动物组织中的核酸提取与鉴定

动物组织中核酸的提取与鉴定

一、原理

根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离，然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离提纯的目的。

二、试剂

1.地衣酚（orcinol）试剂：

称取100mg地衣酚溶于100ml 浓盐酸中，再加入100mgFeCl3·6H2O，该溶液应在使用前新鲜配制。

2.二苯胺试剂：

称取1g二苯胺（经重结晶）溶入100ml冰醋酸中，再加入2.75ml浓H2SO4摇匀，冰箱内保存备用。

3. 0.14mol/L氯化钠溶液（内含0.01mol/L柠檬酸），250ml；

4. 1mol/L氯化钠溶液，250ml；

5. 95%乙醇（冷）；

6. 氯仿；

7. 异戊醇

三、器材

a)冷冻离心机（3000rpm）

b)组织捣碎机或组织匀浆器

c)不锈钢剪刀

d)冰浴

e)试管、试管夹

f)量筒、吸管

g)带塞比色管、带塞离心管

h)玻棒、烧杯

i)电炉等

三、方法

1. 制匀浆

将新鲜肝脏或冷冻肝脏称重后用冷的0.14mol/L氯化钠溶液（内含0.01mol/L柠檬酸）洗去血水，用不锈钢剪刀将肝脏剪成碎块，放入组织捣碎机中加入2倍体积的0.14mol/LNaCl 溶液（内含0.01mol/L柠檬酸）制备匀浆。

将匀浆置离心机中离心20min（3000rpm）。上层液倾出留待抽提RNA ，下层用二倍体积冷的1mol/LNaCl溶液抽提1h，待分离DNA核蛋白。

2. 核酸的抽提

2.1RNA的提取

0.14mol/L的NaCl抽提液（内含RNA核蛋白）加入等体积的氯仿和1/40体积的异戊醇，置带塞离心管中，振摇30min，此时提取液为乳白色混悬液，以3000rpm离心15min，离心物呈三层。

用滴管吸出上层清液，在低温下加入1.5~2倍的冷95%乙醇，并轻轻搅拌。低温放置15min，3000rpm离心10min，弃去上清液，即得RNA颗粒状沉淀，待定性。

2.2DNA的抽提

将抽提1h的1mol/LNaCl匀浆悬液以3000rpm离心20min，弃去沉淀，将其上清液倒入带塞的离心管中，加入等体积的氯仿及1/40体积的异戊醇振摇30min，离心20min。将其上清液加入2倍体积的冷95%乙醇，边加边摇，抽出玻棒，纤维状DNA就缠绕在玻棒上待定性。

每次都需采用冷冻离心。

3. 定性试验

3.1RNA的呈色反应

取2支干净试管，一管加入1.5ml RNA溶液，另一管加入蒸馏水1.5ml，向两管中加入3ml地衣酚试剂，于沸水中加热10min，由黄色变为绿色为阳性反应。

3.2DNA的呈色反应

取2支干净试管，一管加入1.5mlDNA溶液，另一管加入蒸馏水1.5ml，向两管中加入3ml二苯胺试剂，于沸水中加热10min，由乳白色变为蓝色为阳性反应。

五、注意事项

在提取分离纯化核酸时，为了保持核酸的完整性，防止核酸变性降解，操作时必须防止过酸或过碱。全部过程应在低温下(0℃左右)进行，必要时还需加入抑制剂，以抑制核酸酶的作用。

加氯仿、异戊醇后振摇要充分，但又不能太剧烈，以防DNA断裂。

实验九-动物组织中核酸的提取和鉴定

(一)核酸提取 l、用酚提取法：（1）取小白鼠一只，断头处死，剖腹取肝，置于研钵中，加入玻璃少许，研磨至糊状后，加入蒸馏水3ml，继续研磨约三分钟。（2）于该研钵中再加酚液5ml，研磨约十分钟后，倒入—-圆底离心管中，离心5分钟（约2000转/分钟）。（3）用毛细管将上液吸出，置于一圆底离心管中，加乙醚2ml，用拇指将管口按住，用力振摇1—2分钟(提出酚)，离心5分钟后，用毛细滴管吸取全部下层液于一圆底离心管中。（4）于该管中加入95％乙醇2ml，用玻棒搅拌约2分钟，离心3分钟，取出．去上清液，沉淀部分即为核酸。 2、用三氯醋酸提取法（1）杀兔；取肝，称重，按每克肝脏4ml比例加入1％三氯醋酸，制成肝匀浆。每组量取肝匀浆5ml于带塞离心管中，3000转／分离心5分钟。（2）将离心后的上清液倾去，于沉淀中加95％乙醇5ml充分混匀，在水浴中加热至沸2分钟，注意酒精沸腾后将火关小，避免酒精蒸汽燃烧。冷却后离心。（3）倾去上层乙醇液。于沉淀中再加入10％NaCI溶液4ml，置沸水浴中8分钟，并用玻棒不断搅拌，取出；冷却后再离心，（4）将上清液倾入另一离心管中，再离心一次，除去可能存在的微量残渣，将上清液倒入一试管。取等量95％的乙醇，逐滴加入到上清液中，即可见白色沉淀逐渐出现，静置10分钟后。将其内容物摇匀后倒入一圆底离心管中，离心5分钟，将上液倾去，所得白色沉淀即为核酸钠。 (二)核酸的水解：在有核酸沉淀的离心管中加入蒸馏水2ml。振摇至沉淀溶解后，加入10％H2SO42mL摇匀，于沸水浴中加热10分钟，即得核酸水解液，用流水冷却后进行下列定性试验。 (三)鉴定： l、嘌呤碱的鉴定：取中试管一支，加入饱和苦味酸约2ml，再加入核酸水解液4—6滴，摇匀。静置于室温中，观察有无黄色针状结晶出现，。 2、脱氧核糖的鉴定：

QIAGEN试剂盒——动物组织样品DNA提取方法

QIAGEN试剂盒提取组织DNA 试验前的注意事项 1、仔细阅读试剂盒使用说明。 2、所有的离心操作应在15-25℃下完成。 3、涡旋一般进行5-10s。 4、对于福尔马林或石蜡浸泡过样品，另见说明。 5、总RNA提取另见说明。试验准备 1、Buffer ATL 和 Buffer AL保存时可能会出现沉淀，如果必要的话，可置于56°C 水浴至完全溶解。 2、提供的Buffer AW1 和 Buffer AW2是高浓度液，使用前需用96-100%的乙醇稀释至瓶子上注明的使用浓度。 3、预备一个热的振荡器或摇床或摇动的平板至56°C备步骤2使用。 4、如果为冻存的组织，需要将其溶至室温。但是要避免此类的反复溶解。应额外准备的物品： 200μL枪及枪头；20μL枪及枪头；2mL的微量离心管；96-100%乙醇；56℃水浴锅；离心机（20,000×g(14,000rpm)）；小镊子；振荡器

操作步骤： 1、取25mg的动物组织（脾脏最多10mg）粉碎成碎片放入1.5ml的微量离心管中。对于啮齿类的尾巴，择取两只小鼠或一只大鼠尾巴0.4-0.6cm。加入180μL buffer ATL，并将对应的动物作以标记。（保证足够量的组织样本，对于脾脏由于其细胞含量丰富，我们建议不超过10mg。我们强烈建议将组织粉碎以便于溶解提取DNA。最好的方法是在添加bufferATL和蛋白酶K之前置于液氮中冻融。同时，也可以采用QIAGEN公司产的几种组织匀浆机进行组织粉碎） 2、加入20μL蛋白酶K，涡旋混合均匀，56℃孵育直至溶解。在组织溶解的过程中不断（偶尔）涡旋使组织充分散开，或将该微量离心管置于摇晃的平台上，如摇床等。（不同组织溶解时间不同，通常组织为1-3h，小鼠尾巴为6-8h。如果试验条件许可，可以溶解过夜，其不会影响DNA提取） 3、涡旋15s。加入200μL buffer AL 并涡旋使充分混匀，70℃孵育10min，然后加入200μL乙醇（96%-100%），再次涡旋混合。（如果在做多个样品时，可以将buffer AL和乙醇先混合均匀，一起加入到组织中涡旋均匀。在添加bufferAL与乙醇后可能会出现白色沉淀，该沉淀不会影响试剂盒的操作。一些组织（如脾脏）添加了bufferAL与乙醇后出现凝胶状产物，这种情况下，我们建议剧烈摇晃或涡旋样本使之消失。70℃孵育10min该步骤在我在河南农大用的盒子操作中没有） 4、移出步骤3中的混合物（包括沉淀物）至DNeasy Mini spin column，该柱子放在一2mL收集管中（本试剂盒提供的）。6000 × g(8000 rpm)离心1min，收取管子，弃去滤液。 13000 rpm 5、将DNeasy Mini spin column放入另一2mL的收集管中（本试剂盒提供），加入500μLbuffer AW1，6000×g (8000 rpm)离心1min，收取管子，弃去滤液。 6、将DNeasy Mini spin column 放入另一2mL的收集管中（本试剂盒提供），加入500μLbuffer AW2，20,000 ×g (14,000 rpm)离心3min，使Dneasy膜干燥，收取管子，弃去滤液。（使DNeasy Mini spin column膜干燥是非常重要的，因为残留的乙醇会影响下面的反应。这个离心步骤就是为了确保没有残留的乙醇影响下步的洗脱。离心后，小心地取出DNeasy Mini spin column防止其与下边的滤液接触。如果与下边的滤液接触沾了少量乙醇则需要再次20,000×g(14,000rpm)离心1mim） 7、向DNeasy Mini spin column膜移入1mL或2mL的微量离心管中（本试剂盒不提供）直接加入200μL buffer AE，清洗DNeasy Mini spin column膜，室温孵育1min，然后6000 × g(8000 rpm)离心1min。（为了DNA浓度可将200μL buffer AE改为100μL，但是这样会减少DNA的总产量） 8、推荐：如果需要获取最大量的DNA，可将步骤7重复1次。（使用一个新的1mL或2mL的微量离心管，这样可防止降低前者DNA浓度。当然也可以使用前者离心管）注意：洗脱液不要多于200μL，以防止滤液过多与DNeasy Mini spin column发生接触。

实验1 动物组织总RNA的制备及检测

实验1 动物组织总RNA的制备及检测实验目的：使学生掌握从动物新鲜组织，采用Trizol抽提法制备总RNA的实验技术，以及用紫外分光光度法检测RNA的纯度及定量、用琼脂糖电泳法检测RNA的完整性及质量。实验原理： Trizol是一种新型的总RNA即用型制备试剂，适用于从各种组织或细胞中快速分离总RNA。Trizol内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。Trizol，在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。Trizol。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞），也可用于大量样品（≥1g组织或≥107个细胞），对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。一个小时内即可完成反应，提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保护分析等。实验材料： 1、器械处理 [1].用于RT-PCR的玻璃器皿常规洗净后，在烤箱内180℃干烤10h。 [2].所有塑料器材（如Eppendorf管、Tips吸头、PCR薄壁管）均为新购产品，使用前用0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）浸泡12h，高压消毒、烘干。 [3].用于提取RNA的氯仿、异丙醇均为新包装。 [4].75%的乙醇由25ml 0.1% DEPC水与75ml无水乙醇混匀配制而成，4℃保存。 2、试剂配制 [1].0.1% DEPC水：1ml DEPC加入900ml双蒸水，定容至1000ml混匀，室温密封保存。 [2].无RNase水：0.1% DEPC水，37℃过夜，高压20min，去除DEPC。 [3].5×TBE缓冲液：0.45M Tris-硼酸，0.01 M EDTA。配制：54g Tris，27g 硼酸，20ml 0.5M EDTA (pH8.0)，用双蒸水或无RNase水定容至1000ml，室温保存，用时10×稀释。 [4].琼脂糖（agarose）： [5].Trizol试剂： [6].6×凝胶载样缓冲液：0.25% 溴芬蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（w/v）蔗糖实验步骤： 1、动物组织获取 [1].小鼠颈椎脱臼处死。 [2].迅速分离肝脏组织样品。肝脏组织样品可立即用于制备RNA或超低温（-80°C或液氮中）保存。 [3].将lg肝脏组织在液氮预冷的研钵中用研杵研磨，期间不断加入液氮。直至研磨成粉末状（无明显可见的颗粒，如果没有研磨彻底，会影响RNA的收率和质量）。 [4].液氮挥发，将组织粉末一点一点地加入盛有10倍体积Trizol的玻璃匀浆器中。每 50-100 mg组织加1ml的Trizol（从1-10 mg的少量的组织中分离RNA 样品，往组织中加入800 μl Trizol）。 [5].将匀浆器(glass-Teflon) 置于冰浴中进行匀浆（匀浆化时组织样品容积不能超过Trizol 容积的10%）。直至匀浆液呈无颗粒透明状。

17动物组织蛋白提取

1.组织块迅速置于预冷的生理盐水中，洗去表面的血迹，将组织称量后切成较小的组织块（0.2-1.0g），放入组织匀浆器中，按组织100mg：提取试剂体积1ml的比例加入相应体积的蛋白提取试剂（需提前加入酶抑制剂）进行匀浆，至组织研磨完全。 2.超声处理（同细胞蛋白样品的制备），处理完后置冰上裂解4-5小时。 3.10000 g/min离心10min，取中层溶液，加入等体积的蛋白上样缓冲液（2X），或1/4体积蛋白上样缓冲液（5x）（AR1112）,置100℃水浴箱沸水浴中变性5分钟。 1、动物肝脏直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次。 2、称量约40mg研磨组织，加入200 ul预冷的组织蛋白抽提试剂，冰上孵育20分钟。 3、10,000×g 离心15分钟。 4、收集上清，进行下一步的实验。手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。 ①吸取培养基，预冷PBS清洗细胞三次，细胞刮刮脱细胞，收集至离心管，1000rpm离心5分钟。洗涤后的细胞转移至洁净EP管，②冰上操作，配制细胞裂解液，1ml Lysis,Buffer 中加入10 μl磷酸酶抑制剂、1 μl蛋白酶抑制剂、5μl 100mM的PMSF。混匀后冰上保存数分钟待用。③在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1ml细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液。200μl移液器反复吹打，至蛋白析出。④4℃摇床，温和振摇15分钟。⑤14000rpm，4℃离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物。⑥BCA法测蛋白浓度。蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。细胞提取步骤 1. 冰上操作，向细胞沉淀中加入200ul细胞裂解液，2μl 100mM的PMSF。 2. 200μl移液器反复吹打，至溶液变得粘稠。 3. 4℃摇床，温和振摇30min。 4. 15000rpm，4℃离心15min，上清即为细胞全蛋白提取物 5. 蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。

动物肝脏中DNA的提取检测实验报告

动物肝脏中DNA的提取及检测一、前言脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（DNA，为英文Deoxyribonucleic acid的缩写），又称去氧核糖核酸，是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。有时也被称为“遗传微粒”，原因是在繁殖过程中，父代会把它们自己DNA的一部分复制传递到子代中，从而完成性状的传播。 DNA是高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基绿染成绿色。DNA对紫外线（260nm）有吸收作用，利用这一特性，可以对DNA进行含量测定。当核酸变性时，吸光度升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的水平。较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性，即DNA双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开—也称为DNA的解螺旋。在细胞内，DNA能与蛋白质结合形成染色体，整组染色体则统称为染色体组。对于人类而言，正常的体细中含有46条染色体。染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制，细胞分裂间期又可划分为：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。对于真核生物，如动物、植物及真菌而言，染色体主要存在于细胞核内；而对于原核生物，如细菌而言，则主要存在于细胞质中的拟

核内。染色体上的染色质蛋白，如组织蛋白，能够将DNA进行组织并压缩，以帮助DNA与其他蛋白质进行交互作用，进而调节基因的转录。脱氧核糖核酸的结构 DNA的结构：DNA的结构一般可划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个水平。 DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即腺嘌呤脱氧核苷酸（dAMP 脱氧腺苷）、胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTMP 脱氧胸苷）、胞嘧啶脱氧核苷酸（dCMP 脱氧胞苷）、鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGMP 脱氧鸟苷）。而脱氧核糖（五碳糖）与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。读取密码的过程称为转录，是以DNA双链中的一条单链为模板转录出一段称为mRNA（信使RNA）的核酸分子。 DNA是由许多脱氧核苷酸按一定碱基顺序彼此用3’，5’-磷酸二酯键相连构成的长链。大多数DNA含有两条这样的长链，也有的DNA为单链，如大肠杆菌噬菌体φX174、G4、M13等。DNA 有环形DNA和链状DNA之分。在某些类型的DNA中，5-甲基胞嘧啶可在一定限度内取代胞嘧啶，其中小麦胚DNA的5-甲基胞嘧啶特别丰富。在某些噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶。40年

动物组织基因组DNA提取试剂盒说明书

磁珠法动物组织基因组DNA提取试剂盒 MagBeads Tissues Gen DNA Extraction Kit 【目录号】TGDE-5005、TGDE-5030 【运输条件】2~25℃；【保存条件】磁珠悬浮液2~8℃，其它组分室温保存；【试剂盒组成】【注意事项】 1. 磁珠悬浮液严禁反复冻融和离心，使用前请充分混匀； 2. 使用前请检查裂解液1和裂解液2是否出现结晶，如有结晶请置于65℃水浴重新溶解； 3. 在使用本试剂盒前，请用户自配80%乙醇； 4. 如需去除RNA请自备RNase A溶液（100mg/mL, 分散液10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH值8.0）； 5. 本操作指南经本公司反复验证，使用前请仔细阅读，并且按照操作指南的建议操作。

磁珠法·自动化：为生命科学提供自动化磁纳米捕获方案【产品简介】本产品适用于从各种动物组织以或者细胞样本中提取基因组DNA。试剂盒采用具有独特分离作用的纳米磁珠和独特的缓冲液系统。特殊技术包埋的纳米磁珠在特定条件下对核酸具有极强的亲和力，而当条件改变时可以释放所吸附的核酸，从而达到快速分离纯化核酸的目的。本试剂盒提取所得基因组DNA产物得量高、纯度好，适用于各种下游分子生物学实验，如：酶切、PCR、QPCR、文库构建、Southern 杂交、芯片检测和高通量测序等。本试剂盒可配合核自动化酸提取仪或工作站使用，实现高通量操作。【试剂盒说明】【自备仪器、耗材及试剂】仪器自动版研钵（或组织研磨机、匀浆机）、英芮诚ETP-300型全自动核酸提取仪、核酸提取仪配套用磁棒套、水浴锅或金属浴、涡旋振荡仪、96孔方孔圆底板、80%乙醇、异丙醇、液氮。手动版研钵（或组织研磨机、匀浆机）、水浴锅或金属浴、涡旋振荡仪、真空干燥箱、80%乙醇、异丙醇、2.0mL离心管、离心管配套用磁力架、液氮。【仪器自动版操作步骤】本操作以英芮诚ETP-300型全自动核酸提取仪为例，同步可完成32个样本的提取。 1．准备96孔板参照下表向96孔板各孔位中分别加入相应试剂：

高中生物实验八动物组织和细胞中核酸的提取和测定

实验九动物组织和细胞中核酸的提取和测定第一部分动物组织和细胞中DNA和RNA的提取【实验目的】学习从组织和细胞中提取DNA和RNA的方法【实验原理】 1.从动物组织和细胞中提取DNA DNA存在于细胞核中。提取DNA的方法首先需要温和裂解细胞及溶解DNA的技术，接着需采用化学和酶学方法，除去杂蛋白、RNA及其他的大分子。本实验在EDTA（螯合二价阳离子以抑制Dnase）存在的情况下，用蛋白酶K消化真核细胞和组织，用去垢剂（如SDS，十二烷基磺酸钠）溶解细胞膜并使蛋白质变性。核酸通过有机溶剂抽提得以纯化，污染的RNA通过RNase消化清除。这个方法可产生十微克至数百微克的DNA，适用于标准琼脂糖凝胶上的Southern分析，可用作PCR 反应的模板，以及用于构建基因组DNA文库。 2.从动物组织和细胞中提取RNA RNA存在于细胞质及核中，是一种极易降解的核酸分子。为了快速从细胞中分离完整的RNA，许多方法都用到了高浓度的强变性剂硫氰酸胍使细胞破裂。高浓度的硫氰酸胍还使细胞内的各种RNA酶失活，使释放出的RNA不被降解。细胞裂解后存在于裂解溶液内的有RNA，核DNA，蛋白质和细胞残片，通过酚，氯仿等有机溶剂处理，离心，使RNA最终与其它细胞组分分离开来。【实验材料】 1.实验器材研钵和研棒，匀浆机，橡胶刮棒，低温冷冻离心机，恒温水浴，宽口移液管，锤子，塑料袋，涡旋。 2.实验试剂 (1)裂解缓冲液：10mmol/L Tris-Cl (PH8.0)，0.1mol/L EDTA (PH8.0)，0.5%(m/V) SDS，20μg/mg无Dnase的胰RNase，裂解缓冲液的前三种成分可预先混合并于室温保存。RNase在用前适量加入。(2)溶液D(变性液)：4 mol/L 硫氰酸胍，25mmol/L 柠檬酸钠. 2H20，0.5%(m/V)月桂基肌酸钠，0.1mol/L β-巯基乙醇，将250g硫氰酸胍、0.75mol/L(PH7.0)柠檬酸钠17.6ml和26.4ml10%(m/V )月桂基肌酸钠溶于293 ml水中.加入搅拌子于磁力搅拌器上65℃混匀,直至完全溶解。室温贮存溶液D,每次使用前加入14.4 mol/L的β-巯基乙醇,每50ml溶液D加0.36ml。溶液D可在室温下避光保存数月。 (3)平衡酚：用0.5mol/L Tris-Cl (PH8.0)平衡的苯酚 (4)TBS：在800 ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl和3gTris碱、加入0.015g酚红并用HCl调节溶液的PH值至7.4,加水定容至1L,分装后在15 lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。保存于室温。 (5)PBS：在800 ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4, 用HCl调节溶液的PH值至7.4, 加水定容至1L, 在15 lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。保存于室温。 (6)TE（PH8.0）：10mmol/L Tris.Cl（PH8.0），1 mmol/LEDTA（PH8.0） (7) 蛋白酶K（20mg/ml），10mol／L醋酸铵，2mol／L的醋酸钠(pH4.0)，0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯） (8)无水乙醇，70％乙醇，氯仿—异戊醇(49:1,V/V)，异丙醇，酚 (9) 液氮

酵母RNA的提取及组份鉴定与核酸的定量测定

实验酵母RNA的提取及组份鉴定与核酸的定量测定【课前预习】 1. 为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？ 2．如何从酵母中提取到较纯的RNA? 3．干扰RNA的提取的物质有哪些并设计排除这些干扰的实验。 4．干扰紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度实验的物质有哪些？【目的要求】 1. 了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。 2. 了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。 3. 学习紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。【基本原理】由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。酵母含RNA达2. 67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示。为每升溶液中含有1克

动物组织细胞基因组DNA提取

动物组织细胞基因组DNA提取一、实验原理真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组DNA。真核生物的DNA 是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA 分子完整地分离出来。二、仪器及试剂 1. 仪器：恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌） 2. 试剂：（1）细胞裂解缓冲液： Tris (pH8.0) 100 mmol/L EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L NaCL 20 mmol/L SDS 10%

胰RNA酶20ug/ml （2）蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。（4）酚?氯仿?异戊醇（25:24:1）、（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。三、操作步骤 1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml 的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。 2.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行） 3.加等量的酚?氯仿?异戊醇振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 4.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿?异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。 6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。 7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ，5min。 8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。 9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。 10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。

实验四肝组织中核酸的提取和鉴定

实验四肝组织中核酸的提取和鉴定【目的】验证核酸的三大组成成分。熟悉组织中核酸的提取与鉴定的基本操作方法。【原理】动物组织细胞中的核糖核酸（RNA ）与脱氧核糖核酸（DNA ）大部分与蛋白质结合而形成核蛋白。被三氯醋酸沉淀的核蛋白，先用95%的乙醇加热去除附着在沉淀上的脂类杂质，再用1.7mol/L NaCl 溶液提取出核酸的钠盐，然后加入乙醇即可使核酸钠盐沉淀析出。 RNA 与DNA 均可被硫酸水解产生磷酸、含氮碱基(嘌呤与嘧啶)及戊糖（RNA 为核糖，DNA 为脱氧核糖）。此三类物质分别可按照下述原理鉴定。 1.磷酸磷酸与钼酸铵试剂作用生成黄色磷钼酸，磷钼酸中的钼在有还原剂（硫酸亚铁）存在时可被还原成蓝色的钼蓝。根据此呈色反应即可鉴定磷酸的存在。 2.嘌呤碱根据嘌呤碱能与硝酸银产生灰褐色的絮状嘌呤银化合物而鉴定。 3.戊糖根据核糖经浓盐酸或浓硫酸作用则生成糠醛，后者能与3，5二羟甲苯缩合而形成绿色化合物而鉴定。 CHO C H C H C H CH 2OH OH OH OH O CHO O H CH 3 C O CH 3 O C H 3OH -H 2O 核糖 3，5-二羟甲苯糠醛绿色化合物脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，它和二苯胺作用生成蓝色化合物。 CHO C H C H C 2OH H H O -H 2O 浓酸脱氧核糖蓝色化合物 CHO C H C H C H CH 2OH H OH OH ω-羟基-γ-酮基戊醛二苯胺【器材】剪刀、镊子、玻棒、滤纸、试管、试管架、蒸发皿、匀浆器、离心机、沸水浴箱。【试剂 1.生理盐水。

动物基因组DNA的提取流程总结

动物基因组DNA的提取 1.切取组织5g左右，用组织粉碎机或研钵将细胞分离。注：1）少量结缔组织并不影响最后得到的DNA的质量；2）若标本为血液，则只需肝素抗凝、离心后取白细胞层；3）若为培养的贴壁细胞，则用胰酶消化后收集，PBS洗涤即可。 2.加入5ml DNA提取缓冲液，(10m mol/L Tris-Cl，0.1 mol/L EDTA，0.5% SDS), 混匀。注：1）最好先加入Tris-Cl、EDTA，再加入SDS；2）最好一边匀浆，一边加入液体，使之充分混匀。 3.加入25ul 蛋白酶K，使终浓度达到100ug/ml，混匀，37℃温浴过夜。注：1）致密组织（如小鼠尾巴）可以适当延长蛋白酶的作用时间；2）若组织量很大且组织比较疏松（如动物脾脏），或对所提取的DNA完整性要求不高时，可以不用蛋白酶K，而是剧烈振荡20分钟，将组蛋白与ＤＮＡ分离。此法可能会使部分DNA链断裂，但足以达到一般实验要求，并不影响后续处理；3）也可同时加入RNase。 4.加入等体积的酚－氯仿－异戊醇混合物(25:24:1)，剧烈振荡10分钟，冰浴 10分钟，2500rpm 10分钟离心收集水相。注：不要混带中间蛋白层。 5.加1/10体积3mol/L NaAc 及2倍体积冰预冷的无水乙醇，颠倒混匀。冰浴１小时，沉淀DNA。注：冰浴时间从10分钟到２小时均可，只是时间太短会影响到最后的产量，但不影响质量。 6.用玻棒轻搅钩出DNA沉淀，置于另一离心管中。注：如果确信没有混入蛋白，也可用离心的方法去除液体，但应在加入蛋白酶K的同时加入RNaseA。 7.70%乙醇洗涤，晾干，加适量TE或灭菌水溶解，-20℃保存。注：若要长久保存DNA（数年以上），最好将其沉淀以无水乙醇封闭后，置于-80℃。

动物组织基因组DNA的提取

实验一动物组织基因组DNA的提取一、实验目的掌握从动物组织中提取总DNA的方法。二、实验原理 DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，为了进行测序、杂交、基因表达、文库构建等实验，获得高分子量和高纯度的基因组DNA 是非常重要的前提，因此基因组DNA的提取也是分子生物学试验技术中最重要、最基本的操作之一。染色体存在于细胞核中，外有核膜及胞膜。从组织中提取DNA必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色体释放出来，同时去除与DNA结合的组蛋白及非组蛋白。整个实验可分为细胞裂解、DNA分离与纯化和DNA的洗脱收集。1.细胞裂解：酶法（蛋白酶K）。2. DNA分离与纯化：细胞破碎后，常使用吸附材料结合方法去除杂质和纯化DNA，主要有硅基质材料、阴离子交换树脂和磁珠等。本实验采用TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒中的硅基质材料的离心吸附柱。硅基质材料吸附核酸的原理，主要利用DNA在高盐低pH值环境下与硅基质材料相结合，在低盐高pH值环境下与硅基质材料脱离的特征，高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。三、材料、试剂和设备 1.材料：动物组织 2.试剂：TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，无水乙醇等 3.设备：离心机，微量移液器等四、实验步骤 1.处理材料：取动物组织10mg，尽量切碎，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。 2.加入20μl蛋白酶K溶液，混匀后56℃水浴，直至组织溶解（不同组织裂解时间不同，通常需1-3小时即可完成）。简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。（细胞裂解） 3.加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁水珠。（溶解DNA）注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA 不纯。 4.加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。（沉淀DNA） 5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，

实验九动物组织中核酸的提取和鉴定

实验七动物组织中核酸的提取和鉴定【原理】动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖孩酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。核蛋白可被三氯醋酸沉淀，再用95％乙醇加热可以除去附着在沉淀上的脂类杂质，然后用10％NaCl 溶液提取出核酸的钠盐，加入醇可使核酸钠沉淀析出。先用水由动物肝中提出核蛋白，再籍酚将核酸与蛋白质之间的结合键断裂，并用乙醚抽提去蛋白质及其它杂质，最后用乙醇将核酸沉淀。核酸(RNA、DNA)可被硫酸水解产生磷酸。有机碱（嘌岭、嘧啶）和戊糖（核糖、脱氧核糖）。此三类化合物可用下列方法鉴定之。 1、磷酸：能与钼酸试剂作用生成磷钼酸，后者在还原剂的作用下。还原成兰色的钼兰。常用的还原剂有氨基苯磺酸、氯化亚锡，维生素C 等。 H 3PO 4＋12H 2MoO 4→H 3PO 4·12MoO 3+12H 2O H 3PO 4·12MoO 3 H 3PO 4·6MoO 3·3Mo 2O 5 2、嘌呤碱：能与苦味酸作用形成针状结晶 3、戊糖： (1)核糖：经与强酸(盐酸与硫酸)共热生成糠醛，后者可与3;5二羟甲基苯缩合成绿色化合物。 (2)脱氧核糖：在强酸中加热，可生成ω—羟基γ—酮基戊醛，后者再与二苯胺作用生成一蓝色化合物。上述二反应如下【操作】(一)核酸提取l、用酚提取法：（1）取小白鼠一只，断头处死，剖腹取肝，置于研钵中，加入玻璃少许，研磨至糊状后，加入蒸馏水3ml，继续研磨约三分钟。（2）于该研钵中再加酚液5ml，研磨约十分钟后，倒入—-圆底离心管中，离心5分钟（约2000转/分钟）。（3）用毛细管将上液吸出，置于一圆底离心管中，加乙醚2ml，用拇指将管口按住，用力振摇1—2分钟(提出酚)，离心5分钟后，用毛细滴管吸取全部下层液于一圆底离心管中。（4）于该管中加入95％乙醇2ml，用玻棒搅拌约2分钟，离心3分钟，取出．去上清液，沉淀部分即为核酸。2、用三氯醋酸提取法（1）杀兔；取肝，称重，按每克肝脏4ml 比例加入1％三氯醋酸，制成肝匀浆。每组量取肝匀浆5ml 于带塞离心管中，3000转／分离心5分钟。（2）将离心后的上清液倾去，于沉淀中加95％乙醇5ml 充分混匀，在水浴中加热至沸2分钟，注意酒精沸腾

动物组织块DNA的提取

【实验目的】（1）学习并掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。（2）从肝脏组织中提取到一定量的纯净的DNA样品。【实验原理】 DNA是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中。通过研磨和SDS作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质；RNase降解RNA，从而得到纯净的DNA分子。【仪器、材料、试剂】（一）仪器 1．高速离心机 2．烘箱 3．冰箱 4．水浴锅 5．微量移液器 6．高压灭菌锅（二）材料 1．生理盐水 2．十二烷基硫酸钠（SDS） 3．三羟甲基氨基甲烷（Tris） 4．乙二胺四乙酸（EDTA） 5．饱和酚 6．氯仿 7．异戊醇 8．无水乙醇 9．75%乙醇 10．蛋白酶K 11．RNase酶 12．手术剪刀、镊子、吸水纸 13．微量取液器 14．研钵、1.5mL 离心管、一次性手套、1.5mL离心管架、记号笔

（三）试剂配制 1．Tris–HCL 1mol/L PH8.0 50ml 配制方法： 40ml双蒸水，6.057g固体Tris放入烧杯中溶解，用浓盐酸调PH值到8.0，转移到50ml 容量瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。 2．生理盐水: 0.85%NaCL 100ml 配制方法：在20ml双蒸水中溶解0.85g固体NaCL，加水定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。 3．EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml 配制方法：将9.08g的EDTA·Na2·2H2O溶解于40ml双蒸水，用1g的NaOH颗粒（慢慢逐步加入）调PH值到8.0，用50ml容量瓶定容，如果EDTA难溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTA·Na2·2H2O。 4．TES缓冲液（释放DNA）100ml 配制方法：将0.5844g的5 mol/lNaCl溶解于80ml双蒸水，在分别加入1ml的0.5 mol/l EDTA、0.2ml 的Tris-HCl (pH=8.0)，加定容至100ml, 摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。 5．10% SDS（变性剂破细胞壁）100ml 配制方法：将10g的十二烷基硫酸钠（SDS）溶解于80ml双蒸水于68℃加热溶解，用浓HCl调至PH=7.2，定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，4℃保存备用。6．蛋白酶K（降解蛋白质）：20mg/mL 无菌三蒸水溶解。 7．RNA酶（降解RNA）配制方法：将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L的Tris·CL（PH7.5）、15mmol/LNaCL中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份存于–20℃。8．氯仿：异戊醇=24：1 100ml

动物基因组DNA的提取 DNA实验技术方法汇总

动物基因组DNA的提取 [实验原理] 在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动构基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150 kb，适用于L嘴菌体构建基因组文库和Southern分析。通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子质量较大的DNA 的琼脂糖凝胶电泳技术。 [仪器、材料与试剂] (一)仪器 1.台式离心机 2.玻璃匀浆器 3．高压灭菌锅 4．恒温水浴 (二)材料 1．1.5mL微量离心管 2．微量取样器和吸头 3．无菌过滤器(一次性) 4．10 mL注射器 5．鼠肝 6．三羟甲基氨基甲烷(Tris) 7.十二烷基硫酸钠(SDS) 8．乙二胺四乙酸(EDTA)

9．蛋白酶K 10．RNA酶 11．DNA相对分子质量标准物，DNA／EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物 (三)试剂 1、1.5 mol／L NaCl 2、0.5 mol／L Tris·HCI pH8.0 3．0.5 mol／L EDTA pH8.0 4．3 mol／L NaAc pH5.2 以上均高压灭菌。 5．蛋白酶K 10mg／mL配好后用一次性过滤器过滤，-20 保存(教师配制) 6.组织匀浆液100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／LEDTA(pH8.0) 7．酶解液200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH 8.0)，200~g／mL蛋白酶K，1％SDS 8．无DNA酵的RNA酶：将胰RNA酶溶解于10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol ／L NaCl溶液中，浓度l0mg／mL，于100℃水浴处理15min，以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，-20℃保存 9．TE缓冲液：10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0) 10．平衡酚(pH8.0)：氧仿：异戊醇=25：24：1<体积比) 11．氧仿：异戊醇=24：l(体积比) 12．5xTBE 5．4gTris，2．75g硼酸2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到100mL；13．6x上样缓冲液o．25％溴酚蓝，40％(W／V)蔗糖水溶液

动物组织细胞基因组DNA提取试剂盒使用说明

动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒使用说明货号：D1700 规格：50T/100T 保存：室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月，2℃-8℃保存时间更长。试剂盒内容：D1700-50T D1700-100T RNase A1ml1ml×2 蛋白酶K1ml1ml×2 溶液A10ml20ml 溶液B10ml20ml 漂洗液15ml15ml×2 洗脱液10ml20ml 吸附柱50个100个收集管50个100个说明书1份1份产品简介: 本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，提取组织和细胞的基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，能够高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。使用本试剂盒提取的基因组DNA可用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。

操作步骤：使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入休积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1、样品的处理： a、细胞：取1×106-1×107个悬浮培养细胞，12000rpm离心1mi n 收集细胞，贴壁细胞先用胰蛋白酶消化处理，再用预冷的PBS吹打成细胞悬液，然后12000rpm离心1min收集细胞，尽量除去上清，加200ul溶液A，振荡至彻底混匀。 b、组织：组织量不宜过大，一般不要超过25mg，可以使用匀浆器匀浆，最好用液氮研磨成粉末状，再用预冷的PBS或无菌水充分悬浮，然后12000rpm离心1min收集细胞，尽量除去上清，加200ul溶液A，振荡至彻底混匀。 2、向悬浮液中加入20ul(10mg/ml)的RNase A，55℃放置15min。 3、加入20ul(10mg/ml)的蛋白酶K，充分颠倒混匀，55℃水浴消化，细胞消化时间较短，组织消化时间较长，一般需要1-3个小时才能完成（鼠尾需要消化过夜）。消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止。消化完全的指标是：液体清亮及粘稠。 4、加入200ul体积溶液B，充分颠倒混匀，如出现白色沉淀，可放置于75℃15-30min，沉淀即会消失，不影响后续实验。如溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能导致提取的DNA量少及不纯，还有可能导致堵塞吸附柱。 5、加入200ul无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影

动物固体组织蛋白提取-.

动物固体组织蛋白提取-Protocol 2017-07-18 动物固体组织蛋白提取 Protocol 1、前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较快。 2、裂解液配制：RIPA：PMSF=100：1，现配现用。（1000ulRIPA+10ulPMSF）。置入4℃冰上。 3、抽蛋白（应冰上进行）： a、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。一般10ml管体系中加入：7-8粒磁珠、100mg组织、1mlRIPA+10ulPMSF、1 tablet Cocktail。 b、匀浆。手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。 c、将组织匀浆转入1.5ml的EP管中（eppendorf 管、离心管）。12000r/min 4°C 离心 15min。 d、离心后EP管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的EP管中。可-80℃保存。 4、蛋白浓度测定。 a、配工作液：溶液A：溶液B=50：1（200ul：4ul）。需测试复孔。标本X，则需A量=2*（