灭菌工艺基础知识

无菌空气系统



1、无菌空气在发酵生产中的作用： 产生抗生素的微生物大多数是好氧菌（需氧菌）， 整个发酵过程需要不断通入无菌压缩空气，为微生物 生长代谢持续供氧，并维持罐压防止外界杂菌侵入。 2、无菌空气的重要性： 空气系统带菌造成的染菌约占染菌总数的20%，合 理设计、安装空气净化设备，严格按无菌制度和操作 规程使用空气，是保证空气无菌的关键。 3、无菌空气的预处理： 空气中含有水分、尘埃、细菌，需要经过除水、多 级过滤除菌等处理过程，方可用于发酵生产。
染菌率的计算
以发酵总罐批为基准, 染菌罐批应包括染菌 重消后的重复染菌的罐批。发酵总过程(全周 期)无论前期或后期染菌,均作“染菌”论处 。 发酵罐染菌罐批 染菌率(％)＝－－－－－－－－－－X100% 总投罐批

题解4--设备造成染菌的原因

空气分布管安装不合理 。 排气与排污管道相互串联在一起。 补料管道安装不合理造成死角。 分蒸汽管路进汽位置不合适，灭菌时“短路”。 管道中的阀门和法兰、丝扣等渗漏。 罐体穿孔或罐内冷却管穿孔。 轴封泄漏。
Hale Waihona Puke Baidu
题解5--空气过滤器注意事项?



（1）加强预过滤器的检查，加强蒸汽过滤器的检查。 （2）压降超标停止使用。 （3）安装新过滤器滤芯前严格检查滤层有无破损。 （4）保证空气湿度在60%以下，防止湿空气造成滤 芯过滤效果下降。 （5）严禁培养基倒流入空气过滤器。 （6）灭菌时严禁空气、蒸汽同时使用，严禁超温超 压，送空气时要缓慢。 （7）灭菌完要使蒸汽冷凝水彻底排净、吹干后使用。 （8）总过滤器滤芯采用自净方式处理，不得用蒸汽 消毒。
冷却后 30℃（T露）
无菌空气的制备—除水和加热

压缩空气冷却到露点以下后，空气中水分析出，由于空气在管道 中流速较大，水滴或雾滴被空气所夹带，通常采用旋风分离器利 用离心力除掉水滴及较重微粒。
无菌空气的制备—加热器

从除水设备中出来的空气，相对湿度仍达100%， 直接进行过滤会浸湿过滤介质，影响过滤效果。 因此需将空气进行加热升温，降低相对湿度，保 证空气以较干燥状态进入过滤器。
灭菌工艺基础知识
灭菌和消毒的目的与定义




消毒、灭菌的目的：抗生素发酵是纯种培养过程， 培养基在储存、运输、加工、配制过程中不同程度 污染了多种杂菌，需要通过严格的消毒、灭菌以彻 底清除杂菌。 消毒的定义：消毒是指应用消毒剂等方法杀灭物体 表面和内部的病原菌营养体， 但不一定能杀死细菌 芽孢的方法 灭菌的定义：用物理或化学方法杀灭或除掉物料及 设备中所有的生命物质的工艺过程。包括致病和非 致病微生物以及芽孢。 灭菌比较彻底。 消毒、灭菌的重要性：消毒、灭菌工作在发酵车间 占有举足轻重的地位。
决定灭菌效果的主要因素

灭菌效果取决于——菌的种类与灭菌温度。 微生物有一个共同的行为特征——耐热性。不同的 微生物耐热性（灭菌温度）不同；相同温度下，芽胞 比生长期细菌的耐热性强。灭菌效果仅与菌的种类与 灭菌温度有关。
细菌芽胞灭菌时间和温度
细菌芽胞 名称
炭疽杆菌 枯草杆菌 韦氏梭菌 灭菌时间（min） 100℃ 2-5 数小时 45 27 40 15 1 105 ℃ 110 ℃ 120 ℃ 125 ℃
止回阀特点

又称止逆阀、单向阀等。止回阀是依靠液体本身的动 力自动启闭阀门，它的作用是阻止介质的逆向流动。 特点：介质在阀体内单向流动，阻止介质倒流；耐受 高温、高压，不易变形。缺点：不能使用在黏稠和有 颗粒的物料介质上，因为止回阀的密封面一旦有黏稠 物或有颗粒物的时候，止回阀就会失去单向的意义， 起不到防止物料倒流的作用；不能使用在有腐蚀性介 质的管路上。
无菌空气的制备—过滤
空气中含有细菌、霉菌孢子、酵母菌、噬菌体、 病毒等微生物，其中细菌芽胞和霉菌孢子较多，大小 为0.5-1μm，附着在尘埃和雾沫上，因此只要将大于 0.5μm的尘埃粒子除去，即可达到无菌要求。 一般经两级总过滤器、一级预过滤器、一级精过滤 器的分级过滤，可获得符合要求的无菌空气。
灭菌的方法


1、化学灭菌法：使用化学药剂如甲醛、苯酚、新洁尔 灭、过氧乙酸、高锰酸钾、漂白粉等进行某些容器或 物料及无菌区域的灭菌。 2、物理灭菌：主要有射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌 和过滤除菌。 3、按温度划分：100℃为常用消毒杀菌温度，100120℃为高温灭菌，120-150℃为超高温灭菌。 4、湿热灭菌比干热灭菌更有效，对芽胞的杀灭效果更 佳。
。
球形阀特点

也称球阀。特点：流体阻力小，流量大，极 小有压差的表现；不受安装的方向性的制约 ；能耐受高温高压，耐腐蚀，严密性好，阀 体本身不存在死角，结构简单，极少有渗漏 点。缺点：不能做微量调节使用，最好是全 开或全闭；尽管能耐受高温，也不要在长期 高温管路上使用。
手动隔膜阀特点

也称隔阀，它是依靠橡胶隔膜和聚四氟隔膜，通过手 动拉杆的紧密压合而达到开启和密闭的。特点：流体 阻力小，流速不受影响；可以在黏稠或有颗粒的介质 上；介质不会于阀头部分接触，因此不存在阀头填料 密封处泄漏的弊端；结构简单耐受腐蚀。缺点：除特 制的耐高温高压的隔膜阀外，一般的手动隔膜阀不耐 受高温高压，一般公称压力在6Kgf/cm2 ，温度为80℃ ，最高耐受温度180℃；容易损坏，渗漏，变形；必须 定期更换隔膜阀垫。
肉毒梭菌
嗜热杆菌
300
120
400
90
300
20
35 8
灰黄霉素的菌体形态（发酵液）
决定灭菌效果的主要因素


由上表可以看出，芽胞比生长期细菌的耐热性强。 芽胞：是细菌抵抗外界不良环境（高温、低温、光线、 干燥、化学品）的休眠体，具有很强的耐热性。 因此，以杀灭最耐热的芽胞为标准，把121℃、30分钟 作为最安全的灭菌温度和灭菌时间。
截止阀特点：

也叫球心阀，截阀。优点：密封面摩擦力小、 耐用；严密性能好、易于开关、维修方便；开 启高度可以使用丝扣拉杆控制，易于调节流量 ；耐受高温及压力，不易损坏。缺点：截止阀 阀芯阻力大，影响流量和流速；截止阀不易于 在黏稠的物料中使用，这样会造成阀门的密封 面不严密而泄漏；截止阀安装时有方向性，逆 向安装会造成阻力更大，但在发酵罐的连接上 ，必须注意与发酵罐为正向，与管路流向为逆 向安装。
针形阀特点

一般是用来控制微量调节的小型阀门，它的一般通径 有15mm和10mm两种。 优点：耐受高温、高压、不易腐蚀；易于控制微量流 速和流加、滴加补料；操作方便，易于更换。缺点： 易于损坏，尤其是阀头容易掉头；因为结构小，通道 小，所以容易被堵塞。
旋塞阀特点

也称考克，是一种不耐受高温和高压，但又易 于操作的阀门。材质一般以铸铁为主，这就决 定了它不能耐受高温（一般要求小于等于100 ℃）和高压，不能猛力开关，以免扭断、变形
典型发酵罐及管道、阀门组成？（题解3）


典型的发酵罐包括罐体、上下封头、人孔、传动装置 （包括减速机或皮带轮、轴承箱、轴封、传动轴、联 轴器、拉筋、搅拌浆）、蛇管或夹层、灯孔、视镜孔、 接种口、压力表等仪表接口、温度计管（温度传感 器）、电极座（PH、ＤＯ）、挡板等。 发酵罐附属的管道按功能分为进放料管道、进气排气 管道、取样管道、冲视镜管道、间接冷却加热管道、 消泡剂管道、移种管道、补料管道、通氨管道等系统。
消毒、发酵指标及常用参数

1、效价：抗生素是一种生理活性物质，其活性常用特 定的单位---“效价”来表示，它是衡量抗生素有效成分 的尺度，也是衡量其抗菌性能的标志。常用单位/毫升 （r/ml）或单位/毫克（u/mg）来表示。

2、PH值 要想得到比较理想的发酵单位，必须重视消前、消 后、发酵过程中PH值的控制，即应将PH值控制在抗生 素产生菌的生长繁殖及合成抗生素的最适合的PH值范 围内。
3、发酵液体积
（一）理论放罐体积=发酵罐空罐体积×装料系数 空罐体积=π ×内半径的平方×罐体高度+下封头容积 （二）放罐体积=（一、二级种子液+发酵罐消后体积+ 全程补料液体积）-蒸发量
放罐总亿和发酵指数





根据发酵效价、体积、与泡沫系数，计算发酵产物 的总亿效价 实体积／虚体积=泡沫系数 虚体积×泡沫系数=实体积 实体积×放罐效价=发酵总亿 发酵指数是衡量发酵水平的技术指标。 平均发酵单位×平均放罐体积 发酵指数= ——————————————— 平均发酵周期×发酵罐空罐体积 发酵指数单位（发酵液总亿/小时·m3）
消后体积的重要性



对于种子罐、发酵罐、补料罐消毒体积的要求，必须 保证碳、氮比例协调，符合工艺规定的消后指标。 对于种子罐的消后体积，体积过小，移入下级罐的接 种量偏低，使产生菌生长代谢缓慢，起步单位低；体 积过大，容易起沫染菌，不利于正常生产。 对于补料罐的消后体积，主要控制计料液的含糖量。
灭菌对培养基的影响




湿热灭菌属于高温灭菌，灭菌的时间越长、温度越高， 营养成分破坏也越严重。 灭菌是一把双刃剑，在保证全部杀灭杂菌的同时为抗 生素纯种发酵提供无菌培养基，还不同程度地破坏培 养基，同时发生一系列物理、化学反应。 各车间根据培养基特点、工艺要求，在经过理论计算、 工艺验证的基础上，制定不同的灭菌温度和灭菌时间。 此外，还要注意升温阶段、降温阶段，与保温阶段同 样有灭菌效果。
发酵罐消后体积的重要性（题解2）
对于发酵罐的消后体积，除了要保证工艺条件 外，还需考虑装料系数（理论放罐体积）和全 程补料量，过大的体积会造成许多不利之处： 1、体积过大，容易造成逃液。 2、容易污染杂质，影响发酵水平。 3、空气利用不好，影响溶氧。 相反，体积过小，使放罐体积变小，发酵总 亿达不到要求，产量偏低，设备利用率差，成 本偏高。
题解6-7


使用蒸汽前必须排尽蒸汽管道内的冷却水？ 蒸汽管道内的冷凝水夹带着少量铁锈及杂物， 如不将其排尽，在通蒸汽时会直接引入罐内，引起 阀门开启失灵，另外还会使消后体积不准，尤其是 消空气滤芯更应排尽水。 灭菌操作中为什么要以温度为主，压力为辅进行控 制？ 一般情况下，灭菌时达到一定罐压即表示温度 也到了，但是若仅控制罐压，则并不安全可靠，因 操作不当可能会出现虚假罐压，所以灭菌操作中必 须要以温度为主，压力为辅进行控制。
相对湿度
80.00% 5.60%
湿含量
0.0298kg/kg 0.0298kg/kg
无菌空气的制备—冷却
压缩空气经冷却后，压强不变、温度降低，相对湿 度提高，湿含量降低，且温度降低到露点以下、相对 湿度100%时，水分析出。如下表：
温度 压缩前 压缩后 20℃ 104℃ 表压 0MPa 2.0MPa 2.0MPa 相对湿度 80.00% 5.60% 100.00% 湿含量 0.0298kg/kg 0.0298kg/kg 0.0048kg/kg
灭菌温度、时间对培养基的影响
灭菌温度（℃） 灭菌时间（min） 破坏程度（%）
100 110 115 120 130 140 150 400 30 15 4 0.50 0.08 0.01 99.3 67 50 27 8 2 ＜1
发酵培养基各组分的性质及作用




1、碳源：为细胞生命活动提供能量以及合成产物的碳 架。淀粉、糊精、豆油、葡萄糖、鱼油属于碳源。 2、氮源：是构成生物体的蛋白质、核酸及其他氮素 化合物的材料。黄豆饼粉、豆粕粉、玉米浆、酵母粉、 硫酸铵、氨水属于氮源。黄豆饼粉、酵母粉为有机氮 源，硫酸铵为无机氮源。 3、无机盐：硫酸亚铁、磷酸二氢钾、碳酸钙、硫酸镁。 4、微量元素：氯化钴。 5、其它辅料：淀粉酶、抗生素 、消泡剂等。
无菌空气系统工作流程
空 气 冷 却 器
旋 风 分 离 器
空 气 加 热 器
总 过 滤 器
无菌空气的制备—压缩
空气经空压机压缩后，压强和温度提高，相对湿 度下降，但湿含量不变，露点比压缩前提高，也就是 下一步空气经冷却后很容易达到露点而析出水。如下 表：
温度
压缩前 压缩后 20℃ 104℃
表压
0MPa 2.0MPa
湿热灭菌法
湿热灭菌法的原理

通过饱和蒸汽加热、加压，使温度上升到微生物致 死范围，菌体蛋白质或核酸发生变性、凝固、继而死
亡。
消毒介质----饱和蒸汽


抗生素培养基通常以饱和蒸汽做为灭菌介质。
饱和蒸汽灭菌（湿热灭菌）的优点(题解1）： 1）本身无毒、无公害。 2）蒸汽具有很大潜热，穿透力强，有利于彻底灭菌。 3）制备输送容易，调节方便，操作上易管理。