实验十三动物组织核酸的分离鉴定和含量测定(精)
实验十三 动物组织核酸的分离、鉴定和含量测定
二苯胺显色法原理
DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间 的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶 核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成 ω-羟基-γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物 质，在595nm波长处有最大吸收。DNA在 40~400μg范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。 在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。
DNA标准曲线的制作和样品测定
管 试 剂 0 对照 DNA标准溶液,ml 0.0 蒸馏水，ml 二苯胺试剂,ml OD595 2.0 4.0 1 0.4 1.6 4.0 2 0.8 1.2 4.0 3 1.2 0.8 4.0 4 1.6 0.4 4.0 5 2.0 0 4.0 号 样品1 2.0 0 4.0 样品2 2.0 0 4.0
动物组织核酸的分离纯化及鉴定
1. 猪肝DNA和RNA的分离 2. 核糖和脱氧核糖的显色实验
3. 核酸的定量和纯度测定
核酸是一类生物高分子化合物，存在于一切生物体内， 是组成细胞的重要成分。它以与蛋白质结合的形式—— 核蛋白存在于细胞中，是生命的基本物质之一，具有储 存、复制生物体遗传信息的功能，也是蛋白质合成不可 缺少的物质，因此它对于生物体的生长、遗传、变异等 现象起着重要的决定作用。核酸分为两大类——核糖核 酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA) 。 核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖 或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核 苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖， 一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷 酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴 定。
DNA和RNA的结构
组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 β-D2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为β-D-核糖。
实验三 动物组织中核酸的提取与鉴定
2007-2
实验三 动物组织中核酸的提取与鉴定
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三、实验操作
（2）磷酸的鉴定 ）
管号 测定管 对照管 水解液 5%H2SO4 钼酸铵 10d _ _ 10d 5d 5d 氨基萘酚 磺酸 20d 20d 颜色变化 ? ?
放置3分钟，沸水浴 分钟 分钟， 放置 分钟，沸水浴4分钟，观察表较颜色差别 分钟
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实验三 动物组织中核酸的提取与鉴定
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二、实验原理
1.核蛋白的提取： 核蛋白的提取： 核蛋白的提取 三氯醋酸 肝组织匀浆 核蛋白沉淀 核蛋白沉淀
原因： 原因：三氯醋酸可沉淀蛋白质
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实验三 动物组织中核酸的提取与鉴定
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二、实验原理
2 .从核蛋白中提取核酸 从核蛋白中提取核酸
10%NaCl
核蛋白
核酸钠 + 蛋白质沉淀
原因： 溶液中： 原因：10%的NaCl溶液中：核酸的溶解度高 的 溶液中 蛋白质的溶解度低
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二、实验原理
2 .从核蛋白中提取核酸 从核蛋白中提取核酸
10%NaCl
核蛋白
核酸钠 + 蛋白质沉淀
95%乙醇 乙醇
核酸钠沉淀 核酸钠沉淀
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实验三 动物组织中核酸的提取与鉴定
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二、实验原理
3.核酸（DNA、RNA）成分的鉴定 核酸（ 核酸 、 ）
（3）核糖的鉴定 ） 浓硫酸 核糖 糠醛 3，5-二羟基甲苯 ， 二羟基甲苯 绿色化合物
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实验三 动物组织中核酸的提取与鉴定
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二、实验原理
3.核酸（DNA、RNA）成分的鉴定 核酸（ 核酸 、 ）
生化实验核酸实验报告
实验名称：动物组织中核酸的提取与鉴定实验日期：2023年11月15日实验目的：1. 学习和掌握动物组织中DNA和RNA的提取方法。
2. 了解核酸的组成成分，并进行鉴定。
3. 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质。
实验原理：核酸是生物体内重要的生物大分子，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。
DNA主要存在于细胞核中，而RNA主要存在于细胞质中。
本实验通过提取动物组织中的DNA和RNA，并对其进行鉴定，以了解核酸的基本特性。
实验材料：1. 动物组织（如肝组织）2. 提取试剂：酚/氯仿、Tris-HCl缓冲液、EDTA、NaCl、SDS、RNA酶、蛋白酶K、乙醇、异丙醇等3. 实验仪器：高速离心机、电热恒温恒湿箱、紫外可见分光光度计、凝胶成像系统、移液器、玻璃棒等实验步骤：一、DNA的提取1. 将动物组织剪碎，加入适量Tris-HCl缓冲液、EDTA、NaCl和SDS，充分混匀。
2. 加入蛋白酶K，置于55℃水浴中消化1小时。
3. 加入等体积的酚/氯仿，充分混匀，静置10分钟。
4. 12,000 r/min离心15分钟，取上清液。
5. 加入等体积的氯仿，充分混匀，静置10分钟。
6. 12,000 r/min离心15分钟，取上清液。
7. 加入2倍体积的95%乙醇，混匀，静置2小时。
8. 12,000 r/min离心10分钟，弃去上清液。
9. 用75%乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于适量Tris-HCl缓冲液中。
二、RNA的提取1. 将动物组织剪碎，加入适量Tris-HCl缓冲液、EDTA、NaCl和SDS，充分混匀。
2. 加入RNA酶和蛋白酶K，置于55℃水浴中消化1小时。
3. 加入等体积的酚/氯仿，充分混匀，静置10分钟。
4. 12,000 r/min离心15分钟，取上清液。
5. 加入等体积的氯仿，充分混匀，静置10分钟。
6. 12,000 r/min离心15分钟，取上清液。
7. 加入2倍体积的95%乙醇，混匀，静置2小时。
动物组织中核酸的提取及其组成成分的鉴定
加数滴使呈碱性
10
10
硝酸银
灰褐色沉淀
核糖鉴定
试剂(滴)
核酸水解液 5% H2SO4 3,5-二羟甲苯
管号
1#实验管
2#对照管
4
–
–
4
6
6
沸水加热5min,比较两管颜色.
核糖 浓酸 糖醛 + 3,5二羟甲苯
3H2O
绿色复合物
脱氧核糖鉴定
试剂(滴)
核酸水解液 5% H2SO4 二苯胺试剂
管号
1#实验管
RCF在离心管内不相同，靠转子外最大, 靠中心轴最小，有表可查。
离心机种类及用途
1、低速离心机 常规使用,台式,最大速度3 000~6 000r/min,
RCF可达6 000g。常用于收集细胞、细胞核或 叶绿体等较大的细胞器、抗原-抗体复合物等 粗颗粒沉淀。 2、高速离心机
较大立式，常有制冷系统。最高速率可达 25 000r/min、RCF达60 000g。用于分离微生 物细胞、线粒体、溶酶体等细胞器和蛋白质沉 淀物。
开 始 做 实 验 ！
亚细胞结构的分离
生物颗粒在离心场中所需离心加速度和时间
离心加速度 时间
沉降的组分
100g 4 000g 15 000g 30 000g 100 000g
5min 10min 20min 30min 3~10h
真核细胞 叶绿体 细胞碎片 细胞核 细菌、线粒体 溶酶体、细菌细胞碎片 核糖体
实验步骤
猪
3、超速离心机
一类速度非常高的离心机，最大转速 可超过30 000r/min，最大RCF可达600 000g ，用于沉淀核糖体、膜泡等小的细胞器和 生物大分子。具有精密的制冷、真空装置 4、微。量离心机
动物组织中核酸的提取与鉴定实验报告
动物组织中核酸的提取与鉴定实验报告
实验目的：
1. 了解动物组织中核酸的提取方法；
2. 掌握核酸鉴定实验的基本步骤；
3. 实验中验证提取的核酸是否具有一定的纯度。
实验原理：
动物组织中的核酸主要包括DNA和RNA两种类型，可利用
溶解细胞膜、蛋白质酶解、沉淀和洗涤等步骤提取核酸，并通过酶切鉴定分离所得核酸的类型。
核酸的鉴定主要通过比色、电泳或光谱等方式识别。
此外，核酸的纯度可通过测量260
nm和280 nm的光密度比值来评估。
实验步骤：
1.取动物组织，并将其切碎放入离心管中；
2.加入溶解液（如Tris-HCl缓冲液 pH 8.0），彻底溶解组织；
3.加入蛋白酶，使蛋白质完全酶解，生成核酸；
4.加入溶液（如EDTA），停止蛋白酶的作用；
5.加入酒精，将核酸沉淀下来；
6.用乙醇洗涤核酸沉淀，去除杂质；
7.将核酸用去离子水溶解，并进行测量；
8.通过酶切反应鉴定核酸的类型；
9.通过比色、电泳或光谱等方式识别核酸；
10.通过测量260 nm和280 nm的光密度比值来评估核酸纯度。
实验结果：
提取的核酸样品通过酶切反应鉴定为DNA。
通过比色、电泳
或光谱等方式识别，验证了核酸的存在。
通过测量260 nm和280 nm的光密度比值为1.8，表明核酸具有一定的纯度。
实验结论：
本实验成功提取了动物组织中的DNA核酸，并通过酶切反应鉴定了其类型。
通过比色、电泳或光谱等方式识别，验证了核酸的存在，并通过测量260 nm和280 nm的光密度比值评估了核酸的纯度。
动物组织中核酸的提取与鉴定
动物组织中核酸的提取与鉴定
一、生物大分子制备方法基本设计思路
流程：选材→破碎→抽提→浓缩→分离纯化 破碎方法：机械、物理、化学、生物 浓缩方法：沉淀（盐析，可逆变性，有机溶剂等） 生化实验三大分离技术： 离心技术 层析技术 电泳技术
二、实验方法及设计流程
1、提取（3课时） 猪肝 → 匀浆→ 三氯醋酸沉淀核蛋白→ 离心（3200-3500 rpm，5min）
复习与计思路， 写出核酸提取制备的设计原理。
2、样品如何判断是DNA、还是RNA,反应条 件如何？
3、造成产量偏低的原因，从提取过程分析。
动物组织中核酸的提取与鉴定实验方案
实验原理
本实验运用盐溶液法用动物肝脏分离制备DNA 核酸在细胞内都与蛋白质结合成核蛋白，要分离核 酸必须使核酸与蛋白质分离并除去蛋白质。 已知在0.14mol/LNaCl溶液中核糖核蛋白溶解度最 大，而脱氧核糖核蛋白溶解度最小，在1mol/LNaCl 溶液中脱氧核糖核蛋白溶解度增大，核糖核蛋白的 溶解度则明显下降，根据这种特异性即可把这两种 核蛋白分开
动物猪肝猪羊兔组织捣碎机离心机量筒烧杯锥形瓶玻璃棒离心管称量瓶滴管等实验步骤取动物肝脏浸入预先在冷水浴中冷却的014mollnacl001molledta溶液反复洗涤几次直至组织无血为止将洗净的组织剪成碎块称取10g加入20ml014mollnacl001molledta溶液在组织捣碎机中匀浆44000rmin离心15分钟后弃上清液在沉淀中加入4倍体积的低温014mollnacl001molledta溶液搅匀后离心弃上清液如此反复23次保留沉淀实验步骤将沉淀物悬于5倍体积的014mollnacl001molledta溶液中搅匀边搅拌边滴加sds溶液直至sds的最终浓度达10gl为止然后加入固体nacl使nacl最终浓度达1moll继续搅拌3045min以确保nacl全部溶解将上述混合液倒入一个具有塞的锥形瓶中加入等体积的氯仿异戊醇振荡10min在室温3000rmin离心10min此时可见3层小心吸取上层水相记录体积放入锥形瓶中再加入氯仿异戊醇混合物振荡离心如此反复抽提数次直至界面处不出现蛋白凝胶为止最后一次离心后小心吸取上层溶液计量体积放入干燥小烧杯加入2倍体积的预冷95乙醇产生沉淀后4000rmin离心10min弃去上清液沉淀即为dna实验步骤加2倍体积预冷乙醇如用滴管滴加边加边慢慢顺一个方向在烧杯中搅动有粘稠维丝物缠在玻璃棒上直至再无丝状物缠上为止将玻璃棒上的dna取下依次用75乙醇95无水乙醇洗一次放入干净量瓶中至于干燥器中抽干十二烷基硫酸钠sds组织捣碎机离心机宝山壁画宝山壁画是引人注目的昂贵文物
动物组织核酸的提取与鉴定
动物组织核酸的提取与鉴定一.目的要求（1）了解生物大分子制备的基本技术。
（2）学习和掌握用盐溶法从动物组织提取分离DNA的原理和操作技术。
（3）学习和掌握鉴定核酸的方法。
二. 材料与用品材料与试剂实验对象动物肝脏仪器：匀浆器（研钵）、冰盒、离心机、电磁炉、玻棒、冰箱。
试剂：0.9%生理盐水、20%三氯醋酸、95%乙醇、10%NaCL溶液。
三. 原理动物含有丰富的DNA，可作为提取DNA的良好材料，在细胞核内，核酸通常与某些组织蛋白质结合成复合物，即以脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白的形式存在。
在不同浓度的盐溶液中，脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白的溶解度有很大差别。
当NaCl浓度为0.14mol/L时，脱氧核糖核蛋白的溶解度极低，仅为其在纯水中溶解度的1%，而核糖核蛋白的溶解度相当大，利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与核糖核蛋白以及其他杂质分开。
提取出来的脱氧核糖核蛋白须除去蛋白质。
当脱氧核糖核蛋白与氯仿-异戊醇混合液一起振荡时，蛋白质变性而与核酸分开，蛋白质沉淀夹在水相和有机相之间，DNA溶于在水相中。
经过分离后，再用乙醇将水相中的DNA沉淀出来。
为了防止脱氧核糖核酸酶（DNase）的作用而引起DNA降解损失，在用于提取的缓冲液中均含有0.001mol/L的EDTA（乙二胺四乙酸）螯合剂，以除去保持DNase活性所必须的Mg2+。
为了防止DNA的变性，操作尽可能在低温下进行。
四. 内容与方法1. 提取DNA（1）取动物肝脏在冰浴上去除脂肪和结缔组织，切成小块，称取20g，加入60mL预冷的0.14mol/L NaCl – 0.01 mol/L EDTA溶液，在组织捣碎机中高速匀浆5~10min。
（2）匀浆后的组织糜于4℃、10000r/min离心10min，弃去上清液。
在玻璃匀浆器中，用4倍体积的低温0.14mol/L NaCl – 0.01 mol/L EDTA溶液洗涤沉淀，然后按上述操作进行离心，弃去上清液。
动物组织中的核酸提取与鉴定
动物组织中核酸的提取与鉴定一、原理根据核糖核蛋白与脱氧核糖核蛋白在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离，然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离提纯的目的。
二、试剂1.地衣酚（orcinol）试剂：称取100mg地衣酚溶于100ml 浓盐酸中，再加入100mgFeCl3·6H2O，该溶液应在使用前新鲜配制。
2.二苯胺试剂：称取1g二苯胺（经重结晶）溶入100ml冰醋酸中，再加入2.75ml浓H2SO4摇匀，冰箱内保存备用。
3. 0.14mol/L氯化钠溶液（内含0.01mol/L柠檬酸），250ml；4. 1mol/L氯化钠溶液，250ml；5. 95%乙醇（冷）；6. 氯仿；7. 异戊醇三、器材a)冷冻离心机（3000rpm）b)组织捣碎机或组织匀浆器c)不锈钢剪刀d)冰浴e)试管、试管夹f)量筒、吸管g)带塞比色管、带塞离心管h)玻棒、烧杯i)电炉等三、方法1. 制匀浆将新鲜肝脏或冷冻肝脏称重后用冷的0.14mol/L氯化钠溶液（内含0.01mol/L柠檬酸）洗去血水，用不锈钢剪刀将肝脏剪成碎块，放入组织捣碎机中加入2倍体积的0.14mol/LNaCl 溶液（内含0.01mol/L柠檬酸）制备匀浆。
将匀浆置离心机中离心20min（3000rpm）。
上层液倾出留待抽提RNA ，下层用二倍体积冷的1mol/LNaCl溶液抽提1h，待分离DNA核蛋白。
2. 核酸的抽提2.1RNA的提取0.14mol/L的NaCl抽提液（内含RNA核蛋白）加入等体积的氯仿和1/40体积的异戊醇，置带塞离心管中，振摇30min，此时提取液为乳白色混悬液，以3000rpm离心15min，离心物呈三层。
用滴管吸出上层清液，在低温下加入1.5~2倍的冷95%乙醇，并轻轻搅拌。
低温放置15min，3000rpm离心10min，弃去上清液，即得RNA颗粒状沉淀，待定性。
动物组织中核酸的提取与鉴定
1、磷酸：能与钼酸试剂作用生成磷 钼酸，后者在还原剂的作用下。还 原成蓝色的钼蓝。 2、嘌呤碱：能与苦味酸作用形成针 状结晶 3、戊糖 （1）核糖经浓盐酸或浓硫酸作用生 成糖醛，后者和3，5-二羟甲苯缩 合而成绿色化合物。 （2）脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟 （基）-γ-酮（基）戊醛，它与二 苯胺作用生成蓝色化合物
动物组织中核酸 的提取与鉴定
实训原理
实训试剂及 仪器
实训步骤
动物组织细胞中的核酸大部分与蛋白质 结合形成核蛋白。可用三氯醋酸沉淀出核 蛋白，并用95%乙醇加热除去沉淀上的脂 类杂质，然后用10%氯化钠从核蛋白上分 离出核酸（以钠盐形式存在），加入乙醇 可以析出。
析出的核酸均有核苷酸组成，在单核苷酸 中含有磷酸、有机碱或戊糖。核酸经硫酸 水解后可游离出这三类物质，此三类化合 物可用下列方法鉴定：
核糖的鉴定 取中试管2支，分别标明测定管 与对照管，然后依次加入下列各试剂。
管号
测定管 对照管
水解液
4滴 -
5%H2SO4
4滴
3 ， 5- 二 羟 甲苯试齐
6滴 6滴
实验步骤
脱氧核糖的鉴定 取长试管2支，分别标明测 定管与对照管，然后依次加入下列各试剂
管号 测定管 对照管
水解液 20滴 -
5%H2SO4 -
实验步骤
（三）核酸水解 在有核酸沉淀的离心管中加入蒸 馏水2ml。振摇至沉淀溶解后， 加入10％H2SO42mL摇匀，于 沸水浴中加热10分钟，即得核酸 水解液，用流水冷却后进行定性 试验。
实验步骤
（四）RNA与DNA成分的鉴定 1、嘌呤碱的鉴定 取中试管2支，分别标明测定管
与对照管，依次加入下列各试剂。
实验步骤
（二）分离提取 1、取全部匀浆于离心管内，加20%三氯醋酸5ml，用 玻璃棒搅匀，静置3分钟后，以3000转/分离心10分钟。 2、弃上清液，沉淀中加95％乙醇5ml充分混匀，在水 浴中加热至沸2分钟，注意酒精沸腾后将火关小，避免 酒精蒸汽燃烧。冷却后离心。 3、倾去上层乙醇液。于沉淀中再加入10％NaCl溶液 4ml，置沸水浴中8分钟，并用玻棒不断搅拌，取出； 冷却后再离心。 4、将上清液倾入另一离心管中，再离心一次，除去可 能存在的微量残渣，将上清液倒入一试管。 取等量95％的乙醇，逐滴加入到上清液中，即可见白 色沉淀逐渐出现，静置10分钟后。将其内容物摇匀后倒 入一圆底离心管中，离心5分钟，将上液倾去，所得白 色沉淀即为核酸钠。
实验十三动物组织核酸的分离鉴定和含量测定
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果分析 • 实验总结与讨论
01
实验目的
掌握动物组织核酸的分离方法
01
掌握动物组织中DNA和RNA的分离原理及操作步骤。
02
了解不同动物组织中核酸的分布和含量差异。
03
掌握核酸分离过程中的注意事项和技巧，提高实验 效率。
3
了解不同测定方法的优缺点和应用范围，以提高 测定的准确性和可靠性。
02
实验原理
动物组织核酸的分离原理
动物组织中核酸的提取
动物组织中的核酸通常与蛋白质和其 他生物分子紧密结合，需要通过一系 列的分离步骤将其从其他组分中分离 出来。这些步骤包括细胞破碎、离心 分离、洗涤和沉淀等。
核酸的纯化
为了获得高纯度的核酸，需要使用各 种化学和物理方法去除杂质，如酚-氯 仿抽提、乙醇沉淀和离子交换等。
Northern杂交
利用标记的探针与核酸进行杂交，通过放射自显影或化学发光等方法 测定杂交信号强度，推算出核酸的含量。
04
实验结果分析
核酸分离结果分析
核酸分离纯度
通过观察电泳图谱，可以判断核酸是否成功分离，以及是否存在 杂质和降解。
核酸得率
通过称重和测量体积，可以计算出分离得到的核酸得率，以评估 实验效率。
对于病毒核酸，可以通过限制性 酶切和电泳检测，确定病毒的种 型。
核酸含量测定结果分析
吸光度测定
通过紫外可见分光光度计测定核 酸溶液的吸光度，可以计算出核 酸的浓度。
荧光定量PCR
利用荧光标记的特异性探针，通 过荧光信号的累积进行实时定量 检测，可以准确测定核酸的含量。
动物组织中核酸的提取与鉴定实验报告
动物组织中核酸的提取与鉴定实验报告1. 引言核酸（DNA和RNA）是生物体内存储遗传信息和调控基因表达的重要分子。
对于研究生物的遗传特征和进化过程，核酸的提取与鉴定是必不可少的实验步骤。
本实验旨在通过提取动物组织中的核酸，使用常用的鉴定方法分析核酸的质量和纯度。
2. 实验原理核酸提取与鉴定的基本原理是将动物组织中的核酸从其他的细胞组分（如蛋白质、唾液等）中分离出来，并通过吸光度测定和凝胶电泳等方法进行核酸的定性和定量。
2.1 核酸提取核酸提取的步骤包括细胞破碎、蛋白质的去除和核酸的沉淀。
常用的核酸提取方法包括酚-氯仿法、柱式提取法和商业试剂盒法等。
2.2 核酸定性和定量核酸的定性主要通过凝胶电泳进行，通过核酸带的迁移速度和分子量，可以初步判断核酸的纯度和是否受到降解。
核酸的定量则是通过吸光度测定，利用核酸特征的吸收峰波长（260 nm）测定核酸的浓度。
3. 实验材料与方法3.1 实验材料•动物组织样品•细胞破碎缓冲液•蛋白酶•酚-氯仿提取液•乙醇•TE缓冲液•焦亚硫酸铵•乙酸•0.8%琼脂糖凝胶3.2 实验步骤1.将动物组织样品切碎并加入细胞破碎缓冲液，用超声波破碎细胞壁。
2.加入蛋白酶进行蛋白质的消化。
3.加入酚-氯仿提取液，离心分离上层的核酸。
4.将上层的核酸转移到新离心管中，加入等体积的冷乙醇沉淀核酸。
5.离心沉淀的核酸，去除上层的乙醇并用TE缓冲液重悬核酸。
6.使用吸光度计测定核酸的纯度和浓度。
7.进行凝胶电泳，观察核酸的迁移带和分子量。
4. 结果与分析4.1 核酸提取结果通过核酸提取实验，成功从动物组织中提取到了核酸。
提取的核酸样品呈现无色透明的状态，说明核酸净化得较好。
4.2 核酸定性和定量结果将提取得到的核酸样品进行凝胶电泳，观察到了明显的核酸带。
通过与分子量标准品的比较，可以初步判断核酸的分子量范围是否正常。
通过吸光度测定，确定了核酸的浓度。
5. 结论通过本实验，成功提取到了动物组织中的核酸，并通过凝胶电泳和吸光度测定等方法对核酸进行了定性和定量分析。
动物组织中核酸的提取与鉴定(DNA&RNA)
实验一动物组织和细胞中核酸的提取和测定第一部分动物组织和细胞中DNA和RNA的提取【实验目的】学习从组织和细胞中提取DNA和RNA的方法【实验原理】1.从动物组织和细胞中提取DNADNA存在于细胞核中。
提取DNA的方法首先需要温和裂解细胞及溶解DNA的技术，接着需采用化学和酶学方法，除去杂蛋白、RNA及其他的大分子。
本实验在EDTA（螯合二价阳离子以抑制Dnase）存在的情况下，用蛋白酶K消化真核细胞和组织，用去垢剂（如SDS，十二烷基磺酸钠）溶解细胞膜并使蛋白质变性。
核酸通过有机溶剂抽提得以纯化，污染的RNA通过RNase消化清除。
这个方法可产生十微克至数百微克的DNA，适用于标准琼脂糖凝胶上的Southern分析，可用作PCR 反应的模板，以及用于构建基因组DNA文库。
2.从动物组织和细胞中提取RNARNA存在于细胞质及核中，是一种极易降解的核酸分子。
为了快速从细胞中分离完整的RNA，许多方法都用到了高浓度的强变性剂硫氰酸胍使细胞破裂。
高浓度的硫氰酸胍还使细胞内的各种RNA酶失活，使释放出的RNA不被降解。
细胞裂解后存在于裂解溶液内的有RNA，核DNA，蛋白质和细胞残片，通过酚，氯仿等有机溶剂处理，离心，使RNA最终与其它细胞组分分离开来。
【实验材料】1.实验器材材料：小牛胸腺或动物肝脏；研钵和研棒，匀浆机，橡胶刮棒，低温冷冻离心机，恒温水浴，宽口移液管，锤子，塑料袋，涡旋等。
2.实验试剂(1)裂解缓冲液：10mmol/L Tris-Cl (PH8.0)，0.1mol/L EDTA (PH8.0)，0.5%(m/V) SDS，20µg/mg无Dnase的胰RNase，裂解缓冲液的前三种成分可预先混合并于室温保存。
RNase在用前适量加入。
(2)溶液D(变性液)：4 mol/L 硫氰酸胍，25mmol/L 柠檬酸钠. 2H20，0.5%(m/V)月桂基肌酸钠，0.1mol/L β-巯基乙醇，将250g硫氰酸胍、0.75mol/L(PH7.0)柠檬酸钠17.6ml和26.4ml10%(m/V )月桂基肌酸钠溶于293 ml水中.加入搅拌子于磁力搅拌器上65℃混匀,直至完全溶解。
动物基因组DNA、总RNA的提取及含量测定
地衣酚 (orcinol)，又称“3，5-二羟基甲苯”、“5-甲基间苯二酚”、“苔黑酚”。化学 式C7H8O2.H2O。
原理：当RNA与浓盐酸共热时，即可发生降解，形成核糖继而转变成糠醛，后者与地衣 酚反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物，反应在670nm处有最大吸收峰， RNA浓度在20 ~ 200μg/mL范围内，光吸收与RNA浓度成正比。
等
思考题
RNA 提取方法有几种？有什么优 缺点？ RNA 提取过程中应注意什么？
DNA的提取及含量测定
在动植物中，小牛胸腺、动物肝脏、鱼类精子，植物种子的胚 中都含有丰富的DNA； 微 生 物 中 ， 面 包 酵 母 含 4% ， 啤 酒 酵 母 含 6% ， 大 肠 肝 菌 含 9%~10%。 本实验：将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸 钠（SDS）溶液，使DNA与蛋白质分离开。加入固体氯化钠使 其浓度达到1mol/L，使DNA溶解。加氯仿-异戊醇去除蛋白质， 也可重复该步操作得较纯DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。
• 除杂质：加等体积氯仿-异戊醇混合液，充分震荡10分钟， 8000 r/min离心7分钟，取上 层液量好体积，倒入烧杯中（离心管）（现象？），加同体积的氯仿-异戊醇混合液， 重复上次操作（现象？）。直至界面不出现蛋白凝胶为止；
• 沉淀：准确量取上清液体积， (1/10体积3mol/L NaAC溶液), 加2倍体积95％冷乙醇，搅 拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝状物出现，约10-15分钟，离心8000 r/min离心7分 钟，得白色沉淀（质量？）；
生物化学实验II
动物基因组DNA、总RN 的提取及含量测定
目的要求
• 学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技 术；
实验十三 动物DNA提取及鉴定
实验十三动物DNA提取及鉴定一、实验目的1．用改变盐浓度和酒精的方法提取DNA；2．用二苯胺法鉴定DNA的特性。
二、实验准备（按每小组2人计算）1．仪器（通用）微量进样器（各种型号）、搅拌机2、组织捣碎机2、冰箱1、DNA检测仪1、水浴锅1 2．器械镊子2、玻璃棒2、滴管2、量筒（100ml 2个，250ml 2个，500ml2个，1000ml2个）、烧杯(100ml 1个；50ml 2个；500ml 2个)、试管（20ml 2个）、试管夹2、带盖离心管（50ml,2个）。
3．药品95%酒精（冰冷预置24hr）4瓶蒸馏水5L0.1g/L柠檬酸钠溶液2000ml2mol/LHCl 4000ml；0.015mol/L HCl 2000ml二苯胺试剂（1g二苯胺+2.7ml 浓H2SO4，定溶于100ml冰醋酸中）现配现用。
4．耗材纱布4卷、滤纸4盒5．材料鸡血细胞液（每大组30人一只鸡的新鲜血液）三、实验原理当NaCl的浓度为2mol/L时，它可溶解DNA；当NaCl的浓度为0.14mol/L时，DNA 可从液体中析出。
同时DNA不溶于酒精，而细胞中的某些物质则可溶于酒精。
以此原理，可提纯DNA。
四、实验步骤1．制备鸡血细胞：取0.2g/L柠檬酸钠溶液（抗凝剂）100ml，置于500ml烧杯中。
将宰杀活鸡流出的鸡血(约180ml)注入烧杯中，同时用玻璃棒搅拌，使血液于柠檬酸钠溶液充分混合，以免凝血。
然后，将血液倒入离心管中，用1000rpm离心2min，此时血细胞沉淀于离心管底部。
实验时，用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞。
2．提取鸡血细胞的细胞核物质将制备好的鸡血细胞液10ml注入到50ml烧杯中，向烧杯中加入蒸馏水20ml，同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌5min，使血细胞加速破裂。
然后，用放有单层纱布的漏斗将血细胞过滤至500ml烧杯中取其滤液。
3．溶解细胞核内的DNA将2mol/L的氯化钠溶液20ml加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1 min，使充分混匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态。
动物组织中核酸的提取
③、将上清液倒入小烧杯内，取等量的95％乙醇， 逐步滴加小烧杯内，边加边摇匀，即可见到白色沉 淀逐渐出现，静置10分钟后，将小烧杯内容物倒入 离心管，离心（3500转每分钟，2分钟）。 ④、倾倒上清液即得到核酸钠的白色沉淀。在含核 酸的离心管内，加入5％硫酸，4ml，用玻璃棒搅匀， 在沸水溶液中加热8分钟即可。 3、RNA与DNA的成分的鉴定。
1、核糖的鉴定：
试剂（滴）水解液 5%硫酸 — 4 3,5-二羟甲苯 观察变化 6 6
测定管
4 —
对 5%硫酸 — 20 二苯胺试剂 观察变化
测定管
20 —
30 30
对照管
动物组织中核酸的提取与分离
制作人： 制作人：陈蓉蓉
实验原理
实验器材
实验步骤
实验结果与记录
实验原理
动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖孩酸(DNA)大部分 与蛋白质结合形成核蛋白。核蛋白可被三氯醋酸沉淀，再用95 ％乙醇加热可以除去附着在沉淀上的脂类杂质，然后用10％ NaCl溶液提取出核酸的钠盐，加入醇可使核酸钠沉淀析出。 先用水由动物肝中提出核蛋白，再籍酚将核酸与蛋白质之间的 结合键断裂，并用乙醚抽提去蛋白质及其它杂质，最后用乙醇 将核酸沉淀。 核酸(RNA、DNA)可被硫酸水解产生磷酸。有机碱（嘌岭、嘧 啶）和戊糖（核糖、脱氧核糖）。 此三类化合物可用下列方法鉴定：
实验结果与记录
1、嘌呤碱的测定：
试剂（滴）水解液 5%硫酸 — 20 浓氨水 5%硝酸银 观察变化 10 10
测定管
20 —
至碱水
对照管
至碱水
实验结果与记录
1、磷酸的测定：
试剂（滴）水解液 5%硫酸 钼酸铵试剂 氨基萘氛磺酸 观察 — 10 5 5 20 20
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实验目的：
学习并掌握紫外分光光度法和定糖二苯胺显色法பைடு நூலகம்
测定DNA含量和纯度的基本原理
DNA测定的方法原理
紫外分光光度法（此法要求核酸纯度很高，1个Abs 相当于50ug/ml双螺旋DNA,除了定量测定以外还可 进行核酸纯度的检测，A260/A280比值，纯的DNA为 1.8，RNA为2.0，样品中含有蛋白质和苯酚时， A260/A280 比值降低。） 定糖法（DNA糖部分为脱氧核糖，RNA糖部分为核糖， 分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法） 定磷法（核酸的磷酸部分）
二苯胺显色法原理
DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的 糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷 酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基 -γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在 595nm波长处有最大吸收。DNA在40~400μg范围内，光 吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛， 可以提高反应灵敏度。
实验内容
DNA：1ml SC溶液溶解上次提取的DNA样品，然后转移到 50ml离心管中，用9ml0.01M NaOH溶液溶解。 A260测定:以H2O作为空白，取上清测A260值后确定稀释 倍数，使A260值在2.0左右（DNA此时的浓度约为 100ug/ml。（由于二苯胺法的测定范围是40400ug/mlDNA，所以DNA浓度如果太小会影响测定结果） 核酸含量（ug/ml）=样品A260X稀释倍数/0.02 (0.022) A280测定： A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8，RNA为 2.0。如果样品中混有RNA，则比值大于1.8；如果样品中 混有蛋白质，则比值小于1.8。
DNA含量计算
DNA含量计算：以样品的光密度，根据标准曲线计算出 相对应DNA含量。并同紫外法测定的值进行比较。
附 注：二苯胺试剂具有腐蚀性，且二苯胺反应产生的 蓝色不易褪色，操作中应防止洒出，比色时，比色杯 外面一定要擦干净。
按上表加完各试剂后，充分混匀。于60℃水浴中保温1h，冷却后于 595nm波长处以0管为空白调零，测定各管光密度（OD595nm）。以DNA 的含量为横坐标，光密度（吸收值）为纵坐标，绘制标准曲线。
注： 待测溶液中的DNA含量应调整至标准曲线的可读范围内。 样品1和样品2为不同稀释倍数的DNA溶液。
DNA标准曲线的制作和样品测定
管 试 剂 0 对照 2.0 4.0 1 0.4 1.6 4.0 2 0.8 1.2 4.0 3 1.2 0.8 4.0 号 4 1.6 0.4 4.0 5 2.0 0 4.0 样品1 2.0 0 4.0 样品2 2.0 0 4.0
DNA标准溶液,ml 0.0 蒸馏水，ml 二苯胺试剂,ml OD595