Westernblot蛋白质双向电泳的原理方法及在医学中的应用最终版文稿演示

显色的 方法
化学发光法
灵敏、快速、节省抗 体、反应快、线性宽、 无害、特异性高、可 重新剥离检测
同位素法
灵敏度高、不安全 、环境污染、不方 便和半衰期短
荧光底物法
Krypton ™荧光底 物
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蛋白质双向电泳的原理
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双向电泳的实验原理
◆第一向：等电聚焦 ◆第二向：SDS—PAGE电泳
2.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法， 信噪比好）
3.后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还 要根据不同目的来挑选不同的转移膜
膜的特点
抗体的选择
• 作为western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少 一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于 ELISA的抗体，一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异 性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特 异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。
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技术流程
提出 生物学问题
实验组和对照组样品制备
双向电泳(2DE/DIGE)
凝胶图像分析
差异蛋白点选取 蛋白酶解及质谱分析 差异蛋白点的成功鉴定
生物学问题的解释
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双向电泳(2DE/DIGE)
• 目前进行蛋白质组学分析的最常规实验技术 • 能实现多达10000种不同蛋白质进行分离分 析
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第一向：等电聚焦
第二向：SDS—PAGE电泳
• 聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺(Arc)和交联剂N,N-甲叉丙烯 酰胺(Bis)在加速剂N,N,N’—四甲基乙二胺（TEMED）和催 化剂硫酸铵（AP）或核黄素的作用下聚合交联成三维网状 的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为PAGE。
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3
蛋白质双向电泳的方法
• 缺点：
• 1.免疫反应性降低 • 2.无信号二级放大 • 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便
Western Blotting 方法二: 间接法
• 优点：
• 1. 免疫特异性不受标记影响 • 2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点） • 3. 多种标记的二抗可供选择 • 4. 可选择不同的Marker
• 做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别 凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉 反应条带。
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化学显色法
方便、便宜、灵敏 度较低、费抗体、 反应慢、线性窄、 不易保存、不能重 新剥离检测
Westernblot蛋白质双向电泳的原理方法及在医学中的应用最终版文稿演示
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Western blot原理及方法
蛋白质印迹法
2
Western blotting
Edward M. Southern建立 了将DNA转移到硝酸纤维 素膜 （NC膜）上，并利 用DNA－RNA杂交检测特定 的DNA片段的方法
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为什么要作蛋白质印迹实验 ？
1
研究一些体外的 蛋白质分子，寻 找目的蛋白是否 存在样品当中
2
不同的样品中检 查蛋白质的表达 情况，上调或下 调表达，如疾病 和正常的样品之 间的表达差异性
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Western Blot的基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一 种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
异性抗体结
2.PVDF膜
灵敏度、分辨 率和蛋白亲和 力比常规的膜 要高，对蛋白 的吸附能力要 远远大于NC膜
3.尼龙膜
对核酸和蛋白 质具有很强的 结合能力，能 代替NC膜用于 分子印迹和杂
交实验。
选择膜的标准
选择标准
1.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合 蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）
Western Blotting间接法操作流程
Western Blotting 设计标准
分子量 标准
膜的选择
抗体
显色结果
不可小看“蛋白标准”--分子量标准的选择
修饰分子 量标准
预染分子 量标准
分子量标准
预混分子 量标准
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不可小看“蛋白标准”--分子量标准的选择
• 预混分子量标准
高分子量标准 低分子量标准 宽分子量标准
• 缺点：
• 1. 交叉反应引起的非特异性条带 • 2. 额外的二抗孵育以及条件优化
为什么一般情况下都采用间接法进行检测？
• 直接法与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记可用于很多种 不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一 抗结合不知一个二抗分子，所以二抗可以增强信号，所以一般 情况下都采用间接法进行检测
• 预染分子量标准
单色预染 多色预染
• 修饰分子量标准
糖基化 磷酸化 荧光标记
预混分子量标准
• 高分子量标准 • 低分子量标准 • 宽分子量标准
预染分子量标准
• 单色预染 • 多色预染
修饰分子量标准
• 糖基化 • 磷酸化 • 荧光标记
膜—三种选择
1.硝酸纤维素膜（NC膜）
价格便宜，简单 快速封闭与非特
Western Blotting 操作流程
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
转膜 封闭 一抗孵育 二抗孵育 底物显色
Western Blotting 操作流程
第三步
第五步
底物显色
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第一步
一抗杂交
转膜
第二步
封闭
第四步
二抗杂交
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Western Blotting 方法一: 直接法
• 优点：
• 1.快速（一种抗体） • 2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带
George Stark对电 泳后的蛋白质分子进 行印迹分析从而发明 western印迹技术
1975 1979 同年 最终
McMaster和Carmichael 对RNA进行印迹分析，发 明 Northern印迹技术
Western blotting！！
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什么是蛋白质印迹法 ？
Westernblot法 是凝胶电泳技术、固定化技术及分 子亲和技术三者融为一体的综合性技术，其核心在 于把凝胶已分离的区带并印迹于固化纸上，可分为 电泳、转印、酶免疫测定3个阶段。Westernblot法 结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和 特异性，是一种能用于分析样本组分的免疫学测定 的方法。