动物组织中的核酸提取与鉴定

动物组织中核酸的提取与鉴定

一、原理

根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离，然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离提纯的目的。

二、试剂

1.地衣酚（orcinol）试剂：

称取100mg地衣酚溶于100ml 浓盐酸中，再加入100mgFeCl3·6H2O，该溶液应在使用前新鲜配制。

2.二苯胺试剂：

称取1g二苯胺（经重结晶）溶入100ml冰醋酸中，再加入2.75ml浓H2SO4摇匀，冰箱内保存备用。

3. 0.14mol/L氯化钠溶液（内含0.01mol/L柠檬酸），250ml；

4. 1mol/L氯化钠溶液，250ml；

5. 95%乙醇（冷）；

6. 氯仿；

7. 异戊醇

三、器材

a)冷冻离心机（3000rpm）

b)组织捣碎机或组织匀浆器

c)不锈钢剪刀

d)冰浴

e)试管、试管夹

f)量筒、吸管

g)带塞比色管、带塞离心管

h)玻棒、烧杯

i)电炉等

三、方法

1. 制匀浆

将新鲜肝脏或冷冻肝脏称重后用冷的0.14mol/L氯化钠溶液（内含0.01mol/L柠檬酸）洗去血水，用不锈钢剪刀将肝脏剪成碎块，放入组织捣碎机中加入2倍体积的0.14mol/LNaCl 溶液（内含0.01mol/L柠檬酸）制备匀浆。

将匀浆置离心机中离心20min（3000rpm）。上层液倾出留待抽提RNA ，下层用二倍体积冷的1mol/LNaCl溶液抽提1h，待分离DNA核蛋白。

2. 核酸的抽提

2.1RNA的提取

0.14mol/L的NaCl抽提液（内含RNA核蛋白）加入等体积的氯仿和1/40体积的异戊醇，置带塞离心管中，振摇30min，此时提取液为乳白色混悬液，以3000rpm离心15min，离心物呈三层。

用滴管吸出上层清液，在低温下加入1.5~2倍的冷95%乙醇，并轻轻搅拌。低温放置15min，3000rpm离心10min，弃去上清液，即得RNA颗粒状沉淀，待定性。

2.2DNA的抽提

将抽提1h的1mol/LNaCl匀浆悬液以3000rpm离心20min，弃去沉淀，将其上清液倒入带塞的离心管中，加入等体积的氯仿及1/40体积的异戊醇振摇30min，离心20min。将其上清液加入2倍体积的冷95%乙醇，边加边摇，抽出玻棒，纤维状DNA就缠绕在玻棒上待定性。

每次都需采用冷冻离心。

3. 定性试验

3.1RNA的呈色反应

取2支干净试管，一管加入1.5ml RNA溶液，另一管加入蒸馏水1.5ml，向两管中加入3ml地衣酚试剂，于沸水中加热10min，由黄色变为绿色为阳性反应。

3.2DNA的呈色反应

取2支干净试管，一管加入1.5mlDNA溶液，另一管加入蒸馏水1.5ml，向两管中加入3ml二苯胺试剂，于沸水中加热10min，由乳白色变为蓝色为阳性反应。

五、注意事项

在提取分离纯化核酸时，为了保持核酸的完整性，防止核酸变性降解，操作时必须防止过酸或过碱。全部过程应在低温下(0℃左右)进行，必要时还需加入抑制剂，以抑制核酸酶的作用。

加氯仿、异戊醇后振摇要充分，但又不能太剧烈，以防DNA断裂。