实验五 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定

实验五酵母核糖核酸的分离及组分鉴定

【目的要求】

了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。

【基本原理】

酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。

核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。

【实验器材】

器材

1．乳钵2．150 mL锥形瓶

3．水浴4．量筒

5．漏斗6．吸管

7．滴管8．试管及试管架

9．烧杯10．离心机

试剂和材料

1．0.04 mol／L氢氧化钠溶液1000 mL

2．酸性乙醇溶液500 mL 将0.3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中。

3．95％乙醇1000 mL

4．乙醚500 mL

5．1.5 mol／L硫酸溶液200 mL

6．浓氨水50 mL

7．0.1 mol／L硝酸银溶液50mL

8．三氯化铁浓盐酸溶液80mL

将2mLl0％三氯化铁溶液（用FeCl3·6H2O配制）加入到400 mL浓盐酸中。

9．苔黑酚乙醇溶液10 mL

溶解6g苔黑酚于100mL 95％醇中（可在冰箱中保存1个月）。

10．定磷试剂50 mL

(1)17％硫酸溶液将17 mL浓硫酸（比重1.84）缓缓加入到83 mL水中。

(2)2.5％钼酸铵溶液将2.5 g钼酸铵溶于100 mL水中。

(3)10％抗坏血酸溶液10 g抗坏血酸溶于100 mL水中，贮于棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失效，需纯化抗坏血酸。

临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。

17％硫酸溶液：2.5％钼酸铵溶液：10％抗坏血酸溶液：水

=1：1：1：2(V／V)。

11．酵母粉200g

【操作步骤】

将15 g酵母悬浮于90 mL 0.04 mol／L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150毫升锥形瓶中。在沸水浴上加热30分钟后，冷却。离心（3 000 r／min）15分钟，将上清液缓缓倾入30mL酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，离心（3000r ／min）3分钟。弃去清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次，乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空气中干燥。

取200mg提取的核酸，加入1.5 mol／L硫酸溶液10mL，在沸水浴中加热10分钟制成水解液并进行组分的鉴定。

1．嘌呤碱取水解液1 mL加入过量浓氨水，然后加入约1 mL 0.1 mo1／L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。

2．核糖取1支试管加入水解液1 mL、三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2 mL。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。

3．磷酸取1支试管，加入水解液1 mL和定磷试剂1 mL。在水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。

【实验报告】

思考题

1、如何得到高产量RNA的粗制品?

2、本实验RNA组分是什么?怎样验证的?

【注意事项】

从酵母中提取核酸部分可由两个学生共做一份。水解及组分鉴定部分由每个学生独立操作。

实验十五、薄层层析技术

要求掌握薄层层析的原理和方法。

应用DEAE-纤维素薄层层析分离鉴定核苷酸。

原理

二乙氨基乙基纤维素，简称DEAE-纤维素，是弱碱性阴离子交换剂，在pH3.5左右（≥N一）解离成>NHCl-季胺型，带负电荷的核苷酸离子可被交换上去。利用各种核苷酸的结构不同，因而和DEAE-纤维素亲和力的大小不同，来达到分离的目的。

器材

1．4.5 cm×20 cm玻璃板2．布氏漏斗或离心机

3．涂布器(薄层厚度为0.6 mm) 4．毛细管

5．吹风机6．恒温箱

7．托盘天平8．紫外分析灯(波长254 nm)

试剂

1． 1 mo1／L盐酸溶液200 mL （每二人10nL）

2．pH3.5，0.05mol／L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液1 000 mL （每二人30nL）

称取柠檬酸·2H2O16.20 g，柠檬酸钠·2H2O 6.70 g，溶解在2 000 mL水中，调pH至3.5。

3．标准核苷酸各5 mL

10 mg／mL的AMP、ADP和ATP溶液

4．混合核苷酸 5 mL

AMP+ADP+ATP(均为10 mg／mL)

5．DEAE-纤维素40 g （每二人1g）

操作

1．DEAE-纤维素的预处理用4倍体积的水将DEAE-纤维素浸泡过夜，离心或抽干。再用1 mo1／L的盐酸溶液

浸泡4小时(或搅拌1.5小时)。用水洗至中性或在60℃以下烘干备用。

2．铺板用水把经过预处理的DEAE-纤维素在烧杯里调成糊状，立即倒入干净的玻璃板上。轻轻摇动玻璃板，使纤维素铺成均匀的薄层或将糊状物倒至涂布器的槽内，用涂布器将纤维素涂成薄层(厚0.6 mm)。将玻璃板先放在水平桌面上静置片刻，再放人60℃烘箱内烘干备用。

3．点样在距DEAE-纤维素板一端2 cm处用铅笔轻轻划一横线，在横线中央用毛细管点样(见下图)。每次点样后，用冷风吹干，每种样品点2～3次。

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4．层层在250ml烧杯内倒进约1 cm深的pH3.5的柠檬酸缓冲液(约30 mL)。把点过样的薄板倾斜插入此烧杯内(点样端在下)，溶液由下而上流动，当溶剂前沿到达距薄板上端约 1 cm处时(25分钟左右)，取出薄板，用热风吹干，用A254nm的紫外灯照射DEAE-纤维素薄层，核苷酸斑点为暗区。DEAE-纤维素可回收，经再处理可反复使用。

思考题

1．薄层层析法的优点是什么?

2．怎样预处理DEAE-纤维素?