病人血液样本收集实验方案

病人血液样本收集实验方案
1、实验目的：检测病人发病期（重症期）和恢复期血清中FGF2蛋白表达，同时，
分离病人血液中PBMC，检测FGF2基因水平表达，以寻找FGF2的表达与病人发病和预后的相关关系。

2、病人血液留取时间：发病期（重症期），发病期转恢复期（有明显好转），恢
复期（出院前），以上三个时间各取一管血，需要用紫头管（血常规管）取3-5ml，并且病人信息与血液要对应
3、实验材料和仪器：
①超净工作台，离心机
②一次性吸管（无菌，或者是无菌的玻璃吸管），加样枪，加样枪配套枪头（无
菌），试管，1.5ml EP管（RNase free）
③生理盐水（或者注射用生理盐水），红细胞裂解液，Trizol
4、实验步骤：
1、血清的分离：将病人血液置于离心机内500g离心5min，用无菌的吸管将
病人血清吸至1.5ml EP管内，标记，置于-80℃保存。

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2、PBMC分离：
1、病人血清吸取后，向下层的血细胞中加入4-5ml红细胞裂解液，吹打
混匀，室温或者4℃裂解3min，此时红细胞会被裂解，置于离心机中
500g离心5min。

2、弃去上层液体（破碎的红细胞），加入5ml生理盐水（或者是注射用生
理盐水），将底层的细胞重悬混匀，500g离心5min。

3、重复步骤2
4、离心完毕后，能在管底观察到白色的细胞团，若还混有红细胞，加入
2ml红细胞裂解液，室温或4℃裂解2min，500g离心5min，并且重复
步骤2,3.
5、弃去上层液体，用1ml Trizol将管底的白细胞（PBMC）吹打混匀，并
转移至1.5ml EP管内，标记，室温裂解5-10min，置于-80℃保存。

血PBMC标提取方法
紫色收集管：抗凝血，收集血浆黄色收集管：促凝血，收集血清抗凝血
1、首先将抗凝管上的病人信息登记至记录本上，住院号、姓名、（主要针对HCC病人）。

2、抗凝血进行离心，3000rpm,10min. 将上清即血浆（OP），每管分装500ul
到2ml EP管，标记样本编号（住院号、样品类别），放置-80度冰箱保存。

注意：10ml抗凝管里留约0.5ml上清，避免将血细胞和淋巴细胞吸出，污染血浆（OP）。

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3、往抗凝管中补加PBS（或生理盐水）至满约12.5ml，用3ml滴管吹打，充分混匀。

4、（一管血对应提两管淋巴细胞）取2支15ml离心管，分别加3ml淋巴细胞分离液。

5、向每支离心管中，淋巴细胞分离液层上加步骤4中用PBS（或生理盐水）稀释液并充分混匀后的血样约6ml，（这一步操作一定要小心：管壁倾斜，将血沿管壁轻缓加入，保证淋巴分离液和血样的界面清晰，不能将血与淋巴细胞分离液相混）。

6、室温25℃，离心400g,30min，可见分层。

分为四层，最上层为黄色是稀释血浆，接下来是目的层，为白色云雾状淋巴细胞层，接下来是一个白色的粒细胞层，最下面是血细胞。

7、每管小心吸取中间白色云雾状单个核细胞
8、约1ml，加至2mlEP管中。

9、加入等量的PBS（或生理盐水），上下颠倒混匀，离心1500rpm，10min，弃上清留下白色的沉淀，获得单个核细胞沉淀，为OB, 标记样本编号（住院号、样品类别）。

10、加入1mlPBS（或生理盐水）,用枪轻轻吹打混匀，再次离心，1500 rpm，10min，弃上清留下白色的沉淀。

11、加入200uLPBS（或生理盐水）,用枪轻轻吹打混匀，均分为两个EP管（100Ul/管），加入流式抗体1.5uL，室温避光孵育30min。

12、如果当天能上机流式：再加入1ml PBS（或生理盐水）,用枪轻轻吹打混匀，离心，1500rpm，10min，弃上清留下白色的沉淀；加入300uLPBS（或生理盐水）,用枪轻轻吹打混匀，避光上机。

13、如果当天不能上机：再加入1ml PBS（或生理盐水）,用枪轻轻吹打混匀，离心，1500rpm，10min，弃上清留下白色的沉淀；加入300uL1%多聚甲醛,用枪轻轻吹打混匀，避光保存（固定），第二天上机。