DNA的分离纯化及测定

第一章DNA的分离、纯化及测定

第一节DNA的提取

一、提取程序的原理

植物DNA的提取程序应包括以下几项；

1，破碎(或消化)细胞壁释放出细胞内容物。

然而许多操作在破壁的同时也会剪切DNA，因此任何方法都是在DNA的完整性和产量这两个方面之间折衷考虑的结果。

分离总基因组DNA常用的破壁方法

是将植物组织胀水，然后研磨成细粉，

或者将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉。

分离核DNA或细胞器DNA时则应采取较为温和的破壁方法，以免过早破坏内膜系统，人们通常采用在含有渗透剂的缓冲液中4o C匀浆的方法来破壁。

2、破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中。

这一步骤通常靠诸如SDS或CTAB一类的去污剂来完成。去污剂还可以保护DNA免受内源核酸酶的降解。通常提取缓冲液中还包含EDTA，它可以螯合大多数核酸酶所需的辅助因子——镁离子。

3、去除RNA、蛋白质、多糖、丹宁和色素等杂质

一旦DNA释放出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。剧烈振荡或小孔快速抽吸都会打断溶液中高相对分子质量的DNA 。一般说来，如果操作得当，可以得到相对分子质量长度为50—l00kb的DNA。

在DNA粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖、丹宁和色素等杂质，这些杂质有时很难从DNA中除去。大多数蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA则可通过经处理过的RNase A除去。但多糖类杂质一般较难去除，这些杂质浓度高时，常常使DNA提取物呈胶状，更为重要的是即使是低浓度情况下它们也会干扰后续操作，如抑制某些DNA修饰酶包括限制性内切酶的活性，从而阻碍Southern杂交或基因克隆；同时多糖杂质还会影响分光光度法对核酸的定量分析等。

（植物分子生物学----实验手册（英） Clarke M. S. 主编顾红雅瞿礼嘉主译高等教育出版社 1998 ）

二、基因组DNA的提取

1、基因组DNA用途

DNA是遗传信息的载体，是重要的生物信息分子, 是分子生物学研究的主要对象。

为了进行测序, Southern杂交|, 基因文库的构建，PCR扩增等，高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的前提.

2、基因组DNA提取的原则

保证提取的DNA具有一定的长度

纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质

排除有机溶剂和金属离子的污染

蛋白质,多糖,脂类等降低到最低程度

排除其他核酸分子的污染

3、基因组DNA- CTAB法

CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)

CTAB( hexadecyl trimethyl ammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵), 是一种阳离子去污剂, 具有从低离子强度(0.3mol/L NaCl) 溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性, 在高离子强

度的溶液中( >0.7mol/L NaCl), CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物, 只是不能沉淀核酸. 通过有机溶剂抽提, 去除蛋白, 多糖, 酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来

CTAB提取缓冲液的经典配方

Tris-HCl（三(羟甲基)氨基甲烷）(pH8.0) 提供一个缓冲环境, 防止核酸被破坏;

EDTA 螯合Mg2+ 或Mn2+ 离子, 抑制DNase活性;

NaCl 提供一个高盐环境, 使DNA充分溶解, 存在于液相中;

CTAB溶解细胞膜, 并结合核酸, 使核酸便于分离;

β-巯基乙醇是抗氧化剂, 有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除

CTAB提取缓冲液的改进配方

PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物, 能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除

多酚, 减少DNA中酚的污染; 同时它也能和多糖结合,有效去除多糖.

( From web modified )

方法1

——液氮

——1×缓冲液：50 mmol /L Tris-HCl pH 8.0 ,

0.7mol /L NaCl,

10 mmol /L EDTA pH 8.0 ,

1% CTAB,

20 mmol /L 2-巯基乙醇（用前加入）

——氯仿/异戊醇（24：1）

——RNaseA : 2000U / mL 用0.15 mol/L NaCl, 0.015 mol/L 柠檬酸三钠配

10mg/mL; 使用前100℃热处理15min , 除去残留的DNase活性——异丙醇，

——76%乙醇，0.2 mol/L乙酸钠

——70%乙醇

——TE缓冲液: 10 mmol/L Tris-HCl 1 mmol /L EDTA pH 8.0 ,

操作程序

1. 向装有700~800 mg 磨碎的干燥植物组织（冰冻干燥法，或用食品脱水器

45 ℃~55℃用温暖干燥的气流对植物组织处理12h 以上）（最好是去淀粉处理的：

收获之前将植株暗处理24 h）的50mL聚丙烯离心管中加入20mL 65℃预热的

1×CTAB提取缓冲液。轻轻转动离心管使植物组织在提取缓冲液中均匀分散，

65℃温育90min, 并不时轻轻转动离心管。

或者，将10g 经去淀粉处理的新鲜植物材料用液氮速冻，然后在研钵中将其磨

碎，在化冻之前将粉末转移至一50mL聚丙烯离心管中，然后加入20mL 预热至

90℃的2×CTAB提取缓冲液（CTAB在低于15℃时会析出沉淀，因此在将其加

入到冷冻的材料中之前必须预热）。轻轻转动离心管，混匀，然后置于65℃温育

90min。

2．混合物冷至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇。轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液。室温下5000 g离心10 min分相。

3．将上清液（水相）转移至一干净离心管中，加入1/100体积RNaseA贮液，颠倒混匀37℃保温30min。

4．加入0.7体积异丙醇，仔细混匀，室温放置15min沉淀DNA。

5．用一玻璃钩将DNA钩出（最适条件下，DNA-CTAB沉淀呈白色纤维状，很易钩出，若有多糖等杂质时呈絮状或胶状，需离心得到DNA-CTAB沉淀；2% W/V PVP聚

乙烯吡咯烷酮有助于去除多酚类杂质），并转移至一装有5mL 76%乙醇，0.2

mol/L乙酸钠的干净离心管中，冰上放置20min，然后转移至一装有5mL 76%乙

醇的离心管中冰上旋转5min。

6．将DNA转移至一干净离心管中，空气干燥15min ，溶于尽可能少的TE缓冲液中

（5 mL左右）。若要使DNA样品加速溶解并除去其中残留的DNase活性，可置于

65℃水浴加热10min。4℃贮存。

（植物分子生物学----实验手册（英） Clarke M. S. 主编顾红雅瞿礼嘉主译高等教育出版社 1998 ）

方法2

CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide 十六烷基三甲基溴化铵))是一种去污剂．它能跟核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液(0.7mol/L NaCl)中可溶并且稳定存在、但如果降低盐的浓度(0.3mol/L NaCl)，CTAB与核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀出来。而大部分的蛋白及多糖仍溶于溶液中，通过离心将CTAB- 核酸沉淀下来，然后溶于高盐溶液中，最后通过CsCl离心去除所有蛋白、多糖、寡聚核苷酸等不纯物。

抽提缓冲液（2×）

CTAB ( W/V) 2%

Tris-HCl(pH 8.0) 100mmol/l

EDTA 20mmol/l

NaCl 1.4mol/l

巯基乙醇2%

10% CTAB溶液

NaCl 0.7mol/l