第10章 层析分离技术与设备

2、流动相
在层析过程中，推动固定相上待分离 的物质朝着一个方向移动的液体、气体或 超临界体等，都称为流动相。柱层析中一 般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。
3、分配系数及迁移率（或比移值）
分配系数：在一定的条件下，某种组分在固定相和 流动相中含量（浓度）的比值，常用K来表示。
迁移率（或比移值）：在一定条件下，在相同的时 间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移 动的距离之比值。常用Rf来表示。
（三）聚丙烯酰胺
商品名为Bio-Gel P。 由丙烯酰胺（acrylamide）与甲叉双丙
烯酰胺交联而成。 丙烯酰胺的浓度越高，交联度越大，孔
隙度越小。 主要用于蛋白质相对分子质量的测定、
核苷及核苷酸的分离纯化。
三、凝胶过滤层析的应用
1、生物大分子物质的分离纯化 2、分子量的测定 3、分级分离 4、溶液浓缩 5、平衡常数的测定 6、细胞及颗粒的分离
第10章 层析分离设备
第1节 层析分离概述
引言
层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家 Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的 色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同 的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得 名为“色谱法”（Chromatography) 。
后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。 1944年出现纸层析。 以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压
特点：适合分离不同种类的化合物(醇类和
芳香烃）。
二、吸附剂
▪ 吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体， 与待分离物质的极性官能团作用。
▪ 常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、 羟基磷灰石等
▪ 羟基羟基磷灰石（HA） [Ca10(PO4)6.(OH)2],最重要的用途是用于 分离蛋白质与核酸。
第3节 凝胶过滤层析
保留体积(retention volume，VR)：从 进样开始到某组分在柱后出现浓度极大 值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。
第2节 吸附层析技术
一、基本原理
吸附层析法（液-固色谱法，LSC）
原理： 利用固定相的固体吸附剂表面对不
同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解 作用（解吸作用）的差异进行分离。
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二、凝胶的种类和性质
（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex)
1、Sephadex G
—— G 后的数字为凝胶吸水值（ml / g）的10 倍。
——可用于分离蛋白质、核酸、酶、多糖、 多肽、氨基酸、抗菌素，也可用于高分子 物质样品的脱盐及测定蛋白质的相对分子 质量。
2、Sephacryl
——葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺交联而成。
——优点就是它的分离范围很大，排阻极限 甚至可以达到108
——不仅可以用于分离一般蛋白，也可以用 于分离蛋白多糖、质粒、甚至较大的病毒 颗粒。
（二）琼脂糖凝胶
产品：Sepharose(瑞典)、Bio-gelA(美国)、 Segavac(英国) 机械强度和筛孔的稳定性均优于交联葡 聚糖凝胶。 琼脂糖浓度越大，网状结构越密集。 排阻极限很大，分离范围很广，适合于 分离大分子物质，但分辨率较低。
相对迁移率：在一定条件下，在相同时间内，某一 组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定 相中移动的距离之比值。（常用）
4、分辨率（或分离度）
分辨率：相 邻两个峰的 分开程度。 用Rs来表示。
5、保留体积和保留时间
保留时间(retention time，tR)：从进样 开始到某个组分在柱后出现浓度极大值 的时间。
二、层析法的分类
按两相所处的状态分类：
流动相有两种状态： *液体作为流动相 *气体作为流动相
固定相也有两种状态： *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相
▪ 按两相所处的状态分为：
液相层析 液-固层析 液-液层析
气相层析 气-固层析 气-液层析
按层析过程的机理分类：
吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能 的差异，达到分离鉴定的目的。
（1）疏水性基质 常用的有聚苯乙烯、聚丙烯酸型离子交换剂 机械强度大、流速快，但具有较强的疏水性，
一、基本原理
概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大
分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据 它们分子大小不同而进行分离的技术。
原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的
混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能 进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动， 并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度 的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长 移动速度较慢，最后被洗脱出来。
第4节 离子交换层析法
一、基本原理
1、离子交换剂：离子交换剂可以分为三部分： 高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。
R X+ Y-
2、交换原理：根据离子交换树脂对需要分离 的各种离子的亲和力不同而达到分离的目的。
R-X+ Y－ + A－ R-X+ A－ + Y－
二、离子交换剂类型
1、离子交换剂的基质
纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动 相展开，以达到分离鉴定的目的。
薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸 层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。
三、层析法的基本概念
1、固定相
固定相是层析的一个基质。它可以 是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交 换剂等），也可以是液体物质（如固定 在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质 能与待分离的化合物进行可逆的吸附， 溶解，交换等作用。
液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。
一、层析法的基本原理
层析法是利用混合物中各组分物理化学性质 的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子 亲和力、分配系数等），使各组分在两相 （一相为固定的，称为固定相；另一相流过 固定相，称为流动相）中的分布程度不同， 从而使各组分以不同的速度移动而达到分离 的目的。
分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间 的分配系数不同，使之分离。
离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和 力的不同。
凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组 分阻滞作用的不同。
亲和层析法 ：固定相只能与一种待分离组份专一 结合，以此和无亲和力的其它组份分离。
按操作形式不同分类：
柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向 移动而达到分离。