EGFR基因启动子区甲基化状态分析
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02 23 ； 接受日期： 20100409 收稿日期： 2010No. 2009 CB521800 ） ， 国家重点基础研究发展规划（ 973 计划， 北京自然科学基金（ No. 7062009 ） 项目资助
*
联系人
Tel ：01083911675 ； E-mail ： yxzhang@ ccmu. edu. cn
+ 本实验运用 Bisulfite Sequencing PCR （ BSP ） 方 法 检 测 了 2 种 肿 瘤 细 胞 HeLa （ EGFR ） 和 K562
（ EGFR ） EGFR 基因 － 1 300 ～ + 600 的甲基化状态 . 所检测目的片段共包含 178 个 CpG 位点 . 发现 EGFR 阳性与 EGFR 阴性两种细胞系的甲基化状态不同 ： 宫颈癌细胞系 HeLa 转录起始点附近包括 白血病细胞系 K562 转录起始点附近包括第一外 第一外显子区 （ － 244 ～ + 91 ） 处于非甲基化状态 ， 显子区呈嵌合性的高甲基化状态 . 因此 ， 第一外显子比启动子区的甲基化状态更能反映基因的活化 状况 . 关键词 表皮生长因子受体基因 ； 启动子 ； 甲基化 Q78 中图分类号
ISSN 10077626 CN 113870 / Q
中国生物化学与分子生物学报 Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology
2010 年 6 月 26 （ 6 ） ：568 ～ 574
EGFR 基因启动子区甲基化状态分析
周少贞 ， 李相辉 ， 张玉祥
Methylation Patterns of the Human EGFR Gene Promoter Region
ZHOU Shao-Zhen ，LI Xiang-Hui ，ZHANG Yu-Xiang *
（ Department of Biochemistry and Molecular Biology ， Capital Medical University ， Beijing 100069 ， China ）
1
1. 1
材料与方法
材料 宫颈癌细胞系 HeLa 、 白血病细胞系 K562 （ 中国
RPMI1640 培 养 基 （ Gibco 公 司 ） ， 科学院 细 胞 库 ） ， FBS ， Hyclone 公 司 ） ， 胎牛血 清 （ fetal bovine serum ， Hyclone 公 司 ） ， 链青 霉 素 （ PS ， 重 亚 硫 酸 钠 （ sodium bisulfite ，Sigma 公 司 ） 、 氢 氧 化 钠 （ Sigma 公 司 ） 、 对 苯 二 酚 （ Hydroquinone ， Sigma 公 司 ） ，LA Taq （ TaKaRa 公 司 ） ， DNA 纯 化 试 剂 盒 （ Macherey-Nagel pMD18 T 载 体 公司 ） ， 矿 物 油 （ Bio-Rad 公 司 ） ， （ TaKaRa 公司 ） . 引 物 合 成 及 测 序 单 位 为 上 海 生 工 生物工程技术服务有限公司 . 1. 2 细胞培养 37 ℃ 的 培 养 箱 中， 在 5% CO 2 ， 用 含 有 10% FBS 1640 培养基对 HeLa 、 K562 细胞进行培养 . 的 RPMI1. 3 细胞基因组的提取 K562 细 胞， 10 000 r / min 离 心 1 培 养 HeLa 、 min ， 收集细胞 . 用 PBS 缓 冲 液 悬 浮 细 胞， 再次离心 收集细胞 . 沉淀加入 0. 4 mL 双 蒸 水 迅 速 吹 散， 加入 0. 4 mL 细胞 裂 解 液， 55℃ 水 浴 过 夜 . 加 RNase A 至 37 ℃ 温 浴 1 h. 加 入 等 体 积 酚 / 终浓度 200 μ g / mL ， 10 000 r / min 离 心 10 氯仿（ 1∶ 1 ） ， 冰上放置 10 min ， min ， 取 上 清， 加 入 等 体 积 氯 仿， 冰 上 放 置 10 min ， 10 000 r / min 离心 10 min ， . 取上清， 加入 1 /10 体 积 的 3 mol / L NaAc 和 2. 5 倍体积的无水乙醇，－ 20 ℃ 4 ℃ 12 000 r / min 离 心 20 min ， 70% 乙 醇 沉淀 2 h ， 洗沉 淀， 室 温 放 置 待 乙 醇 完 全 挥 发 后， 加 入 50 μ L ddH 2 O 溶解 . 1. 4 基因组质量检测 用 DNA / RNA 将抽提后 的 基 因 组 稀 释 100 倍， 微量定量仪 进 行 定 量， 并 对 其 纯 度 进 行 检 测. 提 取 DNA 的 A 260 / 280 比 值 范 围 为 1. 8 ～ 2. 0. 0. 8% 琼 脂 糖 凝胶电泳鉴定基因组 DNA. 1. 5 亚硫酸氢钠修饰基因组 DNA
Abstract The epidermal growth factor receptor （ EGFR ） is a member of the HER / ERB-B family of transmembrane receptor kinases. Overexpression of EGFR confers advantages in cell proliferation ， survival ，and migration and correlates with decreased survival in multiple solid tumors. However ，our knowledge regarding EGFR expression and regulation is still limited. CpG island hypermethylation is associated with transcriptional silencing. Thus ，we looked into the methylation pattern of EGFR promoter and first exon region using bisulfite sequencing PCR （ BSP ） . The 5′ regulatory sequence of the EGFR gene contains a GC rich promoter without any consensus sequences ，such as TATA or CAAT boxes. Therefore ，transcription starts at multiple initiation sites within the promoter region. Five sets of primers were designed to amplify nt 1300 to + 600 （ relative to ATG ） region （ which contains 178 CpG sites ） of the human EGFR gene and methylation status were investigated in HeLa （ EGFR + ） and K562 （ EGFR － ） cells. The two cell lines have different methylation patterns ： low methylation was found in HeLa cells around the transcription start site ，especially the first exon region from － 244 to + 91 ，and a mosaic dense methylation status in the human leukemia K562 cell line in the same region. Our results indicate that the methylation status of the first exon ，rather than promoter region is a better indicator for the EGFR gene activity. Key words epidermal growth factor receptor gene EGFR ； promoter ； methylation
Received ： February 23 ，2010 ； Accepted ： April 9 ，2010 No. 2009CB521800 ） and Beijing Natural Science Foundation Supported by Major State Basic Research Development Program of China （ 973 Program ， （ No. 7062009 ）
（ 首都医科大学生物化学与分子生物学系 ， 北京 * 100069 ）
摘要
EGFR ） 是 HER / ERB-B 跨膜受体Байду номын сангаас酶家 表皮生长因子受体 （ epidermal growth factor receptor ，
族成员之一 . EGFR 的过表达 促 进 细 胞 的 增 殖 、 存 活 和 迁 移， 与 许 多 实 体 瘤 病 人 的 低 存 活 率 相 关. EGFR 的表达受其启动子 DNA 甲基化调控 . EGFR 的转录沉默与 CpG 岛高甲基化相关 . EGFR 基因 5′调控区包括 1 个富含 GC 的启动子 ， 缺保守序列 TATA 盒和 CAAT 盒 ， 有多个位点可以起始转录 .
［ 2］
的甲 基 化 状 态 . 实 验 测 序 片 段 覆 盖 EGFR 基 因 － 1 300 ～ + 600 ， 共包 含 178 个 CpG 位 点， 通过对 EGFR 基因表达与不表达 的 两 种 细 胞 系 的 甲 基 化 状 发 现 宫 颈 癌 细 胞 系 HeLa 转 录 起 始 点 态进行分析， 附近即第 1 外显 子 － 244 ～ + 91 处 于 非 甲 基 化 状 态， 白血 病 细 胞 系 K562 第 1 外 显 子 呈 嵌 合 性 的 高 甲基化状态， 由此我们认为， 第 1 外显子比启动子区 的甲基化状态更能反映基因的表达状况 .
*
Corresponding author
Tel ：01083911675 ； E-mail ： yxzhang@ ccmu. edu. cn
第6期
周少贞等： EGFR 基因启动子区甲基化状态分析
569
表 皮 生 长 因 子 受 体 （ epidermal growth factor EGFR ） 是 HER / ERB-B 跨 膜 受 体 激 酶 家 族 receptor ， 成员之一， 由 胞 外 段、 跨膜区和胞内激酶活性区构 成. 其 胞 外 段 的 主 要 功 能 是 结 合 表 皮 生 长 因 子 （ EGF ） 等配体， 激活胞内段酪氨酸激酶活性， 启动信 号传导通路， 在正常 组 织 及 肿 瘤 组 织 中 起 到 调 节 细 胞增殖 、 分化的作用 . EGFR 的过表达能够促进细胞 存活和迁移 且 与 许 多 实 体 瘤 病 人 的 低 存 活 的增殖 、 率相 关 . 但 部 分 实 体 瘤 EGFR 低 表 达 或 不 表 达， EGFR 转录沉默且 CpG 岛呈现高甲基化状态［1 ］. EGFR 基因位于 7 号 染 色 体 p13 ～ q22 区， 全长 约 200 kb. EGFR 基 因 5′ 调 控 区 包 括 1 个 富 含 GC 的启动子， 缺少保守序列 TATA 盒和 CAAT 盒， 有多 个位点可以起始转 录
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联系人
Tel ：01083911675 ； E-mail ： yxzhang@ ccmu. edu. cn
+ 本实验运用 Bisulfite Sequencing PCR （ BSP ） 方 法 检 测 了 2 种 肿 瘤 细 胞 HeLa （ EGFR ） 和 K562
（ EGFR ） EGFR 基因 － 1 300 ～ + 600 的甲基化状态 . 所检测目的片段共包含 178 个 CpG 位点 . 发现 EGFR 阳性与 EGFR 阴性两种细胞系的甲基化状态不同 ： 宫颈癌细胞系 HeLa 转录起始点附近包括 白血病细胞系 K562 转录起始点附近包括第一外 第一外显子区 （ － 244 ～ + 91 ） 处于非甲基化状态 ， 显子区呈嵌合性的高甲基化状态 . 因此 ， 第一外显子比启动子区的甲基化状态更能反映基因的活化 状况 . 关键词 表皮生长因子受体基因 ； 启动子 ； 甲基化 Q78 中图分类号
ISSN 10077626 CN 113870 / Q
中国生物化学与分子生物学报 Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology
2010 年 6 月 26 （ 6 ） ：568 ～ 574
EGFR 基因启动子区甲基化状态分析
周少贞 ， 李相辉 ， 张玉祥
Methylation Patterns of the Human EGFR Gene Promoter Region
ZHOU Shao-Zhen ，LI Xiang-Hui ，ZHANG Yu-Xiang *
（ Department of Biochemistry and Molecular Biology ， Capital Medical University ， Beijing 100069 ， China ）
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1. 1
材料与方法
材料 宫颈癌细胞系 HeLa 、 白血病细胞系 K562 （ 中国
RPMI1640 培 养 基 （ Gibco 公 司 ） ， 科学院 细 胞 库 ） ， FBS ， Hyclone 公 司 ） ， 胎牛血 清 （ fetal bovine serum ， Hyclone 公 司 ） ， 链青 霉 素 （ PS ， 重 亚 硫 酸 钠 （ sodium bisulfite ，Sigma 公 司 ） 、 氢 氧 化 钠 （ Sigma 公 司 ） 、 对 苯 二 酚 （ Hydroquinone ， Sigma 公 司 ） ，LA Taq （ TaKaRa 公 司 ） ， DNA 纯 化 试 剂 盒 （ Macherey-Nagel pMD18 T 载 体 公司 ） ， 矿 物 油 （ Bio-Rad 公 司 ） ， （ TaKaRa 公司 ） . 引 物 合 成 及 测 序 单 位 为 上 海 生 工 生物工程技术服务有限公司 . 1. 2 细胞培养 37 ℃ 的 培 养 箱 中， 在 5% CO 2 ， 用 含 有 10% FBS 1640 培养基对 HeLa 、 K562 细胞进行培养 . 的 RPMI1. 3 细胞基因组的提取 K562 细 胞， 10 000 r / min 离 心 1 培 养 HeLa 、 min ， 收集细胞 . 用 PBS 缓 冲 液 悬 浮 细 胞， 再次离心 收集细胞 . 沉淀加入 0. 4 mL 双 蒸 水 迅 速 吹 散， 加入 0. 4 mL 细胞 裂 解 液， 55℃ 水 浴 过 夜 . 加 RNase A 至 37 ℃ 温 浴 1 h. 加 入 等 体 积 酚 / 终浓度 200 μ g / mL ， 10 000 r / min 离 心 10 氯仿（ 1∶ 1 ） ， 冰上放置 10 min ， min ， 取 上 清， 加 入 等 体 积 氯 仿， 冰 上 放 置 10 min ， 10 000 r / min 离心 10 min ， . 取上清， 加入 1 /10 体 积 的 3 mol / L NaAc 和 2. 5 倍体积的无水乙醇，－ 20 ℃ 4 ℃ 12 000 r / min 离 心 20 min ， 70% 乙 醇 沉淀 2 h ， 洗沉 淀， 室 温 放 置 待 乙 醇 完 全 挥 发 后， 加 入 50 μ L ddH 2 O 溶解 . 1. 4 基因组质量检测 用 DNA / RNA 将抽提后 的 基 因 组 稀 释 100 倍， 微量定量仪 进 行 定 量， 并 对 其 纯 度 进 行 检 测. 提 取 DNA 的 A 260 / 280 比 值 范 围 为 1. 8 ～ 2. 0. 0. 8% 琼 脂 糖 凝胶电泳鉴定基因组 DNA. 1. 5 亚硫酸氢钠修饰基因组 DNA
Abstract The epidermal growth factor receptor （ EGFR ） is a member of the HER / ERB-B family of transmembrane receptor kinases. Overexpression of EGFR confers advantages in cell proliferation ， survival ，and migration and correlates with decreased survival in multiple solid tumors. However ，our knowledge regarding EGFR expression and regulation is still limited. CpG island hypermethylation is associated with transcriptional silencing. Thus ，we looked into the methylation pattern of EGFR promoter and first exon region using bisulfite sequencing PCR （ BSP ） . The 5′ regulatory sequence of the EGFR gene contains a GC rich promoter without any consensus sequences ，such as TATA or CAAT boxes. Therefore ，transcription starts at multiple initiation sites within the promoter region. Five sets of primers were designed to amplify nt 1300 to + 600 （ relative to ATG ） region （ which contains 178 CpG sites ） of the human EGFR gene and methylation status were investigated in HeLa （ EGFR + ） and K562 （ EGFR － ） cells. The two cell lines have different methylation patterns ： low methylation was found in HeLa cells around the transcription start site ，especially the first exon region from － 244 to + 91 ，and a mosaic dense methylation status in the human leukemia K562 cell line in the same region. Our results indicate that the methylation status of the first exon ，rather than promoter region is a better indicator for the EGFR gene activity. Key words epidermal growth factor receptor gene EGFR ； promoter ； methylation
Received ： February 23 ，2010 ； Accepted ： April 9 ，2010 No. 2009CB521800 ） and Beijing Natural Science Foundation Supported by Major State Basic Research Development Program of China （ 973 Program ， （ No. 7062009 ）
（ 首都医科大学生物化学与分子生物学系 ， 北京 * 100069 ）
摘要
EGFR ） 是 HER / ERB-B 跨膜受体Байду номын сангаас酶家 表皮生长因子受体 （ epidermal growth factor receptor ，
族成员之一 . EGFR 的过表达 促 进 细 胞 的 增 殖 、 存 活 和 迁 移， 与 许 多 实 体 瘤 病 人 的 低 存 活 率 相 关. EGFR 的表达受其启动子 DNA 甲基化调控 . EGFR 的转录沉默与 CpG 岛高甲基化相关 . EGFR 基因 5′调控区包括 1 个富含 GC 的启动子 ， 缺保守序列 TATA 盒和 CAAT 盒 ， 有多个位点可以起始转录 .
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的甲 基 化 状 态 . 实 验 测 序 片 段 覆 盖 EGFR 基 因 － 1 300 ～ + 600 ， 共包 含 178 个 CpG 位 点， 通过对 EGFR 基因表达与不表达 的 两 种 细 胞 系 的 甲 基 化 状 发 现 宫 颈 癌 细 胞 系 HeLa 转 录 起 始 点 态进行分析， 附近即第 1 外显 子 － 244 ～ + 91 处 于 非 甲 基 化 状 态， 白血 病 细 胞 系 K562 第 1 外 显 子 呈 嵌 合 性 的 高 甲基化状态， 由此我们认为， 第 1 外显子比启动子区 的甲基化状态更能反映基因的表达状况 .
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Corresponding author
Tel ：01083911675 ； E-mail ： yxzhang@ ccmu. edu. cn
第6期
周少贞等： EGFR 基因启动子区甲基化状态分析
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表 皮 生 长 因 子 受 体 （ epidermal growth factor EGFR ） 是 HER / ERB-B 跨 膜 受 体 激 酶 家 族 receptor ， 成员之一， 由 胞 外 段、 跨膜区和胞内激酶活性区构 成. 其 胞 外 段 的 主 要 功 能 是 结 合 表 皮 生 长 因 子 （ EGF ） 等配体， 激活胞内段酪氨酸激酶活性， 启动信 号传导通路， 在正常 组 织 及 肿 瘤 组 织 中 起 到 调 节 细 胞增殖 、 分化的作用 . EGFR 的过表达能够促进细胞 存活和迁移 且 与 许 多 实 体 瘤 病 人 的 低 存 活 的增殖 、 率相 关 . 但 部 分 实 体 瘤 EGFR 低 表 达 或 不 表 达， EGFR 转录沉默且 CpG 岛呈现高甲基化状态［1 ］. EGFR 基因位于 7 号 染 色 体 p13 ～ q22 区， 全长 约 200 kb. EGFR 基 因 5′ 调 控 区 包 括 1 个 富 含 GC 的启动子， 缺少保守序列 TATA 盒和 CAAT 盒， 有多 个位点可以起始转 录