11动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定
实验一-哺乳动物基因组DNA的提取及纯化
二、实验原理 基因组DNA的特性：分子量较大、易断
如何保证DNA分子的完整性
DNA抽提思路：
破碎组织细胞 去除细胞内杂质
匀浆或液氮研磨 蛋白、多糖、脂类、RNA和小分子物质
所提取的DNA片段的大小：100 ～150kb
纯化DNA
、实验原理
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
鲁东大学 生命科学学院 四、操作步骤
基因组DNA的提取：
School of Life Sciences
0.1g猪肝，冰冷生理盐水洗3次，剪碎 转入玻璃匀浆器中，加入1mL匀浆液，匀浆至无组织块（冰上操作） 将匀浆液转入1.5 mL小指管， 加入蛋白酶K20 uL（20mg/mL），颠倒混匀 650C 恒温水浴锅中水浴30min 12000rpm，离心5min，取上清移入另一离心管
超净台中干燥后加 100～200uL TE, 40C溶解过夜，-200C保存 （可进一步通过凝胶电泳检测所获取基因组DNA质量）
鲁东大学 生命科学学院
五、注意事项
1.肝的处理时间不宜过长；
School of Life Sciences
2.加入细胞裂解液前，细胞需均匀分散，以减少DNA团块形成； 3.提取的DNA不宜过分干燥，否则会导致DNA溶解困难。
DNA纯化
加等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀，冰上平倒静置10min 40C，12000rpm离心10min，用扩口枪头取出上清
鲁东大学 生命科学学院
School of Life Sciences
上清加等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀 40C,12000rpm，离心10min，用扩口枪头取上清 上清加1/10体积的3mol/L NaAc（pH5.2)和加2倍体积的无水乙醇 慢慢混匀，-200C静置20min 12000rpm离心10min，弃上清 沉淀用1mL 70%冷乙醇洗两次，每次12000rpm离心10min，弃上清
动物基因组DNA的分离和琼脂糖凝胶电泳
每组取1 μL 、2 μL DNA样品，加1 μL电泳上样缓冲液 （含溴酚蓝），少量的水（9、8 ul），混匀后加样于琼 脂糖凝胶孔内。 电泳（小胶100-120V，大胶150-180V）：使DNA移入琼 脂糖胶内。一般为溴酚蓝迁移至中间即可停止电泳。 用短波紫外线（254 nm）进行拍照，比较样品DNA与 DNA标准品（marker）的荧光强度（一般最亮的条带为 750bp，上样5 ul约100 ng），并计算出待测样品中DNA 的浓度。 如果DNA已经降解，DNA的带就会拖尾巴，或出现弥散 性分布，而不能形成清晰、紧凑的带纹，这样的DNA样 品不能用于进一步研究。
ห้องสมุดไป่ตู้
每小组取1.5 ml EP管，加入上述消化细胞液600ul ，加 入等体积酚／氯仿／异戊醇，缓慢颠倒离心管使两相均匀 混合形成乳浊液，12000 r/min，4℃离心10 min。 小心吸出EP管中的上层液体，即为含DNA的水相，注意 不要吸中间界面上一层厚的白色物质（蛋白质沉淀）。然 后加入等体积氯仿／异戊醇，12000 r/min，4℃离心10 min。(如果界面或水相中含蛋白质沉淀较多，可重复操作) 小心吸出上层含DNA的水相，加入1/10体积NaAc，充分 混匀，然后加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，置-20℃ 冰箱约2 h。 12000 r/min，4℃离心10 min，弃上清液，得到的白色 沉淀。加入1 mL 70％冷乙醇洗涤，继续离心，获得沉淀， 室温干燥。加入50 L TE缓冲液溶解，即可得到基因组 DNA。-20℃冰箱保存。 如果要对提取的DNA进行完整性鉴定，可通过琼脂糖凝 胶。方法是取1 l溶解的DNA样品，在1％的琼脂糖凝胶 中进行电泳，用溴化乙锭（或Goldenview）染色观察结 果。
动物基因组DNA的提取
动物基因组DNA的提取[实验原理]在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动构基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150 kb，适用于L嘴菌体构建基因组文库和Southern分析。
通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子质量较大的DNA 的琼脂糖凝胶电泳技术。
[仪器、材料与试剂](一)仪器1.台式离心机2.玻璃匀浆器3．高压灭菌锅4．恒温水浴(二)材料1．1.5mL微量离心管2．微量取样器和吸头3．无菌过滤器(一次性)4．10 mL注射器5．鼠肝6．三羟甲基氨基甲烷(Tris)7.十二烷基硫酸钠(SDS)8．乙二胺四乙酸(EDTA)9．蛋白酶K10．RNA酶11．DNA相对分子质量标准物，DNA／EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物(三)试剂1、1.5 mol／L NaCl2、0.5 mol／L Tris·HCI pH8.03．0.5 mol／L EDTA pH8.04．3 mol／L NaAc pH5.2以上均高压灭菌。
5．蛋白酶K 10mg／mL配好后用一次性过滤器过滤，-20 保存(教师配制)6.组织匀浆液100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／LEDTA(pH8.0)7．酶解液200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH 8.0)，200~g／mL蛋白酶K，1％SDS8．无DNA酵的RNA酶：将胰RNA酶溶解于10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol ／L NaCl溶液中，浓度l0mg／mL，于100℃水浴处理15min，以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，-20℃保存9．TE缓冲液：10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0)10．平衡酚(pH8.0)：氧仿：异戊醇=25：24：1<体积比)11．氧仿：异戊醇=24：l(体积比)12．5xTBE 5．4gTris，2．75g硼酸2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到100mL；13．6x上样缓冲液o．25％溴酚蓝，40％(W／V)蔗糖水溶液14．λDNA／EcoRI+／HindⅢ相对分于质量标准物片段(bP)21 227，5148，4 973，4 268，3 530，2 027，1 904，1 584，1 315，947，831，564，125[实验步骤]本实验在无液氮的条件下，铡备鼠肝DNA，与有液氮条件下相比，产量和质量都有所下降。
动物组织基因组DNA提取
动物组织DNA提取1样品预处理取新鲜组织25-50mg（组织不宜过多，否则裂解不完全堵塞离心柱），组织剪碎或者切成小块，放入预冷研钵，快速加入液氮用力研磨，或直接放入匀浆器中匀浆。
冻存组织同样使用研钵研磨或匀浆器快速用力研磨或匀浆（冻存组织避免反复冻融，使细胞破碎，内源酶外泄影响基因组DNA提取）2.加入100ulPBS到研磨好的样品中，样品均匀悬浮于PBS3.加600ul的Lysis Buffer，颠倒混匀，如需消化RNA，可加入20ulRNase A，颠倒混匀，室温放置5min4.加入10ul ProteinaseK，混匀，56度水浴45-60min，（颠倒混匀数次，裂解完全液体则清亮粘稠，此步骤可过夜）5 .12000rpm 离心10min，上清转入新的离心管，加800ul无水乙醇，混匀6.液体分次转入离心柱（一次加不完可分次加入），12000rpm 离心1min，弃废液。
7.加入700ulWash bufferA（用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm 离心30s-1min，弃废液。
8. 加入700ulWash bufferB（用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm 离心30s-1min，弃废液。
9.加入500ulWash bufferB，12000rpm 离心30s-1min，弃废液。
10.再次12000rpm 离心2min，将离心柱置于心得离心管中，打开离心柱盖，于室温或37度恒温箱放置5-10min，直至无明显乙醇味。
11.在硅基质膜中央加入50-200ulTEbuffer（事先预热55-65度）置于室温2-5min，12000rpm 离心30s。
12. 离心得到的溶液再次加入离心柱中，室温放置2min，12000rpm 离心2min，所得溶液为纯化后的基因组DNA.纯化效果检测：取2-5ulDNA产物，0.7%agarose电泳检测DNA分子的完整性和紫外分光光度计检测浓度和纯度。
动物组织细胞基因组DNA提取
动物组织细胞基因组DNA提取一、实验原理真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组DNA。
真核生物的DNA 是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。
提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。
在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA 分子完整地分离出来。
二、仪器及试剂1. 仪器：恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）2. 试剂：（1）细胞裂解缓冲液：Tris (pH8.0) 100 mmol/LEDTA (pH 8.0) 500 mmol/LNaCL 20 mmol/LSDS 10%胰RNA酶20ug/ml（2）蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。
（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。
（4）酚?氯仿?异戊醇（25:24:1）、（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。
三、操作步骤1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。
置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。
在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。
于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。
动物肝脏DNA提取和鉴定
整个操作步骤应尽量简化，缩短实验过程，减少核酸变性、降解、机械切割的机会。
核酸提取过程中的注意事项：
01
加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的DNA。
02
保存：将DNA于滤纸上干燥，溶于1mlTE中低温保存。
03
纯的DNA样品的获得
琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。 琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。琼脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶，电泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比琼脂少，电渗作用降低，因而分离效果明显提高。
溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10ng甚至更少的DNA。
01
02
03
琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素
（1）核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 凝胶中，DNA片段迁移率与DNA分子大小(碱基对的对数)成反比(≤ 20kb) ，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。 （2）核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为：闭环DNA>直线DNA>开环的双链环状DNA. （3）不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 琼脂糖浓度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线状DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-0.2 2-0.1 注：DNA片段在5-500bp之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行电泳分离。
动物基因组dna_rna 提取及含量测定
工业上常用稀碱和浓盐酸法提RNA，用这 ， 工业上常用稀碱和浓盐酸法提 两种方法提取的核酸均为变性RNA。主要 两种方法提取的核酸均为变性 。 用于制备核苷酸的原料。其工艺较简单， 用于制备核苷酸的原料。其工艺较简单， 浓盐法是用10％氯化钠的溶液， 浓盐法是用 ％氯化钠的溶液，在90摄氏 摄氏 度提取3—4小时，冷却，离心，上清液乙 度提取 小时，冷却，离心， 小时 醇沉淀RNA。稀碱法用 醇沉淀 。稀碱法用0.2％氢氧化钠是 ％ 酵母裂解，然后酸中和，除蛋白和菌体， 酵母裂解，然后酸中和，除蛋白和菌体， 上清液乙醇沉淀的RNA ,或调核酸等电点 上清液乙醇沉淀的 或调核酸等电点 PI2.5沉淀。 沉淀。 沉淀
DNA含量的测定 含量的测定
原理：
强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核 糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核 苷酸。其中 2ˊ脱氧核糖在酸性环境中成为ω― 羟基 ―γ― 酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm 处有最大吸收。DNA在40-400µg范围内光密度与DNA浓度 成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其 他化合物的干扰也显著降低。当样品含少量RNA时不影响 测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与 二 苯 胺 形 成 各 种 有 色 物 质 ， 干 扰 测 定 。
思考题
二苯胺法测定DNA，为什么加乙醛，作用是什 么？ 除杂质常用那些方法？
经常采用三种方法去除蛋白
用SDS等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材 料中提取DNA 苯酚法：用含水的酚溶液沉淀蛋白质和DNA，分层、 DNA 离心蛋白变性，因而抑制了核酸酶活性，并且操 作过程比较缓和，可以得到较好的DNA制品 用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白，使乳化， 离心除蛋白，DNA在上层水相，用乙醇沉淀上层， 可将DNA沉淀出来
动物组织核酸的分离、鉴定和含量测定
• 定糖法: DNA糖部分为脱氧核糖，RNA糖部分为核糖， 分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法 • 定磷法: 测定核酸的磷酸部分
实验方法
• 1ml SC溶液溶解DNA， 8000rpm离心5分钟后，将上清转移到5ml离 心管中，用1ml 0.01M NaOH溶液加入沉淀中，使其充分溶解，并再 次离心5分钟，上清与第一次溶解液合并备用 • A260测定：以SC溶液作为空白，取上清测A260值（OD<3.0即在测量 范围之内），并计算DNA浓度（1OD=50µg/ml DNA） • A280测定： A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8，RNA为2.0。如果样 品中混有RNA，则比值大于1.8；如果样品中混有蛋白质，则比值小 于1.8 • 若A260/A280比值较为正常，则可确定二苯胺法测量DNA浓度的粗略 稀释倍数，使A260值在2.0左右（
• 实验结果以研究论文形式提交电子版本 • 包括摘要、前言、实验材料和实验方法、 实验结果和分析、讨论和参考文献
60℃水浴中保温1h，冷却测 OD595 以DNA的含量为横坐标，光密度（吸收值）为纵坐标，绘制标准曲线。
注：待测溶液中的DNA含量应调整至标准曲线的可读范围内。 样品1和样品2为不同稀释倍数的DNA溶液 二苯胺法的测定范围是40-400 ug/ml DNA，浓度太小会影响测定结果
DNA含量计算
根据标准曲线,以样品的光密度计算出相应DNA 含量,并同紫外法测定的值进行比较，分析二者差异的 原因。 注：二苯胺试剂具有腐蚀性，且二苯胺反应产生的蓝 色不易褪色，操作中应防止洒出，比色时，比色杯外 面一定要擦干净。
酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提
酚：有效的使蛋白质变性，不能完全抑制RNA酶的活性， 能溶解带有长poly(A)的RNA分子。使用前必须用水饱和并 用Tris平衡至pH>7.8，以防止DNA分配到有机相。 氯仿：强烈的脂溶性，去除脂类杂质，增加有机相比重。 纯酚的比重为1.07，有机相和水相有时很难分开。加入氯仿 （比重为1.47）可以避免这一问题。同时，酚有时会微溶于 水，可以用氯仿将水相中的酚去除。 异戊醇：降低表面张力，减少气泡产生，使离心后的水相、 变性蛋白相及有机溶剂相维持稳定。
实验十动物组织DNA的提取
动物组织中 总DNA的提取
Total DNA extraction from eukaryotic tissue
实验目的
了解真核生物基因组DNA提取的一
般原理
通过动物组织DNA的提取，掌握
DNA 提取的方法和步骤
高等动物、植物的基因组相当宠大， 如人类细胞基 因组由30亿个碱基对组成，包含了该物种生长，发 育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，获得 纯度高、基因组相对实验原理
细胞内各种DNA（包括基因组DNA和核外DNA） 称为总DNA。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖蛋 白（DNP），能溶解在纯水或1mol/L的NaCl溶液 中，而不溶于有机溶剂。 目前从样品中分离DNA的方法主要有两种，分为 CTAB法和SDS法（表面活性剂，能溶解细胞膜 和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以 游离出来）。
SDS法提取动物组织DNA
SDS（十二烷基硫酸钠 ）是阴离子表面活性 剂，溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉 淀下来。EDTA 抑制DNA酶的活性。再加入氯仿等 有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因 核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提 液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入 乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中， 即DNA溶液。
PH0211 动物组织细胞基因组 DNA 提取试剂盒使用手册
DNA的提取及鉴定
六、实验操作
1）粗提 1．称取猪肝 8g于100ml的小烧杯中，用剪刀剪碎，加 入2倍重的0.1mol/LNaCl-0.05mol/L 柠檬酸钠缓冲液 （16ml），高速匀浆。
2．将匀浆液（ ~25ml）转移到 100ml 离心管中，在 4000r/min下离心10min，弃去上清液。沉淀中继续加 入25ml缓冲液，搅拌均匀后于 4000r/min离心20min， 取沉淀。
2）分离DNP、除蛋白 3．将上述沉淀转移至 250ml烧杯中，加入 40ml0.1mol/LNaCl-0.05mol/L 柠檬酸钠缓冲液、 21ml氯 仿/异戊醇、4ml5%SDS，用保鲜膜封口，振摇 30min。
4．缓慢加入 3.6gNaCl （事先在研钵中研成粉末）使体 系终浓度为1mol/L。将混合液转移至离心管中于 3500r/min离心20min，取上清水相（用滴管吸取并量 体积）。
DNA鉴定或定量（二苯胺法）： 颜色反应可先完成标准曲线的制作，
或配置一个标准管。
(二)二苯胺法测定DNA含量
二、原理 核酸含量的测定方法包括紫外吸收法、定磷法和
分别针对DNA和RNA的颜色反应方法
本实验采用针对DNA的二苯胺法测DNA的含量。在 酸性溶液中，DNA与二苯胺共热生成蓝色化合物，该 物质在595nm有最大吸收，在40～400mg/mL范围内其 峰值与DNA含量成正比
DNA的提取及鉴定
一、动物肝脏中DNA的提取
一 . 实验目的
学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取 DNA的原理和技术
了解分离提取DNA的一般原理
DNA的主要来源
1.动物组织及器官：脾、肝胚芽等 3.微生物：细菌、酵母菌等
核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形 式存在，其中DNA主要存在于细胞核中，RNA 主要存在于核仁及细胞质中。
动物组织基因组DNA的提取
二、实验原理
7、核酸样品的保存
核酸保存的主要条件是温度和介质 温度： ① 4℃ ——最佳最简单； ② -70℃——长期保存的良好温度； ③ -20℃ ； 保存介质： TE缓冲液（最常用） 10mmol/L Tris-HCl pH 8.0 1mmol/L EDTA pH 8.0
三、实验试剂、仪器和耗材
6、核酸制备的步骤 破碎细胞
提取
纯化
二、实验原理
6、核酸制备的步骤 破碎细胞
① 微生物：溶酶菌、SDS裂解； ② 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。 酶法——蛋白酶、胰蛋白酶； 冰冻法 —— 反复冻融或液氮冻后 组织捣碎； ③ 动物：液氮处理后用匀浆器破碎； 以上原理
2、核酸制备的一般原则
核酸制备时应注意的事项： ① 尽量简化操作步骤，缩短提取过程； ② 减少化学因素对核酸的讲解； ③ 减少物理因素的核酸的讲解：机械剪切力和 高温； ④ 防止核酸的生物讲解；
二、实验原理
3、核酸酶的抑制和抑制剂
降低温度，改变pH值，及盐的浓度，都利于对 核酸酶活性的抑制，但均不如用核酸酶抑制剂更 有利，几个条件并用更好。 DNA ，抑制 Dnase 活力很容易，但防止机械拉 力张力更重要； RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但 抑制 Rnase 活力较难，故在 RNA 提取中设法抑制 Rnase更重要。
二、实验原理
4、核酸制备中常用的去垢剂
核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质， 用于核酸提取的去垢剂一般都是阴离子去垢剂， 去垢剂的作用： ① 溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； ② 溶解核糖体上面的蛋白，使其解聚，将核酸 释放出来； ③ 对Rnase和Dnase有一定的抑制作用； 如: SDS，脱氧胆酸钠，4-氨基水杨酸钠，萘-1， 5-二磺酸钠等
动物组织DNA的提取与鉴定
*鉴定：
1、安装电泳槽 将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的 开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。 2、琼脂糖凝胶的制备 称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按0.3-1.5%的琼脂 糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶，20-100kb的 DNA用0.5%的凝胶，200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶） 置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化（不要加热至沸 腾），取出摇匀。 3、灌胶 将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上 4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然 后拔出梳子。
三、实验仪器及试剂
• 1. 仪器： 恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度 计、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭 菌）、吸头（灭菌）、 电泳仪，电泳槽、 紫外透射反射仪、微波炉、微量进样器
2. 试剂： （1）细胞裂解缓冲液： Tris (pH8.0) 100 mmol/L EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L NaCL 20 mmol/L SDS 10% 胰RNA酶 20ug/ml （2）蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌 的双蒸水中，20℃备用。
冰无水乙醇
可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出， 无水乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析 出过程释放热量DNA的损伤。
75%乙醇：
洗涤DNA的作用，主要去盐和有机杂质。
四、实验步骤
*提取：
1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽 量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞 裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离 心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混 匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转 入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。 于台式离心机以12000 r/min离心5min，取上清 液入另一离心管中。 2.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝 状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重 新溶解。
实验二动物基因组DNA的提取
01
02
03
04
掌握了动物基因组DNA 提取的基本原理和操作 流程。
了解了不同动物组织对 DNA提取的影响因素和 注意事项。
学会了使用离心机、移 液器等实验器材，提高 了实验操作技能。
培养了团队合作和实验 数据分析的能力。
本实验的不足之处和改进建议
实验操作过程中，部分步骤不
够规范，可能导致提取的DNA
学生将了解基因组DNA提取在法医学、生物多 样性保护和生物进化等领域的应用，以及其在 解决人类健康问题中的潜在价值。
02
实验原理
基因组DNA的组成和结构
基因组DNA
是指构成生物体基因组的全部DNA， 它包含生物体的全部遗传信息。
DNA结构
DNA由四种不同的脱氧核苷酸组 成，它们按照一定的顺序排列， 形成两条互补的螺旋链。
DNA提取的基本原理
01
02
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细胞裂解
通过物理或化学方法将细 胞膜破裂，释放出细胞内 的DNA。
核酸吸附
利用核酸结合物（如硅胶、 玻璃等）将DNA吸附，去 除其他杂质。
洗涤与洗脱
通过洗涤去除杂质，然后 用洗脱液将DNA从吸附剂 上洗脱下来。
动物基因组DNA提取的常用方法
酚-氯仿提取法
利用酚-氯仿混合液反复抽提细胞 裂解物，使DNA充分释放并溶解 在氯仿中，然后进行离心分离。
纯度检测
利用紫外分光光度计测定DNA样品在260nm和280nm处的吸光度，计算 OD260/OD280比值，用以评估DNA样品的纯度。比值接近1.8表示DNA样品 纯度较高。
DNA提取的成功率和产量分析
成功率分析
根据DNA提取的质量和纯度检测结果， 评估提取的DNA是否可用于后续实验， 如PCR扩增、测序等。提取质量良好 且纯度较高的DNA样品成功率较高。
哺乳动物组织基因组DNA提取实验报告
哺乳动物组织基因组DNA提取实验报告实验目的：
实验原理：
本实验采用了离心提取法，将细胞破裂并使DNA高度纯化。
实验步骤：
1.将肝脏样本放在冰上并迅速离心5分钟，将上清液移至50ml离心管中。
2.加入10ml EDTA-Triton X-100 Buffer，彻底混合。
3.离心15分钟，室温25°C，10000转/分钟。
4.用管钳将上清液倒入新的50ml离心管中。
6.将上清液倒出，加入70%的乙醇混悬液中。
8.将上清液倒出，将离心管底部置于吸水纸上20秒钟。
9.加入DEPC水，在室温25°C下彻底溶解DNA。
实验结果：
实验分析：
1. 相比较其他方法，离心提取法是一种较高质量的DNA提取方法。
2. 在实验中，我们需要密切注意样本放在冰上的时间，以确保样本不被污染。
3. 在实验中，我们需要适当地离心时间，以保证DNA的纯化程度。
4. 在提取后，我们需要用DEPC水进行溶解DNA，以确保DNA完全溶解。
动物组织基因组的提取讲解
RNA（核糖核酸）
存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬 菌 体，其或只含DNA，或只含有RNA。
2、核酸制备的一般原则 核酸的理化性质
在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在
微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂
在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。
核酸保存的主要条件是温度和介质
温度： 4℃ 样品经常使用 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存,避免反复冻融
保存介质： 灭菌水 TE缓冲溶液(最常用)： 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0
三、动物基因组DNA的提取
主要方法： (1)浓盐法 利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。 1）用1M 氯化钠提取,得到的DNP粘液 2) 与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化 3) 离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相 中间，而DNA位于上层水相中 4) 用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.
• •
组织匀浆液 （装入10ml离心管中） 10ml
100mmol／L NaCl：0.2ml（5M NaCl） 25 mmol／L EDTA(pH8.0)： 0.5ml（ 0.5M EDTA pH8.0) l0mmol／L Tris·HCIpH 8.0)：0.1ml（1M Tris·HCIpH 8.0) 加三蒸水: 9.2ml
DNase抑制
①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA 或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。
动物组织中核酸的提取与鉴定(DNA&RNA)
实验一动物组织和细胞中核酸的提取和测定第一部分动物组织和细胞中DNA和RNA的提取【实验目的】学习从组织和细胞中提取DNA和RNA的方法【实验原理】1.从动物组织和细胞中提取DNADNA存在于细胞核中。
提取DNA的方法首先需要温和裂解细胞及溶解DNA的技术，接着需采用化学和酶学方法，除去杂蛋白、RNA及其他的大分子。
本实验在EDTA（螯合二价阳离子以抑制Dnase）存在的情况下，用蛋白酶K消化真核细胞和组织，用去垢剂（如SDS，十二烷基磺酸钠）溶解细胞膜并使蛋白质变性。
核酸通过有机溶剂抽提得以纯化，污染的RNA通过RNase消化清除。
这个方法可产生十微克至数百微克的DNA，适用于标准琼脂糖凝胶上的Southern分析，可用作PCR 反应的模板，以及用于构建基因组DNA文库。
2.从动物组织和细胞中提取RNARNA存在于细胞质及核中，是一种极易降解的核酸分子。
为了快速从细胞中分离完整的RNA，许多方法都用到了高浓度的强变性剂硫氰酸胍使细胞破裂。
高浓度的硫氰酸胍还使细胞内的各种RNA酶失活，使释放出的RNA不被降解。
细胞裂解后存在于裂解溶液内的有RNA，核DNA，蛋白质和细胞残片，通过酚，氯仿等有机溶剂处理，离心，使RNA最终与其它细胞组分分离开来。
【实验材料】1.实验器材材料：小牛胸腺或动物肝脏；研钵和研棒，匀浆机，橡胶刮棒，低温冷冻离心机，恒温水浴，宽口移液管，锤子，塑料袋，涡旋等。
2.实验试剂(1)裂解缓冲液：10mmol/L Tris-Cl (PH8.0)，0.1mol/L EDTA (PH8.0)，0.5%(m/V) SDS，20µg/mg无Dnase的胰RNase，裂解缓冲液的前三种成分可预先混合并于室温保存。
RNase在用前适量加入。
(2)溶液D(变性液)：4 mol/L 硫氰酸胍，25mmol/L 柠檬酸钠. 2H20，0.5%(m/V)月桂基肌酸钠，0.1mol/L β-巯基乙醇，将250g硫氰酸胍、0.75mol/L(PH7.0)柠檬酸钠17.6ml和26.4ml10%(m/V )月桂基肌酸钠溶于293 ml水中.加入搅拌子于磁力搅拌器上65℃混匀,直至完全溶解。
动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定
动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定夏天（武汉大学生命科学学院生命科学与技术基地班2009302630014）摘要实验中以新鲜猪肝为材料，利用SDS裂解细胞，氯仿、异戊醇抽提，得到猪肝细胞中基因组DNA和RNA，并且用盐溶法分离DNA与RNA。
用紫外分光光度法测定DNA的含量和纯度，并与二苯胺显色法的结果相比较。
关键词核酸；DNA；紫外分光光度法；二苯胺Separation, purification and identification of gnomic DNA from animal tissue: XIA Tian (College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, China).Abstract: In this experiment, fresh pork liver was used as the material. By using SDS to dissolve the cell and chloroform and isoamylol to extract, the gnomic DNA and RNA can be successfully obtained. The DNA and RNA are separated by the concentration of NaCl. The ultraviolet spectrophotometry is used to determine the content and purity.Key words: nucleic acid; DNA; ultraviolet spectrophotometry; diphenylamine核酸通常与蛋白质结合形成核蛋白存在于细胞中，是生命的基本物质之一，具有储存、传递生物体遗传信息的功能，也是蛋白质合成不可缺少的物质，在生物的生长、遗传、变异等生命过程中起着重要的决定作用。
动物肝脏中DNA的提取和鉴定
动物肝脏中DNA的提取和鉴定一、实验目的1.学习并掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。
2.掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。
3.学习核酸染色的方法。
二、实验原理为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提取DNA。
由于DNA分子在生物体内的分布及浓度不同，要选择适当的材料提取DNA。
动植物中小牛胸腺、动物肝脏、脾脏、鱼类精子、植物种子的胚中都含有丰富的DNA。
微生物中，谷氨酸菌体含7%～10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠杆菌9%～10%。
从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。
对于低等生物，如从病毒中提取DNA比较容易，多数病毒DNA相对分子量较小，提取时易保持其结构完整性。
从细菌及高等动植物中提取DNA难度大些。
细菌DNA相对分子质量较大，一般达2×109Da。
因此易被机械张力剪短。
细菌DNA，除核DNA外，还有质粒DNA等。
1.DNA的基本功能生物遗传信息复制的模板和基因转入的模板，是生命遗传繁殖的物质基础，也是个体生命活动的基础；作为DNA分子中的某一区段，有复制、转录和翻译等主要功能称为基因。
2.核酸的结构与功能核酸（nucleic acid)是以核苷酸为基本组成的生物大分子。
天然存在的核酸有两类，一类为脱氧核苷酸（deoxyribonucleic acid,DNA)，另一类为核糖核酸（ribonucleic acid,RNA)。
DNA存在于细胞核和线粒体中，携带遗传信息。
RNA存在于细胞质和细胞核内，参与细胞内DNA遗传信息的表达。
3.DNA的存在形式天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白（DNP）形式存在于细胞核中。
要从细胞核中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖、RNA及无机离子等，从中分离DNA。
DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。
DNP在低浓度盐溶液中几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠溶液中溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中溶解度很大，比纯水高2倍。
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酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提
Ø 酚：有效的使蛋白质变性，不能完全抑制RNA酶的活性， 能溶解带有长poly(A)的RNA分子。使用前必须用水饱和并 用Tris平衡至pH>7.8，以防止DNA分配到有机相。
Ø 氯仿：强烈的脂溶性，去除脂类杂质和少量蛋白质，增加 有机相比重。纯酚的比重为1.07，有机相和水相有时很难分 开。加入氯仿（比重为1.47）可以避免这一问题。同时，酚 有时会微溶于水，可以用氯仿将水相中的酚去除。
动物组织基因组DNA 的分离纯化及鉴定
1. 猪肝基因组DNA分离 2. 核酸的定量和纯度测定 3. 脱氧核糖的显色实验
Ø 核酸是一类生物高分子化合物，存在于一切生物体内， 是组成细胞的重要成分。它以与蛋白质结合的形式-核蛋白存在于细胞中，是生命的基本物质之一，具有 储存、复制生物体遗传信息的功能，也是蛋白质合成 不可缺少的物质，因此它对于生物体的生长、遗传、 变异等现象起着重要的决定作用
在0.14M的氯化钠溶液中，RNA核蛋白溶解度大， 而DNA核蛋白溶解度小；相反在1M的氯化钠溶液中， DNA核蛋白的溶解度大，而RNA核蛋白的溶解度小， 从而使DNA和RNA核蛋白分开。 Ø 然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来， 再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离 DNA和RNA的目的。
• 若A260/A280比值较为正常，则可确定二苯胺法测量DNA浓度的粗 略稀释倍数，使A260值在2.0左右（DNA浓度约为100mg/ml）
3. 脱氧核糖的显色实验
加热条件下：
RNA＋浓盐酸＋地衣酚
绿色
DNA＋酸＋二苯胺 蓝紫色
二苯胺显色法原理
DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键 断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧 核糖在酸性环境中加热脱水生成w-羟基-g-酮基戊糖，与二苯 胺试剂反应生成蓝色物质，在595nm波长处有最大吸收。 DNA在40~400mg/ml范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。 在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。
2 有机溶剂抽提 苯酚使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在 水相，达到分离核酸的目的。
3 纯化 为了得到纯的核酸，可用蛋白酶除去蛋白；用RNA酶除去 RNA，得到纯的DNA；用DNA酶除去DNA，得到纯的RNA。
4 沉淀 为了除去分离过程中残留的有机溶剂，常用的方法是加冷 乙醇和盐沉淀核酸，再通过离心回收核酸，然后用70%-80%乙醇 洗涤沉淀，除去多余的盐，以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的 酶促反应。
核酸分离试剂盒:
可简单、快速地分离得到纯度很高的DNA或 RNA，其分离原理是在特定溶液环境下（高盐、 低pH)使核酸吸附在固相介质（一般是硅胶膜）上， 洗涤去除杂质后，再改变溶液环境使DNA溶解到 纯水或TE中，以达到分离、回收核酸的目的。
盐溶法分离DNA和RNA的原理
Ø 根据RNA与DNA在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度 不同进行分离：
Ø 异戊醇：降低表面张力，减少气泡产生，使离心后的水相、 变性蛋白相及有机溶剂相维持稳定。
实验步骤
SC溶液: 0.14M NaCl, 0.15M EDTA
1.2g
本周内容
2. 核酸的定量和纯度测定
• 紫外分光光度法:
定量： 260nm下，1OD相当于50mg/ml双螺旋DNA， 40mg/ml 双链RNA
样品1 样品2
2.0 2.0
0
0
4.0 4.0
以DNA的含量为横坐标，光密度（吸收值）为纵坐标，绘制标准曲线。
1. 猪肝基因组DNA的分离
核酸分离的原则
在溶解细胞的基础上，利用有机溶剂抽提蛋白 质（核酸溶于缓冲液，即水相），分离，纯化；利 用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀核酸，收获
核酸分离的一般步骤
1 溶解细胞 溶解细胞的方法因样品不同而不同，如十二烷基硫酸 钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）加EDTA法、蛋白酶消化法、强 碱法、超声破碎加冻融等。
DNA标准曲线的制作和样品测定
试 剂（ml）
DNA标准溶液 （200 mg/ml）
H2O 二苯胺试剂
管号 012345 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 60℃水浴中保温1h，冷却测 OD595
检测纯度：纯的DNA A260/A280=1.8，RNA为2.0，样品中 含有蛋白质和苯酚时，A260/A280 比值降低。
• 定糖法: DNA糖部分为脱氧核糖，RNA糖部分为核 糖，分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法
• 定磷法: 测定核酸的磷酸部分
实验方法
• 1ml SC溶液溶解DNA， 8000rpm离心5分钟后，将上清转移到5ml 离心管中，用1ml 0.01M NaOH溶液加入沉淀中，使其充分溶解， 并再次离心5分钟，上清与第一次溶解液合并备用
• A260测定：以SC溶液作为空白，取上清测A260值（OD<3.0即在测 量范围之内），并计算DNA浓度（1OD=50mg/ml DNA）
• A280测定： A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8，RNA为2.0。如 果样品中混有RNA，则比值大于1.8；如果样品中混有蛋白质，则 比值小于1.8
Ø 核酸分为核糖性物质、戊糖（核糖或脱氧核糖） 和磷酸组成
DNA和RNA的结构
及PCR分离基因等。 Ø 利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小 分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分 子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出， 而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达 到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大 小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下 操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到 较长的DNA。