基因克隆原核表达-2002

位相载体----含有3种读码框的系列载体
3、优点：
• 表达效率高
• 产物稳定
• 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可 鉴定 • 易纯化：利用融合原核多肽的特性
融合型载体----pGEX系列
Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白—直接纯化 产物切割方便：
pGEX-1T—凝血酶
pGEX-2T---凝血酶
6、差异显示
1、直接分离DNA—适用于克隆原核生物的 基因组文库
2、构建基因组文库，筛选目的基因 • 基因组文库(gene library)：将某 种生物的基因组DNA切割成一定大小 的片段，并与合适的载体重组后导 入宿主细胞，进行克隆。这些存在 于所有重组体内的基因组DNA片段的 集合，即基因组文库，它包含了该 生物的所有基因。
二．原核生物基因结构和表达特点
1. 原核生物染色体DNA是裸露的环 形DNA，其转录和翻译是偶联的 连续进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
多顺反子mRNA（polycistronic mRNA）：即可作为两个或多个肽链翻 译模板的mRNA
• 各种启动子启动转录能力不同。
• 启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间 隔序列
终止子（terminator，T）:位于基因3’ 端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序 列
•富含GC的反向重复序列
•富含AT的序列
转录形成发夹 式结构
6、与转译有关的原核细胞结构：—— 核糖体结合位点
•构建流程 抽提基因组DNA 鸟枪法制备DNA片段 DNA片段与载体重组
转化宿主菌
筛选目的基因（核酸探针法、 免疫结合法）
• 特点及应用：
包含所有遗传信息
构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）
筛选难度大
用于研究基因在基因组中的情况
3、构建cDNA文库，筛选目的基因 • cDNA文库(complementary DNA library)以组织细胞中的mRNA为模板， 反转录合成双链cDNA ，各cDNA分子 分别插入载体形成重组子，再导入宿 主细胞克隆扩增。这些在重组体内的 cDNA的集合即cDNA文库。
2、选择合适宿主
Lac 启动子----LacI菌
PL/PR
-------- CI857
溶源菌
3、诱导表达
温度诱导------PL/PR
IPTG的化学诱导----Plac、Ptac
六．表达产物的检测： 1、特异性鉴定： • 荧光抗体法
• 免疫沉淀法
• 免疫印迹法 • ELISA 2、生物学活性鉴定
pGEX-3T---X因子
位相载体
（二）非融合型表达载体
Foreign DNA
P
SD
非融合型表达载体
非融合基因
主要元件：强启动子
SD：
ATG：第一个密码子
非融合型表达载体----pPL-Lamda
PL启动子---温度 诱导
插入位点--HpaI
（三）分泌型表达载体： 1、主要元件： 启动子和SD序列
（二）体外重组
连接体系的建立：
• 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数 =1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
（三）转化—Cacl2法、电击法
（四）重组子的筛选及鉴定
1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
原位杂交 2、鉴定：
• 长度鉴定：酶切、PCR
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
4、原核生物中功能相关的基因串联在一 起，形成操纵子。
操纵子（operon）：是一组功能上相 关，受同一调控区控制的基因组成的 一个遗传单位
• 原核生物基因表达的基本单位（即一 个转录单位）。 • 共同协调作用，完成某一多肽的表达 调控。 • 包括：调控区(调节基因，启动基因， 操作基因)、 结构基因：
5、原核生物中参与转录的基因结 构： • 启动子
•
终止子
启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合 酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA序列。
• 一般长40-60bp，富含A-T硷基对
• 共有保守序列：
-10区（pribnow box）：TATAAT
-35区：
• RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录
• cDNA文库仅包含正在表达的基因
• 不同物种、不同组织的cDNA文库不相同
• 基因总量少，易筛选
4、PCR扩增目的基因片段
• 适用于克隆序列清楚的基因
• 以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩 增较难 • 多采用以mRNA为模板的RT-PCR法
5、人工合成较短的DNA 6、差异显示法(differential display, DD)—筛选差异表达的基因
1、粘末端连接
1）全同源粘末端连接
• 最方便简单
• 高背景-载体自身环化 • 双向插入
2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
• 粘-粘连接：最有效、最快捷
• 粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有 一个相同酶切位点，可将另一末端补平
2、平末端连接： • 酶切点为平末端或任何两个末端补平 的DNA • 效率低，酶用量大
信号肽序列 ：SD下游，编码信号肽， 可引导蛋白跨膜 2、优点：分泌表达，避免降解。
分泌型表达载体----pINIII-ompA1
分泌型融合表达载体----pEZZ18
五．提高表达水平的手段 1、选择合适载体 • 强启动子----提高转录水平
• 核糖体结合位点（ATG---SD）
• 避免产物降解 ：分泌/融合表达 细菌蛋白酶抑制剂
2、基因剂量：
3、核糖体结合位点：
• SD顺序与16srRNA3’末端互补程度。
•
•
AUG—SD间距离。
AUG后的核苷酸
四．原核表达载体： 适用于在原核细胞 中表达外源基因的载体。
• 主要元件：强启动子
SD顺序 筛选标志
其它调控基因
• 类型：
融合型表达载体：----融合蛋白
非融合型表达载体：---天然完整蛋白
• 方向鉴定：联合酶切
• 测序
原核基因表达系统
一．表达系统：
基因工程中用来获得有功能的异源蛋白 质的体系，包括克隆载体，表达载体及 受体细胞。
据受体细胞的不同可分为： 1．原核表达载体系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原 核细胞中以发酵形式快速高效地表达、 合成基因产物的体系。
2．真核表达系统：使外源基因在真核细 胞中表达的体系。
分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌 至胞周间隙
（一）融合型表达载体
Foreign DNA
P
SD
融合型表达载体
融合基因
1、主要元件：强启动子
SD
原核基因3’端
2、技术关键：克隆基因插入原核序列 近3’端而维持正确阅读框架。 • 选择合适酶切位点：
• 加人工合成的DNA接头
• 构建位相载体
载体部分序列
转译起始密码子AUG SD顺序（shine-dalgarno）：
•
• •
AUG上游3-11 bp
长约3-9bp mRNA与30s核糖体亚基间的识别与 结合序列
三．外源基因在原核表达系统中表达 的必要条件：
1.
2. 3. 4.
删除内含子和5’非编码区
外源基因置于强启动子和SD顺序控制 下 维持正确开放阅读框架（ORF） mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋 白质不被降解
3、人工接头连接
人工接头：人工合成含有酶切位点的寡 核苷酸片段
4、T-A克隆
• T-vector两条链的5’端含有一个游 离的T • PCR过程中，增加延伸时间，Taq酶 可在产物的3’端多加一个A
五、基因克隆的工作流程 （一）目的基因的获得 1、直接分离 3、构建cDNA文库 4、PCR
5、人工合成
基因的克隆与表达
山东大学医学院免疫学研究所 马春红
基因克隆(gene clonging)
基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基 因 克 隆
Gene Cloning
概述
克隆载体
受体细胞 体外重组的策略
基因克隆工作流程
一、概 述
1973年Cohen完成第一个基因工程实验 经体外重组获得杂合DNA 杂合子转化入大肠杆菌
EcoRI BamHI
----ATG ---- AAC CTG GAA TTC CTA GGT ------TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA---
DNA序列
AAT CBaidu NhomakorabeaG AAG AAT TCA GAC CTA GGT
TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA
四．影响外源基因在原核细胞中表 达效率的因素：
1、启动子：建立表达载体时，选择强 启动子。
常见原核强启动子：
• Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的 诱导 • Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。
• Ptac :Lac启动子和Trp启动子的杂合启 动子。 • PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启 动子，受λ噬菌体CI基因负调控。温度 诱导。
基因克隆的技术路线 目的基因 载体
体外重组
重组子（杂合DNA）
转化
受体细胞 筛选阳性克隆
大量扩增，获得子代DNA
二、克隆载体
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是重 组体扩增的场所。 2、要求：易于接纳外源DNA 无特异的内源性核酸内切酶
载体复制、扩增不受阻
与载体有互补性
四、体外重组的策略
所需元件：
限制性内切酶
连接酶
载体
受体细胞
基因克隆（分子克隆molecullar cloning）----通过体外重组技术,将一 段目的DNA经切割、连接插入适当载 体，并导入受体细胞，扩增形成大量 子代分子的过程。
基因克隆的核心-----体外重组 (Recombination) : 人工将一段目的 DNA插入一个载体的过程。