具有高比活性的新木聚糖酶XYNB的酶学性质研究及其编码基因的克隆和表达

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具有高比活性的新木聚糖酶XYNB 的酶学性质研究

及其编码基因的克隆和表达

张红莲 姚 斌* 王亚茹 张王照 袁铁铮

(中国农业科学院饲料研究所, 北京 100081. *

联系人, E-mail: yaobin@)

摘要 纯化了橄榄绿链霉菌A1产生的胞外木聚糖酶XYNB, 并对其酶学性质进行了测定. XYNB 具有优良的酶学性质, 最适pH 为5.2, 最适温度为

60

食品

分子量不带电荷的碱

性和酸性氨基酸的比例等方面均有较大差异[3]. 目前,已有许多种木聚糖酶编码基因得到分离, 在木聚糖酶基因的高效表达方面也进行了较多尝试[4~7].

用于不同领域的木聚糖酶对其酶学性质有着不同的要求, 如纸浆工业需使用碱性木聚糖酶, 而在饲料中酸性木聚糖酶更合适. 另外, 酶的一些基本性质,如酶的比活性抗各种金属离子和化学试剂的能力等对酶的实际应用起着关键性的作用.目前, 从天然微生物中筛选性质更为优良的木聚糖酶或通过分子改良改善酶学性质的研究成为研究的

热点之一[8~10].橄榄绿链霉菌A1(Streptomyces olivaceoviridis A1)是本实验室从土壤中分离到的一株放线菌, 它可产生两种胞外木聚糖酶, 即43 kD 的XYNA 和21 kD 的XYNB. XYNA 已被纯化并进行了详细的酶学性质研究[11], 本文报道具有优良酶学性质的XYNB 的纯化

)　实验材料. 橄榄绿链霉菌A1为本实验室

分离

)　培养基及培养条件. 链霉菌诱导产酶培养

基: 2%木聚糖, 1%牛肉胨, 0.3%酵母培养物, 1%磷酸氢二钾, 0.05%硫酸镁, pH 5.4.

35

) 木聚糖酶XYNB 的纯化及酶学性质测定.

粗酶液经50%硫酸铵沉淀, 沉淀用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液重新溶解, 得到浓缩酶液; 将浓缩酶液上HiTrap_Q_Sepharose_XL (Amersham Pharmacia Biotech 预装柱)阴离子层析柱, 用0.02 mol/L 的Tris-HCl 缓冲液(pH 9.0)洗脱平衡柱子, 然后用相同缓冲液配制的0~1 mol/L NaCl 梯度洗脱分部收集, 将检测有酶活的收集样冷冻干燥浓缩, 再经过分子筛Superdex_75_HR 10/30 (Amersham Pharmacia Biotech 预装柱)纯化, 用pH 5.7的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗脱,分部收集洗脱峰, 得到纯木聚糖酶蛋白, 并将纯化的木聚糖酶蛋白冷冻干燥备用. 木聚糖酶活性测定方法采用国际通用的Somogyi-Nelson 法进行. 木聚糖酶酶学性质测定方法参照文献[11]. 木聚糖酶活性单位(U)定义: 在一定条件下, 每分钟分解木聚糖生成1 µmol 木糖所需的酶量. 酶蛋白质浓度测定用考马斯亮蓝法,　以牛血清白蛋白作为标准蛋白.

万方数据

365

(

) xynB 基因的克隆. 主要根据Maniatis 手

册[13]

进行. 根据木聚糖酶成熟蛋白N 端氨基酸序列测序结果设计引物, 分别与23个随机引物组对, 以链霉菌DNA 为模板, 进行PCR 扩增. PCR 片段回收后克隆到pGEM-T 载体上进行序列测定.

(

和Hin d

震荡培养过夜,

次日按1%接种量转接

, 37

离子交换层

析

) XYNB 的最适pH 及pH 稳定性. 纯化的

木聚糖酶XYNB 于

55不同pH 的缓冲体系中测定pH 适性, 结果表明(图2(a)), XYNB 的最适pH 为5.2, 在pH 5.2~5.7范围内, 酶活性维持在80%以上, 从pH 6.4开始, 酶活性下降较快, pH 在3.0以下和8.0以上, 检测不到酶活性. 木聚糖酶XYNB 于

55

) XYNB 酶反应最适温度及热稳定性. 酶反

应最适温度测定结果表明(图3(a)), XYNB 最适温度为

60

下保温30 min, 剩余酶活性为

50.9%, 70

mg −1

回收率/%培养上清液10.00.480749.67156.1810050% (NH 4)2SO 4沉淀0.5 2.110171.34162.4022.9离子交换层析收集液 5.00.023130.501134.7817.4凝胶层析并真空浓缩液

0.5

0.045

64.57

2869.78

8.6

万方数据

366

图2 XYNB 的最适pH(a)和pH 稳定性(b)

图3 XYNB 的最适反应温度(a)和热稳定性(b)

(

) 木聚糖酶XYNB 的K m 值及V max 的测定.

根据所测定的XYNB 的反应初速度, 确定测定XYNB K m 值及V max 的反应时间为5 min. XYNB 以4-O -Me -D-glucurono-D-xylan 为底物时的K m 值为22.1 g/kg(因无法计算木聚糖分子量而无法计算其摩尔浓度), V max

为105.26 µmol/(mL

) 木聚糖酶比活性的测定. 以BSA 为标准

蛋白, 用考马斯亮蓝法作标准曲线, 定量纯化的木聚糖酶, 通过酶活性测定, 计算出酶的比活性. 通过5次重复测定, XYNB 的比活性为(2869.78

) 纤维素酶活性测定. 用0.5%甲基纤维素

M20作底物来测纤维素酶活性, 结果检测不到纤维素酶活性.

(下分别处理2 h,

剩余95%以上的酶活性, 说明木聚糖酶XYNB 具有较好的抗胃蛋白酶及胰蛋白酶水解的能力.

2.3 木聚糖酶基因xynB 的克隆

经氨基酸序列测定, 纯化后的木聚糖酶XYNB 成熟蛋白N 端氨基酸序列为ATVITTNQTG, 以此为依据, 结合链霉菌基因密码子使用偏好, 设计引物X1(5). 另一端的引物为23个随机引物, 它们分别与引物X1配对进行PCR 扩增. 其中一组引物扩增到约0.9 kb 的片段, 比根据XYNB 分子量(21 kD)估算的编码基因长度稍大, 如是xynB 基因就应包含完整的结构基因3

端编码的10个氨基酸及

+

217

~

+

250编码的11个氨基酸与XYNB 成熟蛋白的N 端测序结果和内部肽N 端测序结果(GYLALYGWTSN)完全一致, 说明是我们拟克隆的基因.

分离到的木聚糖酶成熟蛋白编码结构基因xynB (EMBL 登录号: AJ292317)全长576个核苷酸, (G + C)含量为64.3%, 编码191个氨基酸, 理论分子量为20.839 kD. 氨基酸序列中没有纤维素结合域, 与酶学性质测定中发现其无纤维素酶活性相吻合. 将此基因核苷酸序列和氨基酸序列与GenBank 上的木聚糖酶基因序列进行同源性比较, 结果表明, 它属于G/11组, 且与G/11组中的几种木聚糖酶有一定的同源性, 同源性最高的是来源于Streptomyces sp. S38的木聚糖酶XYL1[14], 核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性均为86%, 但XYL1的酶学性质[15], 如比活性