常用粘合剂有：煅石膏(CaSO4)、羧甲基
纤维素钠(CMC-Na)、淀粉；预制板的粘合剂 包括有聚乙烯醇、聚丙烯醇或聚丙烯酰胺等 高聚物。
（2）添加剂
为了特殊需要可在制备薄层时加入某 些添加剂制备成具有特殊性能的薄层。包 括有荧光指示剂，酸、碱或缓冲液，硝酸 银溶液和其他。
带有荧光指示剂的薄层在紫外灯下整个薄 层呈现荧光，被分离化合物的斑点处的荧光被 猝灭而呈暗色。
排列在薄层板放置架上备用。
洗净的玻璃板用乙醇擦拭干净，挥干乙 醇后，用手动或自动涂布器（最好用自动涂 布器）将已调制好的固定相均匀地涂铺在玻 璃板上，涂布后的薄层板应水平放置，室温 阴干备用。
制备薄层板时的注意事项
（1）必须先要制备固定相匀浆，由于固定相及粘合剂 类型不同，性能也不同，匀浆时加水量也不同。匀浆搅 拌时应朝同一个方向进行，以减少气泡的产生。
展开剂的选择方法：三角形法。根据展开剂、
固定相及被分离物质三者间的相互影响，三者 的关系如下：
活性 固定相
失活性
展开剂 非极性 亲水性
样品
展开剂选择的步骤：
➢ 第一：选择一种合适的溶剂强度的展开剂，使样品 中各组分多落在最佳或至少是可用Rf范围内。
➢ 第二：进一步提高展开剂的选择性，即使样品中各 组分有合适的分离度。对于未知混合物，则要求分 离斑点数越多越好。
产生边缘效应时，只需用展开剂将展开 室及薄层板饱和后再展开就可以消除。
饱和对展开影响很大，因此对展开室的饱和 及对薄层的预平衡非常重要。
此外，展开时展开室的密闭也很重要。
（3）温度的影响 展开时环境的温度对薄层色谱的展开影响很小。
通常在室温下进行展开。
（4）展开方式的影响 不同的展开方式，不同的展开条件对平面色谱的
点样后的薄层需置密闭并加有展开剂的展开室中 进行展开，样品与展开剂及固定相之间相互作用的结 果使样品中各成分沿展开剂流动的方向被分开。
1、展开室
双槽展开室
平底展开室
2、展开方式
平面色谱的展开有三种几何形式即线性、环形及 向心。其中最常用的有线性展开和多次展开。
（a）、（b）为线性，（c）为环形，（d）为向心
高比移值（hRf=100×Rf）
Rf

b a

原点中心至斑点中心的距离 原点中心至溶剂前沿的距离
三、薄层色谱法的基本操作
薄层板的准备
点样
样品处理
展开定位定性与定量 Nhomakorabea（一）薄层板
制备薄层板的载板包括有：玻璃板、塑 料片和铝箔。
铺为制了薄使层薄板层可牢用固的固地定附相着有在：支硅持胶体、氧上化便铝于、 操纤作维素，、需聚要酰时胺还、要葡在聚糖固凝定胶相等中，加其入中合薄层适色的谱粘法 合用剂的固；定为相了90特%殊以的上分的分离离或工检作出都需可要用，硅胶有。时也 需在固定相中加入某些添加剂。
分离效果有明显的影响。
（5）展距的影响 常规薄层展距为10~20cm，高效薄层为5~10cm。
（6）展开室的放置 不能放在空气对流强的地方，并且注意避光。
（四）定位
展开后的薄层板需挥干表面多余的展开剂，然后 采用适当的方法对被分离物质进行定位。
定位方法
1、光学检出法 化合物对可见光和紫外光有吸收，在色谱上可观
（2）显色试剂
显色试剂有通用显色剂和专属性显色剂。
①通用显色剂 a. 硫酸
薄层展开时展开剂的量不能太少也不能 太多，太少被分离物质不能分离，太多则会 淹没点样点，使被分离物从薄层板上脱离而 溶于展开剂中。
4、影响薄层展开的因素
（1）相对湿度的影响 水蒸气与吸附剂之间有很大的亲和力，即使是微
量的水蒸气对色谱分离结果也会产生较大的影响。 （2）溶剂蒸气的影响
平面色谱分离过程是固定相、流动相和气相共同 作用的结果。在展开时展开室的饱和对分离有明显的 影响。溶剂蒸气得不到饱和易引起“边缘效应”。
（2）另一些化合物，当薄层放置在碘蒸气中几秒 钟后，就立即产生不可逆的化学反应。此法常用 于薄层的定位与定性。但要注意有些化合物与碘 蒸气发生不可逆反应而改变原来化合物的性质。
3、试剂显色法 分离后的化合物在紫外光或可见光下不能显示斑
点，可根据被检出化合物的理化性质选择适当的显 色剂使之生成颜色或荧光稳定、轮廓清楚、灵敏度 高、专属性强的斑点。
溶剂强度是指单一溶剂或混合溶剂洗脱某种溶 质的能力。在正相色谱中，它随溶剂极性的增加而 增大；在反相色谱中则相反。溶剂强度大的溶剂洗 脱能力强。
常用溶剂洗脱顺序（由弱到强）：四氯化 碳（1.7），甲苯（2.3），氯仿（4.4），乙腈 （6.2），乙酸乙酯（4.3），丙酮（5.4），乙醇 （5.2），甲醇（6.6），水（9.0）。
注意：
1硅. 原胶点的直硅径醇过基大以会氢降键低的分形辨式率优及先分吸离附度水；，尽吸水 速度可很能快避，免因多此次应点用样预。先经过活化的薄层板。在点 样时2也. 点会样立量即：吸经附典空薄气层中一的般水为蒸1气~5，u因l，此高在效点薄样时 可用层干为净1的00玻~5璃00板n盖l，住总活量化不的要薄超层载板。，只留出原点 区域3以. 点便样点速样度。尽可能快，耗时尽可能短。
（2）涂布时速度要快，避免固定相过度凝固给涂布带 来困难，涂布速度要求均匀，涂布后的薄层晾干时应在 阴凉的地方，避免因通风而导致层面产生裂纹；应保持 水平放置。
（3）定性定量时用的薄层固定相厚度为0.2~0.3mm，制 备薄层的厚度要求约0.5~2mm。
4、薄层板的活化
薄层分离物质与吸附剂表面及其孔隙表面的 活性点的强度和数目有关。活性点的强度及数目 较大时，吸附剂的活度就高，吸附剂的保留能力 也较高，不同物质在吸附剂上被吸附的能力不同， 则可以彼此分离。
（二）点样
在点样前，应将薄层板在日光或紫外光 下检查板面有无损坏或污染。
点样时通常使用点样针和毛细管进行点样。
毛细管规格(mm)：内径Φ0.1、 0.2、0.3、0.4、0.5×长度100。
注意：点样时点样针或毛细管 不能划破载板上的固定相。
常用的点样方式：点状点样和带状点样。
点状点样：原点直径<5mm，一般为3mm（经典薄层） 和 1~2mm（高效薄层）。 带状点样：展开后的斑点不仅分辨率明显高于点状点 样，而且精密准确，为定量分析提供最佳条件。