《生物技术概论》课程总复习
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5
基因工程中常用的工具酶
1.限制性内切酶 2.连接酶 3.末端修饰酶
基因工程中主要的工具酶有哪些，他们的作用 是什么？
6
限制性内切酶的命名
• 1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统， 命名原则如下：
• 由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 • 1、用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成
绪论
❖生物工程的定义 ❖ 技术手段（种类）
1
基因工程
(一) 理论上的三大发现 • 1、基因的载体是DNA • 2、DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制 • 3、分子遗传的中心法则
2
•DNA在复制过程中碱基间的氢键首先断裂， 双螺旋解旋分开，每条链分别作模板合成新 链，每个子代DNA的一条链来自亲代，另一 条则是新合成的，故称之为半保留复制。
3个字母的略语表示寄主菌的物种名。
• 2、用一个大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR
• 3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与 修复系统，用罗马字母表示分离到的第几个。如
EcoR I，EcoR V。
7
黏性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切 口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间碱基 正好互补配对。（5’粘性和3’粘性）
具称为载体。
作为基因克隆载体一般应具备的条件：
(1)能稳定复制，目的基因的插入基本不影响载体的复制能力 (2)应具有一个以上的单一限制酶位点，以便目的基因插入 (3)具有某些容易检测的遗传标记. (4)插入基因的幅度较宽 (5)分子量小、拷贝数高 (6) 从生物防护角度是安全的
9
载体类型
质粒是细胞中染色体外的能自主复制、裸露的小型环 状DNA分子，广泛存在于细菌之中，在某些蓝藻、绿 藻和真菌细胞中也存在质粒。
4
基因工程的基本过程
1.目的基因的制备。供体基因组DNA的分离和目的基因的 获得（切）
2. 载体的选择与制备 （切） 3. 目的基因与载体的连接，形成重组子（接） 4. 将重组DNA分子导入受体（转） 5. 培养已转化细胞，使目的基因在其中进行复制、扩增，
并将其整合到受体细胞的基因组中（增） 6. 重组子的筛选与鉴定。（筛、检）
•遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给 蛋白质的转录和翻译的过程，以及遗传信息 从DNA传递给DNA的复制过程。这是所有有细 胞结构的生物所遵循的中心法则
3
基因工程是指将一种生物体（供体）的 基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另 一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿 稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外 操作程序，也称为分子克隆技术。
12
目的基因片段的获取 获得目的基因的途径
化学合成法； 基因组文库或cDNA文库法； PCR法；
13
将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小适合 的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接， 引入相应的寄主细胞中保存和扩增。理论上讲，这 些重组载体上带有了该生物的全部基因，成为基因
组文库。
由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载 体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就 叫做这种生物的cDNA文库
14
cDNA文库的构建步骤：
第一步 分离总RNA ,然后从总RNA中分离出 mRNA部分， 约占细胞总RNA的1％-2％。 第二步 以mRNA为模板，经过逆转录合成第一条cDNA。 第三步 将mRNA-cDNA杂交分子转变为双链cDNA分子 第四步 将合成的双链cDNA重组到质粒载体或噬菌体上 第五步 将重组分子转入大肠杆菌主细胞中进行增殖。
柯斯质粒特点 • 1）具λ噬菌体特点 • 2）具有质粒DNA的特性 • 3）高容量的克隆能力，用于构建基因组文库 • 4）具有与同源序列的质粒重组的能力。
11ຫໍສະໝຸດ Baidu
克隆载体：可携带插入的外源DNA片段并可转入受 体细胞中大量扩增的DNA分子。该分子中含有能够 在受体细胞中自主复制的序列和筛选标记，常用于 外源基因的克隆，如噬菌体或质粒。 表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达 元件（如启动子、终止子等），使目的基因能够表 达的载体。
15
PCR基本过程（反应步骤）：
①模板DNA的变性：95℃
②模板DNA与引物的退火(复性)：60 ℃ ③引物的延伸：72 ℃
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留 复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成 一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放 大几百万倍。 电泳
16
PCR反应五要素
• 引物（primer）:长度 ，GC比例，结构 • 酶 （Taq DNA polymerase）：浓度 • dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP）：浓度 • 模板 （template） ：SDS,蛋白酶K • Mg2+ （magnesium）：能与dNTP结合
17
18
重组子的筛选
筛选方法： 根据载体选择标记基因筛选 LacZ基因的突变体M15质粒（缺失氨基酸残基11到41）是没 有野生型lacZ基因产物那种分解X-gal能力的。但如果在M15 突变体的抽取物中加入β-半乳糖苷酶的第3至第92氨基酸残 基的肽段（α肽）则能恢复M15分解X-gal，而显示蓝色的能 力。这样一种基因内互补现象称做α互补
在λDNA双链分子的两个5’ 端各有12个核苷酸单链的 互补粘性末端，且两者的核苷酸序列互补，当λ噬菌 体感染宿主细胞后，其DNA可迅速通过粘性末端配对 而成双链环状DNA分子，这种由粘性末端结合形成的 双链区域称为cos位点。
10
柯斯质粒，是一类由人工构建的含有λ DNA的 cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。
目的基因导入受体细胞
方法：
转化：通过生物学、物理学和化学等方法使外源裸露 DNA进入受体细胞，并整合到受体染色体组，在受体 内稳定维持和表达的过程。
转染：如果进入受体细胞的外源DNA分子是病毒（噬 菌体）的DNA,则把此过程称为转染。
转导：通过噬菌体（病毒）颗粒感染，把DNA导入被 感染的受体细胞的过程。
平末端：当限制酶从识别序列的中心轴线处 切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整 的
回文结构序列是一种旋转对称结构，在轴的 两侧序列相同而反向。有对称轴 ； 是自我 互补的序列 ； 两条链从 5 ‘ 到 3 ‘方向的 序列一致 ； 是 II 类限制酶的识别序列
8
基因工程中常用的载体
基因克隆载体的概念：将外源DNA携带进入受体细胞的工
基因工程中常用的工具酶
1.限制性内切酶 2.连接酶 3.末端修饰酶
基因工程中主要的工具酶有哪些，他们的作用 是什么？
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限制性内切酶的命名
• 1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统， 命名原则如下：
• 由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 • 1、用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成
绪论
❖生物工程的定义 ❖ 技术手段（种类）
1
基因工程
(一) 理论上的三大发现 • 1、基因的载体是DNA • 2、DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制 • 3、分子遗传的中心法则
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•DNA在复制过程中碱基间的氢键首先断裂， 双螺旋解旋分开，每条链分别作模板合成新 链，每个子代DNA的一条链来自亲代，另一 条则是新合成的，故称之为半保留复制。
3个字母的略语表示寄主菌的物种名。
• 2、用一个大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR
• 3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与 修复系统，用罗马字母表示分离到的第几个。如
EcoR I，EcoR V。
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黏性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切 口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间碱基 正好互补配对。（5’粘性和3’粘性）
具称为载体。
作为基因克隆载体一般应具备的条件：
(1)能稳定复制，目的基因的插入基本不影响载体的复制能力 (2)应具有一个以上的单一限制酶位点，以便目的基因插入 (3)具有某些容易检测的遗传标记. (4)插入基因的幅度较宽 (5)分子量小、拷贝数高 (6) 从生物防护角度是安全的
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载体类型
质粒是细胞中染色体外的能自主复制、裸露的小型环 状DNA分子，广泛存在于细菌之中，在某些蓝藻、绿 藻和真菌细胞中也存在质粒。
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基因工程的基本过程
1.目的基因的制备。供体基因组DNA的分离和目的基因的 获得（切）
2. 载体的选择与制备 （切） 3. 目的基因与载体的连接，形成重组子（接） 4. 将重组DNA分子导入受体（转） 5. 培养已转化细胞，使目的基因在其中进行复制、扩增，
并将其整合到受体细胞的基因组中（增） 6. 重组子的筛选与鉴定。（筛、检）
•遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给 蛋白质的转录和翻译的过程，以及遗传信息 从DNA传递给DNA的复制过程。这是所有有细 胞结构的生物所遵循的中心法则
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基因工程是指将一种生物体（供体）的 基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另 一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿 稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外 操作程序，也称为分子克隆技术。
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目的基因片段的获取 获得目的基因的途径
化学合成法； 基因组文库或cDNA文库法； PCR法；
13
将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小适合 的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接， 引入相应的寄主细胞中保存和扩增。理论上讲，这 些重组载体上带有了该生物的全部基因，成为基因
组文库。
由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载 体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就 叫做这种生物的cDNA文库
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cDNA文库的构建步骤：
第一步 分离总RNA ,然后从总RNA中分离出 mRNA部分， 约占细胞总RNA的1％-2％。 第二步 以mRNA为模板，经过逆转录合成第一条cDNA。 第三步 将mRNA-cDNA杂交分子转变为双链cDNA分子 第四步 将合成的双链cDNA重组到质粒载体或噬菌体上 第五步 将重组分子转入大肠杆菌主细胞中进行增殖。
柯斯质粒特点 • 1）具λ噬菌体特点 • 2）具有质粒DNA的特性 • 3）高容量的克隆能力，用于构建基因组文库 • 4）具有与同源序列的质粒重组的能力。
11ຫໍສະໝຸດ Baidu
克隆载体：可携带插入的外源DNA片段并可转入受 体细胞中大量扩增的DNA分子。该分子中含有能够 在受体细胞中自主复制的序列和筛选标记，常用于 外源基因的克隆，如噬菌体或质粒。 表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达 元件（如启动子、终止子等），使目的基因能够表 达的载体。
15
PCR基本过程（反应步骤）：
①模板DNA的变性：95℃
②模板DNA与引物的退火(复性)：60 ℃ ③引物的延伸：72 ℃
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留 复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成 一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放 大几百万倍。 电泳
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PCR反应五要素
• 引物（primer）:长度 ，GC比例，结构 • 酶 （Taq DNA polymerase）：浓度 • dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP）：浓度 • 模板 （template） ：SDS,蛋白酶K • Mg2+ （magnesium）：能与dNTP结合
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重组子的筛选
筛选方法： 根据载体选择标记基因筛选 LacZ基因的突变体M15质粒（缺失氨基酸残基11到41）是没 有野生型lacZ基因产物那种分解X-gal能力的。但如果在M15 突变体的抽取物中加入β-半乳糖苷酶的第3至第92氨基酸残 基的肽段（α肽）则能恢复M15分解X-gal，而显示蓝色的能 力。这样一种基因内互补现象称做α互补
在λDNA双链分子的两个5’ 端各有12个核苷酸单链的 互补粘性末端，且两者的核苷酸序列互补，当λ噬菌 体感染宿主细胞后，其DNA可迅速通过粘性末端配对 而成双链环状DNA分子，这种由粘性末端结合形成的 双链区域称为cos位点。
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柯斯质粒，是一类由人工构建的含有λ DNA的 cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。
目的基因导入受体细胞
方法：
转化：通过生物学、物理学和化学等方法使外源裸露 DNA进入受体细胞，并整合到受体染色体组，在受体 内稳定维持和表达的过程。
转染：如果进入受体细胞的外源DNA分子是病毒（噬 菌体）的DNA,则把此过程称为转染。
转导：通过噬菌体（病毒）颗粒感染，把DNA导入被 感染的受体细胞的过程。
平末端：当限制酶从识别序列的中心轴线处 切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整 的
回文结构序列是一种旋转对称结构，在轴的 两侧序列相同而反向。有对称轴 ； 是自我 互补的序列 ； 两条链从 5 ‘ 到 3 ‘方向的 序列一致 ； 是 II 类限制酶的识别序列
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基因工程中常用的载体
基因克隆载体的概念：将外源DNA携带进入受体细胞的工