基因克隆原核表达-2002
外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程如下：
1. 设计引物：根据外源基因的序列，设计引物，其中至少包括一个启动子和一个终止子。
2. 基因克隆：使用PCR或其他克隆技术，将外源基因与载体DNA连接起来，形成重组质粒。
3. 转化：将重组质粒转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌。
4. 筛选：通过选择性培养基或其他筛选方法，筛选出带有重组质粒的转化菌落。
5. 培养：将筛选出的转化菌落进行扩增培养，在适当的培养条件下培养细菌。
6. 表达：在培养过程中，外源基因会被宿主细胞转录和翻译，产生目标蛋白质。
7. 提取：收集细菌培养物，利用细胞破裂或其他细胞提取方法，提取目标蛋白质。
8. 纯化：通过各种纯化技术，如柱层析、电泳等，纯化目标蛋白质。
9. 鉴定：利用各种方法，如SDS-PAGE、Western blot等，对
目标蛋白质进行鉴定和定量分析。
10. 应用：利用纯化的目标蛋白质进行后续的研究或应用，如
功能鉴定、结构分析、抗原制备等。
这是一个基本的流程，根据不同的实验目的和具体情况，可能还会涉及到一些其他的步骤和操作。
人胱抑素C基因的克隆和原核表达
Ｆ Ｓ Ｈ和 ＨＣ Ｇ包被 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ板， ｈ Ｔ Ｓ Ｈ Ｍｃ Ａ ｂ与 它 们 反 应 的 ０ Ｄ ４ ５ ０ ． ， ． 值为０ ． ０ ５ ８ ６— ０ ． ０ ６ ０ ８ ， 与Ｏ Ｖ Ａ（ 卵清蛋 白） 包被 空 白 对 照孔值相 近 ， 表明无 明显 的交叉反应 。
ｃ ｈ ｒ ｏ ｍ ａ ｔ ｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈ ｉ ｃ ｓ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｉ ｔ ｏ ｎ ｍ ｅ ｈ ｔ ｏ ｄ［ Ｊ ］ ．Ｃ ｌ ｉ ｎ Ｃ ｈ ｅ ｍ ，１ ９ ８ １ ，２ ７ ：
３ 讨 论
自从单 克隆抗体 问世 以来 ， 已在 医学和兽 医学 研究领域 中得到了深入发展 ， 并且成效显著 ， 尤其 是在疾病 的预 防、 诊 断和治疗 中更是功勋卓著 。相 比于 多克隆抗体 ， 单 克隆抗体
射免疫学杂志 ， ２ ０ ０ ５， １ ８ （ ２ ） ： １ ４ ６ － １ ４ ７ ． ［ ２ ］ Ｄ ａ ｙ ａ ｎ Ｃ Ｍ．Ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｐ ｒ ｅ ｔ ａ ｉ ｔ ｏ ｎ ｏ ｆ ｔ ｈ ｙ ｒ ｏ ｉ ｄ ｆ ｕ ｎ ｃ ｉ ｔ ｏ ｎ ｔ ｅ ｓ ｔ ｓ ［ Ｊ ］ ．Ｌ ａ ｎ ｃ ｅ ｔ ，
２ ５： １ ４７ ６－ １ ４７ ９．
Ｔ Ｓ Ｈ结构类 似物 Ｔ Ｓ Ｈ Ｌ Ｈ Ｆ Ｓ Ｈ Ｈ Ｃ Ｇ 空 白对照 （ Ｏ Ｖ Ａ ） 平均吸光值 ｘ １ ． １ ０ ８ ９ ０ ． ０ ６ ０ ８ ０ ． ０ ６ ３ ６ ０ ． ０ ５ ８ ６ ０ ． ０ ５ ４ ８
．
．
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７６ ６ ． ． — —
２ ０ １ ３年第 ２ ６卷 第 ６期 Ｊ ｏ ｆ Ｒ ａ ｄ ｉ ｏ ｉ ｍ ｍｕ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ２ ０ １ ３， ２ ６ （ ６
磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因的克隆与原核表达
磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因的克隆与原核表达赵忠润;包慧芳;王宁;周亚飞;杨慧;王炜【摘要】[目的]检测磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因在大肠杆菌中能否高效表达.[方法]根据GenBank所公布的serC基因序列设计一对特异性引物,以E.coliJM109基因组为模板PCR扩增目的基因片段,将得到的目的基因定向克隆至大肠杆菌/黄色短杆菌穿梭表达载体pEC7中,构建重组表达载体并转化宿主菌E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析.[结果]通过PCR扩增得到约1 100 bp的DNA片段,经测序后分析该基因与已发表的serC基因具有99.27%的同源性;对重组表达载体进行酶切和PCR方法鉴定正确的命名为pEC7- C;重组表达载体转化宿主菌,SDS-PAGE分析可见约41 kD与理论大小一致的目标蛋白条带.[结论]重组表达载体转化后E.coli BL21中蛋白表达量比原始菌株的蛋白表达量高,证明 serC基因在E.coli BL21(DE3)中成功表达,为进一步构建L-丝氨酸高产基因工程菌奠定了基础.【期刊名称】《新疆农业科学》【年(卷),期】2010(047)012【总页数】5页(P2505-2509)【关键词】serC基因;pEC7;基因克隆;原核表达【作者】赵忠润;包慧芳;王宁;周亚飞;杨慧;王炜【作者单位】石河子大学生命科学学院,新疆石河子,832000;新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木齐,830091;新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木齐,830091;石河子大学生命科学学院,新疆石河子,832000;石河子大学生命科学学院,新疆石河子,832000;新疆农业科微生物应用研究所,乌鲁木齐,830091【正文语种】中文【中图分类】S188+.20 引言【研究意义】L-丝氨酸(L-Serine)化学名为2-氨基-3-羟基丙酸,是一种生糖氨基酸。
人胰岛素样生长因子_1基因的克隆及其表达_吴岚晓
人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及其表达吴岚晓1,李明2,王萍2,陈白虹2(1.第一军医大学珠江医院血液科,广东广州510282;2.第一军医大学热带病研究室,广东广州510515)摘要:目的获得大量高纯度、具有生物学活性的人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1),构建hIGF-1原核表达载体,并进行表达与纯化。
方法以pUCIGF质粒为模板,PCR扩增了hIGF-1基因。
经适当酶切后,构建表达载体pRSE T-IGF,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,并经阴离子交换色谱、疏水色谱和凝胶过滤纯化。
结果带有重组质粒p RSE T-IGF的大肠杆菌经IPTG诱导后,以可溶性形式表达7.8kD大小的蛋白,其表达量占菌体总蛋白量的10%~20%,纯化后目的蛋白纯度达95%以上,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF-1抗原活性。
结论构建了pRSE T-IGF重组质粒,并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达,为获得大量基因工程产品奠定了基础。
关键词:胰岛素样生长因子-1;基因克隆;原核表达中图分类号:Q78;R977.15文献标识码:A文章编号:1005-1678(2002)01-0001-03C loning and expression of human insulin-like growth factor-1gene in E.coliW U Lan-xiao1,LI Ming2,WANG Ping2,C HE N Ba-i hong2(1.Department o f Hematology,Zhujiang Hos pital,First Military Medical U niversity,Guangzhou510218, China;2.Department o f Tro pical Disease,First Military Medical University,Guangzhou510515,China)Abstract:Purpose The aim is to get sufficient quantity of pure biologically human Insulin-like growth facto-r1(hIGF-1),and hIGF-1e xpression vector was constructed and expressed in E.coli.Methods The hIGF-1DNA fragment was obtained from the pUCIGF plasmid by PCR amplification.After being digested by restriction enzyme,the DNA fragment was cloned into a prokaryotic expression vector pRSE T B and hIGF-1ex-pression vector pRSE T-IGF was constructed.After it was expressed in the host cells E.coli B L21(DE3),the recombinant protein was purified by anion chromatography,hydrophobic chromatography and gel filtration.Re-sults SDS-PAGE analysis suggested the bacteria c ontaining the recombinant plasmid produced a protein of7.8 kD as induced by IPTG.The recombinant hIGF-1was expressed in soluble form,consisting of10%~20%of the total bacterial proteins.After purification,the target protein could be purified up to95%.Western blot indicated that the protein could react with antibodies a gainst hI GF-1.Conclusion The results demonstrate that hIGF-1e xpression vector has been successfully constructed and could be expressed in soluble form in E.coli.Key words:I GF-1;gene cloning;prokaryotic expression胰岛素样生长因子-1(Insulin-like gro wth factor-1, I GF-1)是一种多功能内分泌调控细胞因子,因在结构上与胰岛素原具有高度的同源性而得名。
乐至黑山羊肾溶菌酶基因克隆及原核表达
乐至黑山羊肾溶菌酶基因克隆及原核表达胡宇飞;江明锋;张鹏;罗樊;朱莲莲;王永【摘要】本研究对乐至黑山羊肾溶菌酶(LZLyK)基因进行了克隆、表达,并对其活性进行了测定.采用比较基因组技术,成功克隆了LZLyK基因,其cDNA长444 bp,编码147个氨基酸.同源性分析结果表明,氨基酸同源性与绵羊溶菌酶2(M32498.1)最高,达96.9％.构建原核表达质粒pET-LZLyK,转化大肠杆菌BL21 (DE3)并诱导表达.SDS-PAGE分析结果表明,重组蛋白LZLyK得到正确表达,分子质量约为16、30 ku.采用比浊法测定了LZLyK蛋白的活性,其活性为15 U/mL,表明LZLyK蛋白具有一定抗菌活性.运用实时荧光定量PCR发现在乐至黑山羊肝脏、肾脏、气管和皱胃中均有肾溶菌酶基因的表达,在胃中表达量较高.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2013(040)009【总页数】6页(P46-51)【关键词】乐至黑山羊;肾溶菌酶基因;克隆;原核表达【作者】胡宇飞;江明锋;张鹏;罗樊;朱莲莲;王永【作者单位】青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】Q78溶菌酶(lysozyme，LYZ)是一种有效的抗菌蛋白，能切断肽聚糖中的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键，从而引起细胞裂解(Masschalck等，2003)。
鸭茅斑驳病毒CP基因克隆、序列分析及原核表达
驳 病 毒 的 研 究 报 告 ． 本 文 利 用 Ｒ －Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ技 术 成 功
扩增 了 日本 分 离 株 的 Ｃ 基 因 ， 并 与 已 报 道 的 Ｐ Ｃ ＭＶ ２个 分 离 株 的 Ｃ ｆ Ｐ基 因序 列 进 行 了 比较 ，同 时利 用 原 核 表 达 系 统 将 该 基 因在 大 肠 杆 菌 中 高 效
（ ２０ １０ ８ ０ ） 助 ＫＷ ０ ３０ ２ １２ 资
＊ 通 讯 作 者 ， － ｉ ｅｙ ｎ ９ １ ６ ｃ ｒ ＊ Ｅ ｍａｌ ｉｕ ３ ＠ ２ ．ｏ ：／ ｎ
维普资讯
ｌ ８ ２
色Ｋｇ４￣ ｇ 第１卷 第１ ２０ 生１ 、 ｔ＇ ｔ － ７ 期 月 ３７
鸭 茅 （ ｃｙ ｉ ｇ ｏ ｒ ｔ ） 冷 季 型禾 本 科 Ｄａ ｔｌ ｌｍｅａａ Ｌ． 为 ｓ
牧 草 ，在 北 美 已有 ２ ０多 年 的 种 植 历 史［ ，近 年 ０ １ ］
Ｂ ２ （Ｅ ）Ｌｓ Ｌ １ Ｄ ３ ｐ ｙ ，克 隆 载 体 ｐ ＵＣ１ ，Ｔａ ９ ｑ酶 ，硝 酸 纤 维 素 膜 ，抗 ＧＳ 单 克 隆 抗 体 ，羊 抗 鼠 ＩＧ Ｔ ｇ－
分别 购 自 Ｐｏ ｇ ｒ ｍｅ ａ公 司和 宝 生 物 （ 连 ） 程 有 限 大 工
公 司．
鸭 茅斑 驳 病 毒 首 先 由 Ｍａ ｉｅ ｋｎ ｎ等 ［ 于 １ ９ ８ ９ ５年 发现 和 报 道 ， 随后 Ｒ ａ ｏ ｙ ｂ ｖ等［ 于 １ ９ ６ ９ ６年 再 次 分 离到 该 病 毒 ，Ｔｏｉａ 等 ［ 于 ２ ０ ｒ ｍａ ９ ｙ ０ ０年 也 对 该 病 毒 作 了报 道 ．但 到 目前 为 止 ，我 国 尚未 见 过 鸭 茅 斑
表 达．
梯度 离 心纯化 病 毒． 取 ３ Ｌ病 毒 提取 液 与 等 体 积 ０
简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程
简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程外源基因在原核系统中的克隆表达是通过一系列步骤来实现的。
以下是基本的流程：1. 选择质粒载体（Plasmid Vector）：-选择一个合适的质粒，通常是圆形DNA 分子，具有自主复制的能力。
质粒通常包含选择标记（例如抗生素抗性基因）和表达调控元件（例如启动子、终止子等）。
2. 准备目标基因：-获取外源基因，这可以是从其他生物中克隆得到的DNA 片段。
这个基因应该编码所需的蛋白质或RNA。
3. 限制性内切酶切割：-使用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因。
选择适当的酶，以确保两者切口相互兼容。
4. 连接（Ligation）：-将切割后的质粒和目标基因连接在一起，形成重组质粒。
这一步通常涉及DNA 连接酶。
5. 转化（Transformation）：-将重组质粒导入宿主细菌中。
这可以通过热激冲击、电穿孔或其他方法实现。
质粒包含抗生素抗性基因，使得只有带有重组质粒的细菌能够在含有抗生素的培养基中生长。
6. 筛选（Screening）：-鉴定带有正确重组质粒的细菌。
这可以通过PCR、酶切鉴定等技术来进行。
7. 培养：-将筛选出的正常克隆株培养起来，以增大其数量。
8. 表达：-利用宿主细菌的生物机制，使得外源基因在细菌中表达。
这通常涉及到适当的启动子和终止子，以及其他调控元件。
9. 纯化：-如有必要，对表达的蛋白质进行纯化。
这可以通过各种方法，如层析、电泳等来实现。
整个流程的成功依赖于实验室技术的熟练操作和对基因工程原理的深刻理解。
这些步骤的每一步都需要谨慎操作，以确保最终得到具有期望表达产物的克隆。
花生过敏原Ara h2.02的克隆、表达及免疫学鉴定
花生过敏原Ara h2.02的克隆、表达及免疫学鉴定易海涛;刘志刚;闫浩;刘芳;赵郭存;夏立新【期刊名称】《江西师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(034)005【摘要】通过提取花生总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆花生Ara h2.02基因,将反转录的基因连入pMD19-T Simple Vector,提质粒酶切鉴定并测序,将测序正确的片段连入原核表达载体pET-32a(+)上,并转入BL21(DE3)宿主表达菌中,IPTG诱导表达、Western-blotting检测该重组蛋白的免疫原性.测序结果表明:克隆的花生Ara h2.02基因片段全长为519 bp,编码为172个氨基酸,与GenBank 中蛋白序列100%相同.诱导表达后的蛋白经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符.Western-blotting结果表明该蛋白能与花生过敏病人混合血清中的IgE结合,具有免疫原性.成功克隆并表达了花生过敏原Ara h2.02,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性.【总页数】5页(P531-535)【作者】易海涛;刘志刚;闫浩;刘芳;赵郭存;夏立新【作者单位】深圳大学,医学院,过敏反应与免疫学研究所,广东,深圳,518060;深圳大学,医学院,过敏反应与免疫学研究所,广东,深圳,518060;深圳大学,医学院,过敏反应与免疫学研究所,广东,深圳,518060;深圳大学,医学院,过敏反应与免疫学研究所,广东,深圳,518060;深圳大学,医学院,过敏反应与免疫学研究所,广东,深圳,518060;深圳大学,医学院,过敏反应与免疫学研究所,广东,深圳,518060【正文语种】中文【中图分类】Q785【相关文献】1.花生过敏原蛋白Ara h 6基因克隆和原核表达 [J], 詹少德;邱昌将;朱盼;吴志华;陈红兵2.花生过敏原Ara h 8的克隆表达、纯化及免疫学鉴定 [J], 易海涛;刘志刚;刘芳;闫浩;汤慕瑾;肖小军;夏立新3.花生过敏原Ara h1蛋白的原核表达及致敏性分析 [J], 史云凤;张彤;陈沁4.粉尘螨过敏原Der f 35的克隆表达及免疫学鉴定 [J], 陈扬;陈献雄;欧阳春艳;钟永浩;刘晓宇5.花生主要过敏原Ara h 1线性B细胞表位的预测及鉴定 [J], 王俊娟;李欣芮;陈成;孙善峰;刘桂蓉;车会莲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人IL-1Ra基因的克隆及原核表达的研究
通过 Ｒ — Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ从人的胎盘组织 中克隆 了人 ，—Ｒ 基 因，使 其在大肠杆茵Ｄ ５ｔ Ｌ Ｉａ Ｈ ｃ中重组表 达。结果表 明，克隆到 了
４ ０ｂ ６ ｐ左右 的 目的基 因，并在 大肠杆 菌 中成 功表 达 了１ ｕ ８ｋ 左右的 目的蛋 白， 目的蛋 白在大肠杆 菌中表达量 占总
蛋 白 ２ ％左 右 ， 为 Ｉ－ Ｒ 的 进 一 步研 究及 应 用 奠 定 了基 础 。 ０ Ｌ１ａ 关 键 词 ：人 Ｉ— Ｒ ；基 因重 组 ；原核 表 达 Ｌ ｌａ
中图分类号 ：Ｑ ｏ ５３
文献标 志码 ：Ａ
文章编号：１０ — ３ ９ ２ １ ）３ ０４ — ５ ０ ５ ９ ６ （０ １０ — １０ ０
白 的表 达情 况 。 阴性 对 照 为在 同等 条 件 下 ３ ０℃培 养 的菌体 ，具体 制样过 程见 １１。 ．１
。
以上 连 接 体 系 １ ６℃反 应 ３ ｉ 转 化 ０ｍ ｎ后
（ 自Ｔａｇｎ 购 ｉ ｅ 博迈 德生物 ） ｎ ；其 他试 剂均 为 Ｓｇ ａ ｉｍ 公
司或 国产 分析纯 生化试 剂 。
１ Ｐ ． ４ ＣＲ引物
Ｘ １Ｂｕ 感受 态细菌 ，３ Ｌ 一 ｌｅ ７℃培养 过夜 。
１ 表达 质粒 的构建 ． ９
１１ 重组 蛋 白诱 导表 达 － Ｏ
根据 已报 道 的人 Ｉ～ Ｒ Ｌ １ ａ基 因序 列 ｇ： ２ ７ ｉ３ ５ ６的
成熟肽设 计 Ｐ Ｒ引物 ，引物 在 Ｉ酶切 位 点 ，３ 物 中导 人 Ｐｔ 吲 ｃ 吲 ｓ Ｉ 酶切位 点 （ 划线 部分 ） 。
３引 物 ：５Ｃ Ｇ Ａ Ｔ Ｃ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ Ｇ Ａ ’ ’Ｔ Ｃ Ｇ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｇ
人脑源性神经营养素-6基因的克隆及在原核细胞中的表达
人脑源性神经营养素-6基因的克隆及在原核细胞中的表达张承武;蔡青松;庄旭;翟朝阳;郑煜【期刊名称】《中华医学遗传学杂志》【年(卷),期】2002(019)006【摘要】目的克隆人脑源性神经营养素-6(neurotrophin-6,NT-6)基因,并观察其在大肠杆菌中的表达情况.方法从流产胎儿大脑皮层提取总RNA,用逆转录聚合酶链反应扩增得到人的NT-6基因cDNA片段;经酶切回收后克隆进pBK-CMV质粒,构建NT-6 的表达载体.通过诱导,使NT-6基因在大肠杆菌中表达.结果分离克隆了人脑源性NT-6基因,含该基因的大肠杆菌在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导的情况下,表达了特异性的蛋白质.结论人脑源性NT-6基因的克隆表达为进一步研究NT-6的结构、功能及临床应用奠定了基础.【总页数】4页(P475-478)【作者】张承武;蔡青松;庄旭;翟朝阳;郑煜【作者单位】610041,成都,四川大学华西基础医学与法医学院生理学教研室;610041,成都,四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室;610041,成都,四川大学华西基础医学与法医学院生理学教研室;610041,成都,四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室;610041,成都,四川大学华西基础医学与法医学院生理学教研室【正文语种】中文【中图分类】R394【相关文献】1.猪瘟病毒保护性抗原E2基因的克隆及在原核细胞中的表达2.人脑源性神经生长因子基因克隆及其在大肠杆菌中的表达3.生姜蛋白酶基因的克隆及在原核细胞中的表达4.人神经营养素-3基因的克隆、表达及其活性检测5.人源性神经营养素-6成熟肽基因融合表达载体的构建及表达产物的纯化因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
绿色木霉纤维素酶CBHI基因的克隆与原核表达
］ｕ ｎ ｌ ｏ ｈ ｎ ａ ｇ Ａ￣ｉｕ ｔｒｌＵｎｖ ｒｉ ， ０１ — ６， ３３ ： ６ — ６ ｏ ｒ ａ ｆ Ｓ ｅ ｙ ｎ ｒｃ ｌ ａ ｉｅｓｔ ２ ０ ４ （） ３ ６ ３ ９ ｕ ｙ ２
绿色木霉纤维素酶 Ｃ ＨＩ 因的克 隆与原核表达 Ｂ 基
任 大 明 毕 霏 ， ， 陈红 漫 ， 国仕 ， 阚 马 艳 ， 李艳 秋 ， 于可 济 ２
（． 阳农 业 大 学 生物 科 学技 术 学 院 ， 阳 １ ０６ ；２中 国农 业 大 学 食 品 科 学与 营 养 工 程 学 院 ， 京 １０ ８ ） １ 沈 沈 １１ １ ． 北 ０ ０ ３ 摘 要 ： 色 木 霉 （ ｒ ｈｄ 绿 Ｔｉ ｏｅ ｃ ｖｒ ｅ 所 产 生 纤 维 素 酶 可 将 秸 秆 天 然 纤 维 素 组 分 转 化 为 可 发 酵 的 糖 ， ｉｄ ） ｉ 不仅 对 废 物 进 行 再 利 用 ， 可 还
以减 少 环 境 污 染 。 以纤 维 素 酶 工 业 生 产 菌 株 绿 色木 霉 Ｓ 一 １６总 Ｒ Ａ 为模 板 ， 用 Ｒ — Ｃ ｎ９０ Ｎ 利 Ｔ Ｐ Ｒ技 术 反 转 录合 成 外 切 葡 聚糖 水 解 酶 （Ｂ Ｉ Ｃ Ｈ ）基 因 约 １４ ｂ ５ ５ ｐ的 ｃ Ｎ 片 段 。该 序 列 与 Ｇ ｎ ａ ｋ中 的 ｃｈ ０ ３９序 列 比较 ，氨 基 酸 序 列 同源 性 达 ９ ％。 大 肠 杆 菌 ＤＡ ｅＢｎ ｂ ｌＥ ０ ８ １ Ｂ ２１ 核 表 达 和 Ｓ Ｓ Ｐ Ｇ Ｌ 原 Ｄ — Ａ Ｅ结 果 表 明 ， 组 蛋 白分 子 量 约 为 ５ｋ ａ 重 组 酶 活 力 为 ５ Ｕ・ ～ 重 ３Ｄ ， ． ｍｇ 。 ３
原核表达的详细步骤
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。
只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。
做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。
（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
（三）获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项原核表达操作步骤及注意事项发布时间： 2019-06-03 新闻来源：将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点) ；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB 培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR 方法：用TRIzol 法从细胞或组织中提取总RNA ，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。
2、PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。
基因工程中的基因克隆与表达
基因工程中的基因克隆与表达基因工程是一门涉及分子生物学、遗传学、生物化学等多个学科的综合性科学。
其中，基因克隆和基因表达是基因工程研究的两个重要方面。
本文将就基因克隆和基因表达的原理、方法及应用进行探讨。
一、基因克隆1.原理基因克隆是指将目标基因从其天然基因组或其他来源中分离出来，并将其插入到另一个载体（如质粒）中，使其能够在宿主细胞内复制和表达。
基因克隆的原理是基于DNA序列特异性杂交的方法，利用限制性内切酶切割目标DNA和载体DNA，然后将它们黏合在一起，形成重组DNA。
通过转形或感染，使重组DNA 进入宿主细胞内，并复制和表达。
2.方法基因克隆的方法主要有限制性酶切与黏合（RE-Mediated Ligation）、PCR（聚合酶链反应）、TA克隆和基因文库等。
限制性酶切与黏合是一种常用的基因克隆方法。
该方法利用限制性内切酶切割DNA，然后通过T4 DNA连接酶黏合在一起。
这种方法操作简单、效率高，但存在限制内切酶的局限性，无法应用于不同酶切位点的DNA。
PCR是用于复制DNA片段的重要方法，也可以用于基因克隆。
PCR方法可以在不使用限制酶的情况下，从任何源提取DNA片段，扩增需要的基因段，并使用酶切和连接技术插入到载体中。
TA克隆是指用于从PCR产物中克隆DNA的一种方法。
该方法利用了Taq聚合酶不完全特异性合成3'-末端斜伸的性质，使产生的末端序列与T自带的A进行互补配对，从而使PCR产物能够被直接连接到TA克隆载体上。
基因文库是一种重要的基因克隆技术，可以将许多目标基因同时克隆入同一载体中。
基因文库分为cDNA文库和基因组文库。
通过荧光筛选或选择性培养，可以从文库中筛选出感兴趣的基因。
3.应用基因克隆技术广泛应用于基因工程、疫苗制备、药物研发、作物改良、动物遗传改良、环境污染治理等领域。
例如，利用基因克隆技术可以创造出超级细菌、工业用酶、新型药物、高产优质作物等。
二、基因表达1.原理基因表达是指基因通过转录和翻译的过程，将DNA序列转化为蛋白质的过程。
IL-1β的基因克隆及在原核中的表达
图0
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后在 -Q)*+. 处出现一条新蛋白质条带， 证实为重组蛋白 （图 6） 。薄层扫描分析表明， 重 组蛋白的含量约占菌体总蛋的 R(S 。 !"+ 重组蛋白的分离纯化 将菌体超声破菌后， 发现重组蛋白为胞内可溶性表达， 离 N.N%&#OP 分析上清和沉淀， 心收集上清液。由于大肠杆菌内多为酸性蛋白， 而 /K%的等电点为 左右， 因此我 1/M)* " 们将超声破菌后上清调 15 值至 *)Q， 用 ’T%>=1GB<D>=88 柱进行纯化， 大部分杂蛋白不被吸 附而穿过， 目的蛋白被吸附在柱上， 用 -JD@0K "B’@ 溶液梯度洗脱， 约在 ()6JD@0K "B’@ 浓度 时， 目的蛋白被洗脱下来。将洗脱样品用 O4* F9I= 柱脱盐后， 再用 .P#P%N=1GB<D>=88 柱做 进一步纯化， 流动相选择 15M)( 的 ()(4JD@0K $<9>%5’@ 缓冲液， 在这种 15 状态下， /K%"不 被吸附而穿过， 收集穿过峰样品， 在 -Q)*+. 左右明显可见目的蛋白条带 N.N%&#OP 分析， （图 R） ， 经扫描分析， 纯度大于 UQS 。
基因克隆原核表达
=1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
26
（三）转化—Cacl2法、电击法
（四）重组子的筛选及鉴定
1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
原位杂交
2、鉴定：
• 长度鉴定：酶切、PCR
• 方向鉴定：联合酶切
• 测序
27
原核基因表达系统
57
主要元件：强启动子 SD： ATG：第一个密码子
58
非融合型表达载体----pPL-Lamda
PL启动子---温度 诱导 插入位点--HpaI
59
（三）分泌型表达载体： 1、主要元件： 启动子和SD序列 信号肽序列 ：SD下游，编码信号肽， 可引导蛋白跨膜 2、优点：分泌表达，避免降解。
60
分泌型表达载体----pINIII-ompA1
61
分泌型融合表达载体----pEZZ18
62
五．提高表达水平的手段 1、选择合适载体 • 强启动子----提高转录水平 • 核糖体结合位点（ATG---SD） • 避免产物降解 ：分泌/融合表达
细菌蛋白酶抑制剂
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2、选择合适宿主 Lac 启动子----LacI菌 PL/PR -------- CI857 溶源菌
➢基因克隆(gene clonging) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
1
基因克 隆 Gene Cloning
2
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
3
一、概 述
4
1973年Cohen完成第一个基因工程实验 经体外重组获得杂合DNA 杂合子转化入大肠杆菌
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（二）体外重组
连接体系的建立：
• 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数 =1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
（三）转化—Cacl2法、电击法
（四）重组子的筛选及鉴定
1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
原位杂交 2、鉴定：• 长度 Nhomakorabea定：酶切、PC、不同组织的cDNA不相同• 基因总量少，易筛选
4、PCR扩增目的基因片段
• 适用于克隆序列清楚的基因
• 以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩 增较难 • 多采用以mRNA为模板的RT-PCR法
5、人工合成较短的DNA 6、差异显示法(differential display, DD)—筛选差异表达的基因
位相载体----含有3种读码框的系列载体
3、优点：
• 表达效率高
• 产物稳定
• 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可 鉴定 • 易纯化：利用融合原核多肽的特性
融合型载体----pGEX系列
Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白—直接纯化 产物切割方便：
pGEX-1T—凝血酶
pGEX-2T---凝血酶
二．原核生物基因结构和表达特点
1. 原核生物染色体DNA是裸露的环 形DNA，其转录和翻译是偶联的 连续进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
多顺反子mRNA（polycistronic mRNA）：即可作为两个或多个肽链翻 译模板的mRNA
EcoRI BamHI
----ATG ---- AAC CTG GAA TTC CTA GGT ------TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA---
DNA序列
AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT
TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA
5、原核生物中参与转录的基因结 构： • 启动子
•
终止子
启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合 酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA序列。
• 一般长40-60bp，富含A-T硷基对
• 共有保守序列：
-10区（pribnow box）：TATAAT
-35区：
• RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录
• 各种启动子启动转录能力不同。
• 启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间 隔序列
终止子（terminator，T）:位于基因3’ 端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序 列
•富含GC的反向重复序列
•富含AT的序列
转录形成发夹 式结构
6、与转译有关的原核细胞结构：—— 核糖体结合位点
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
4、原核生物中功能相关的基因串联在一 起，形成操纵子。
操纵子（operon）：是一组功能上相 关，受同一调控区控制的基因组成的 一个遗传单位
• 原核生物基因表达的基本单位（即一 个转录单位）。 • 共同协调作用，完成某一多肽的表达 调控。 • 包括：调控区(调节基因，启动基因， 操作基因)、 结构基因：
6、差异显示
1、直接物的基因组DNA切割成一定大小 的片段，并与合适的载体重组后导 入宿主细胞，进行克隆。这些存在 于所有重组、人工接头连接
人工接头：人工合成含有酶切位点的寡 核苷酸片段
4、T-A克隆
• T-vector两条链的5’端含有一个游 离的T • PCR过程中，增加延伸时间，Taq酶 可在产物的3’端多加一个A
五、基因克隆的工作流程 （一）目的基转译起始密码子AUG SD顺序（shine-dalgarno）：
•
• •
AUG上游3-11 bp
长约3-9bp mRNA与30s核糖体亚基间的识别与 结合序列
三．外源基因在原核表达系统中表达 的必要条件：
1.
2. 3. 4.
删除内含子和5’非编码区
外源基因置于强启动子和SD顺序控制 下 维持正确开放阅读框架（ORF） mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋 白质不被降解
所需元件：
限制性内切酶
连接酶
载体
受体细胞
基因克隆（分子克隆molecullar cloning）----通过体外重组技术,将一 段目的DNA经切割、连接插入适当载 体，并导入受体细胞，扩增形成大量 子代分子的过程。
基因克隆的核心-----体外重组 (Recombination) : 人工将一段目的 DNA插入一个载体的过程。
pGEX-3T---X因子
位相载体
（二）非融合型表达载体
Foreign DNA
P
SD
非融合型表达载体
非融合基因
主要元件：强启动子
SD：
ATG：第一个密码子
非融合型表达载体----pPL-Lamda
PL启动子---温度 诱导
插入位点--HpaI
（三）分泌型表达载体： 1、主要元件： 启动子和SD序列
2、基因剂量：
3、核糖体结合位点：
• SD顺序与16srRNA3’末端互补程度。
•
•
AUG—SD间距离。
AUG后的核苷酸
四．原核表达载体： 适用于在原核细胞 中表达外源基因的载体。
• 主要元件：强启动子
SD顺序 筛选标志
其它调控基因
• 类型：
融合型表达载体：----融合蛋白
非融合型表达载体：---天然完整蛋白
信号肽序列 ：SD下游，编码信号肽， 可引导蛋白跨膜 2、优点：分泌表达，避免降解。
分泌型表达载体----pINIII-ompA1
分泌型融合表达载体----pEZZ18
五．提高表达水平的手段 1、选择合适载体 • 强启动子----提高转录水平
• 核糖体结合位点（ATG---SD）
• 避免产物降解 ：分泌/融合表达 细菌蛋白酶抑制剂
• 方向鉴定：联合酶切
• 测序
原核基因表达系统
一．表达系统：
基因工程中用来获得有功能的异源蛋白 质的体系，包括克隆载体，表达载体及 受体细胞。
据受体细胞的不同可分为： 1．原核表达载体系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原 核细胞中以发酵形式快速高效地表达、 合成基因产物的体系。
2．真核表达系统：使外源基因在真核细 胞中表达的体系。
基因的克隆与表达
山东大学医学院免疫学研究所 马春红
基因克隆(gene clonging)
基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基 因 克 隆
Gene Cloning
概述
克隆载体
受体细胞 体外重组的策略
基因克隆工作流程
一、概 述
1973年Cohen完成第一个基因工程实验 经体外重组获得杂合DNA 杂合子转化入大肠杆菌
•构建流程 抽提基因组DNA 鸟枪法制备DNA片段 DNA片段与载体重组
转化宿主菌
筛选目的基因（核酸探针法、 免疫结合法）
• 特点及应用：
包含所有遗传信息
构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）
筛选难度大
用于研究基因plementary DNA library)以组织细胞中的mRNA为模板， 反转录合成双链cDNA ，各cDNA分子 分别插入载体形成重组子，再导入宿 主细胞克隆扩增。这 启动子----LacI菌
PL/PR
-------- CI857
溶源菌
3、诱导表达
温度诱导------PL/PR
IPTG的化学诱导----Plac、Ptac
六．表达产物的检测： 1、特异性鉴定： • 荧光抗体法
• 免疫沉淀法
• 免疫印迹法 • ELISA 2、生物学活性鉴定
1、粘末端连接
1）全同源粘末端连接
• 最方便简单
• 高背景-载体自身环化 • 双向插入
2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
• 粘-粘连接：最有效、最快捷
• 粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有 一个相同酶切位点，可将另一末端补平
2、平末端连接： • 酶切点为平末端或任何两个末端补平 的DNA • 效率低，酶用量大
分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌 至胞周间隙
（一）融合型表达载体
Foreign DNA
P
SD
融合型表达载体
融合基因
1、主要元件：强启动子
SD
原核基因3’端
2、技术关键：克隆基因插入原核序列 近3’端而维持正确阅读框架。 • 选择合适酶切位点：
• 加人工合成的DNA接头
• 构建位相载体
载体部分序列
基因克隆的技术路线 目的基因 载体
体外重组
重组子（杂合DNA）
转化
受体细胞 筛选阳性克隆
大量扩增，获得子代DNA
二、克隆载体
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是重 组体扩增的场所。 2、要求：易于接纳外源DNA 无特异的内源性核酸内切酶
载体复制、扩增不受阻
与载体有互补性
四、体外重组的策略
四．影响外源基因在原核细胞中表 达效率的因素：
1、启动子：建立表达载体时，选择强 启动子。
常见原核强启动子：
• Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的 诱导 • Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。
• Ptac :Lac启动子和Trp启动子的杂合启 动子。 • PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启 动子，受λ噬菌体CI基因负调控。温度 诱导。