灭菌工艺基础知识

消后体积的重要性



对于种子罐、发酵罐、补料罐消毒体积的要求，必须 保证碳、氮比例协调，符合工艺规定的消后指标。 对于种子罐的消后体积，体积过小，移入下级罐的接 种量偏低，使产生菌生长代谢缓慢，起步单位低；体 积过大，容易起沫染菌，不利于正常生产。 对于补料罐的消后体积，主要控制计料液的含糖量。
湿热灭菌法
湿热灭菌法的原理

通过饱和蒸汽加热、加压，使温度上升到微生物致 死范围，菌体蛋白质或核酸发生变性、凝固、继而死
亡。
消毒介质----饱和蒸汽


抗生素培养基通常以饱和蒸汽做为灭菌介质。
饱和蒸汽灭菌（湿热灭菌）的优点(题解1）： 1）本身无毒、无公害。 2）蒸汽具有很大潜热，穿透力强，有利于彻底灭菌。 3）制备输送容易，调节方便，操作上易管理。
冷却后 30℃（T露）
无菌空气的制备—除水和加热

压缩空气冷却到露点以下后，空气中水分析出，由于空气在管道 中流速较大，水滴或雾滴被空气所夹带，通常采用旋风分离器利 用离心力除掉水滴及较重微粒。
无菌空气的制备—加热器

从除水设备中出来的空气，相对湿度仍达100%， 直接进行过滤会浸湿过滤介质，影响过滤效果。 因此需将空气进行加热升温，降低相对湿度，保 证空气以较干燥状态进入过滤器。
灭菌的方法


1、化学灭菌法：使用化学药剂如甲醛、苯酚、新洁尔 灭、过氧乙酸、高锰酸钾、漂白粉等进行某些容器或 物料及无菌区域的灭菌。 2、物理灭菌：主要有射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌 和过滤除菌。 3、按温度划分：100℃为常用消毒杀菌温度，100120℃为高温灭菌，120-150℃为超高温灭菌。 4、湿热灭菌比干热灭菌更有效，对芽胞的杀灭效果更 佳。
止回阀特点

又称止逆阀、单向阀等。止回阀是依靠液体本身的动 力自动启闭阀门，它的作用是阻止介质的逆向流动。 特点：介质在阀体内单向流动，阻止介质倒流；耐受 高温、高压，不易变形。缺点：不能使用在黏稠和有 颗粒的物料介质上，因为止回阀的密封面一旦有黏稠 物或有颗粒物的时候，止回阀就会失去单向的意义， 起不到防止物料倒流的作用；不能使用在有腐蚀性介 质的管路上。
题解5--空气过滤器注意事项?



（1）加强预过滤器的检查，加强蒸汽过滤器的检查。 （2）压降超标停止使用。 （3）安装新过滤器滤芯前严格检查滤层有无破损。 （4）保证空气湿度在60%以下，防止湿空气造成滤 芯过滤效果下降。 （5）严禁培养基倒流入空气过滤器。 （6）灭菌时严禁空气、蒸汽同时使用，严禁超温超 压，送空气时要缓慢。 （7）灭菌完要使蒸汽冷凝水彻底排净、吹干后使用。 （8）总过滤器滤芯采用自净方式处理，不得用蒸汽 消毒。
灭菌对培养基的影响




湿热灭菌属于高温灭菌，灭菌的时间越长、温度越高， 营养成分破坏也越严重。 灭菌是一把双刃剑，在保证全部杀灭杂菌的同时为抗 生素纯种发酵提供无菌培养基，还不同程度地破坏培 养基，同时发生一系列物理、化学反应。 各车间根据培养基特点、工艺要求，在经过理论计算、 工艺验证的基础上，制定不同的灭菌温度和灭菌时间。 此外，还要注意升温阶段、降温阶段，与保温阶段同 样有灭菌效果。
3、发酵液体积
（一）理论放罐体积=发酵罐空罐体积×装料系数 空罐体积=π ×内半径的平方×罐体高度+下封头容积 （二）放罐体积=（一、二级种子液+发酵罐消后体积+ 全程补料液体积）-蒸发量
放罐总亿和发酵指数





根据发酵效价、体积、与泡沫系数，计算发酵产物 的总亿效价 实体积／虚体积=泡沫系数 虚体积×泡沫系数=实体积 实体积×放罐效价=发酵总亿 发酵指数是衡量发酵水平的技术指标。 平均发酵单位×平均放罐体积 发酵指数= ——————————————— 平均发酵周期×发酵罐空罐体积 发酵指数单位（发酵液总亿/小时·m3）
灭菌工艺基础知识
灭菌和消毒的目的与定义




消毒、灭菌的目的：抗生素发酵是纯种培养过程， 培养基在储存、运输、加工、配制过程中不同程度 污染了多种杂菌，需要通过严格的消毒、灭菌以彻 底清除杂菌。 消毒的定义：消毒是指应用消毒剂等方法杀灭物体 表面和内部的病原菌营养体， 但不一定能杀死细菌 芽孢的方法 灭菌的定义：用物理或化学方法杀灭或除掉物料及 设备中所有的生命物质的工艺过程。包括致病和非 致病微生物以及芽孢。 灭菌比较彻底。 消毒、灭菌的重要性：消毒、灭菌工作在发酵车间 占有举足轻重的地位。
无菌空气的制备—过滤
空气中含有细菌、霉菌孢子、酵母菌、噬菌体、 病毒等微生物，其中细菌芽胞和霉菌孢子较多，大小 为0.5-1μm，附着在尘埃和雾沫上，因此只要将大于 0.5μm的尘埃粒子除去，即可达到无菌要求。 一般经两级总过滤器、一级预过滤器、一级精过滤 器的分级过滤，可获得符合要求的无菌空气。
肉毒梭菌
嗜热杆菌
300
120
400
90
300
20
35 8
灰黄霉素的菌体形态（发酵液）
决定灭菌效果的主要因素


由上表可以看出，芽胞比生长期细菌的耐热性强。 芽胞：是细菌抵抗外界不良环境（高温、低温、光线、 干燥、化学品）的休眠体，具有很强的耐热性。 因此，以杀灭最耐热的芽胞为标准，把121℃、30分钟 作为最安全的灭菌温度和灭菌时间。
灭菌温度、时间对培养基的影响
灭菌温度（℃） 灭菌时间（min） 破坏程度（%）
100 110 115 120 130 140 150 400 30 15 4 0.50 0.08 0.01 99.3 67 50 27 8 2 ＜1
发酵培养胞生命活动提供能量以及合成产物的碳 架。淀粉、糊精、豆油、葡萄糖、鱼油属于碳源。 2、氮源：是构成生物体的蛋白质、核酸及其他氮素 化合物的材料。黄豆饼粉、豆粕粉、玉米浆、酵母粉、 硫酸铵、氨水属于氮源。黄豆饼粉、酵母粉为有机氮 源，硫酸铵为无机氮源。 3、无机盐：硫酸亚铁、磷酸二氢钾、碳酸钙、硫酸镁。 4、微量元素：氯化钴。 5、其它辅料：淀粉酶、抗生素 、消泡剂等。
典型发酵罐及管道、阀门组成？（题解3）


典型的发酵罐包括罐体、上下封头、人孔、传动装置 （包括减速机或皮带轮、轴承箱、轴封、传动轴、联 轴器、拉筋、搅拌浆）、蛇管或夹层、灯孔、视镜孔、 接种口、压力表等仪表接口、温度计管（温度传感 器）、电极座（PH、ＤＯ）、挡板等。 发酵罐附属的管道按功能分为进放料管道、进气排气 管道、取样管道、冲视镜管道、间接冷却加热管道、 消泡剂管道、移种管道、补料管道、通氨管道等系统。
截止阀特点：

也叫球心阀，截阀。优点：密封面摩擦力小、 耐用；严密性能好、易于开关、维修方便；开 启高度可以使用丝扣拉杆控制，易于调节流量 ；耐受高温及压力，不易损坏。缺点：截止阀 阀芯阻力大，影响流量和流速；截止阀不易于 在黏稠的物料中使用，这样会造成阀门的密封 面不严密而泄漏；截止阀安装时有方向性，逆 向安装会造成阻力更大，但在发酵罐的连接上 ，必须注意与发酵罐为正向，与管路流向为逆 向安装。
无菌空气系统工作流程
空 气 冷 却 器
旋 风 分 离 器
空 气 加 热 器
总 过 滤 器
无菌空气的制备—压缩
空气经空压机压缩后，压强和温度提高，相对湿 度下降，但湿含量不变，露点比压缩前提高，也就是 下一步空气经冷却后很容易达到露点而析出水。如下 表：
温度
压缩前 压缩后 20℃ 104℃
表压
0MPa 2.0MPa
。
球形阀特点

也称球阀。特点：流体阻力小，流量大，极 小有压差的表现；不受安装的方向性的制约 ；能耐受高温高压，耐腐蚀，严密性好，阀 体本身不存在死角，结构简单，极少有渗漏 点。缺点：不能做微量调节使用，最好是全 开或全闭；尽管能耐受高温，也不要在长期 高温管路上使用。
手动隔膜阀特点

也称隔阀，它是依靠橡胶隔膜和聚四氟隔膜，通过手 动拉杆的紧密压合而达到开启和密闭的。特点：流体 阻力小，流速不受影响；可以在黏稠或有颗粒的介质 上；介质不会于阀头部分接触，因此不存在阀头填料 密封处泄漏的弊端；结构简单耐受腐蚀。缺点：除特 制的耐高温高压的隔膜阀外，一般的手动隔膜阀不耐 受高温高压，一般公称压力在6Kgf/cm2 ，温度为80℃ ，最高耐受温度180℃；容易损坏，渗漏，变形；必须 定期更换隔膜阀垫。
染菌率的计算
以发酵总罐批为基准, 染菌罐批应包括染菌 重消后的重复染菌的罐批。发酵总过程(全周 期)无论前期或后期染菌,均作“染菌”论处 。 发酵罐染菌罐批 染菌率(％)＝－－－－－－－－－－X100% 总投罐批

题解4--设备造成染菌的原因

空气分布管安装不合理 。 排气与排污管道相互串联在一起。 补料管道安装不合理造成死角。 分蒸汽管路进汽位置不合适，灭菌时“短路”。 管道中的阀门和法兰、丝扣等渗漏。 罐体穿孔或罐内冷却管穿孔。 轴封泄漏。
决定灭菌效果的主要因素

灭菌效果取决于——菌的种类与灭菌温度。 微生物有一个共同的行为特征——耐热性。不同的 微生物耐热性（灭菌温度）不同；相同温度下，芽胞 比生长期细菌的耐热性强。灭菌效果仅与菌的种类与 灭菌温度有关。
细菌芽胞灭菌时间和温度
细菌芽胞 名称
炭疽杆菌 枯草杆菌 韦氏梭菌 灭菌时间（min） 100℃ 2-5 数小时 45 27 40 15 1 105 ℃ 110 ℃ 120 ℃ 125 ℃

无菌空气系统



1、无菌空气在发酵生产中的作用： 产生抗生素的微生物大多数是好氧菌（需氧菌）， 整个发酵过程需要不断通入无菌压缩空气，为微生物 生长代谢持续供氧，并维持罐压防止外界杂菌侵入。 2、无菌空气的重要性： 空气系统带菌造成的染菌约占染菌总数的20%，合 理设计、安装空气净化设备，严格按无菌制度和操作 规程使用空气，是保证空气无菌的关键。 3、无菌空气的预处理： 空气中含有水分、尘埃、细菌，需要经过除水、多 级过滤除菌等处理过程，方可用于发酵生产。