蛋白质分离纯化的一般程序解析

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：

（一）材料的预处理及细胞破碎

分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法

这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

2. 渗透破碎法

这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

3. 反复冻融法

生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

4. 超声波法

使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

5. 酶法

如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

(二) 蛋白质的抽提

通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。

（三）蛋白质粗制品的获得

选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：

1. 等电点沉淀法

不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。

2. 盐析法

不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。

3. 有机溶剂沉淀法

中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。

（四）样品的进一步分离纯化

用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品

纯化方案是由几种纯化方法组成的，一般选择的依据是从抽提液中有效成分和

杂质之间理化性质考虑的。如沉淀法是从溶解度的差异考虑的；离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析分别从电荷、分子量、对配体亲和力的差异性考虑的。为纯化某一有效成分，可选出由两种或更多种方法组成的方案。一般先选粗放、快速、有利缩小样品体积和后工序处理的方法；精确、费时、需样品量少的方法后选。在每一纯化方案中，切忌一种方法重复使用。

你好!我也是位毕业的学生.希望能给你提供参考.以下是离子交换层析常见问题分析,希望能解决你的问题

1.纯化的蛋白质产率低

可能原因及解决方法：

树脂上的蛋白质未洗净，可采用增强溶液离子强度，更换活性高的反荷离子或使用去垢剂等办法解决；

PH值不合适，若缓冲体系的PH值与目的蛋白的PI相差太远，目的蛋白与树脂的结合会过于牢固；

蛋白质发生沉淀，可能是因为缓冲体系PH值过于接近蛋白质PI值，溶液离子强度过低或溶液过渡稀释；

蛋白质在初步过滤的时候有损失；

蛋白质或者辅助因子在层析时有损失；

蛋白质水解酶破坏了目的蛋白；

树脂中有纯化时蛋白质失活

可能原因及解决办法：

某个辅助因子或一部分蛋白质有损失，混合部分收集液，测定活性；

蛋白质在现有层析液中不稳定；

树脂中有微生物。

微生物。

3. 蛋白质不与树脂结合

可能原因及解决方法：

初上样缓冲液离子强度过大，降低初始上样缓冲液离子强度；

树脂PH值因解析作用而发生变化，注意蛋白质等电点的计算值往往与实验值差别很大；树脂未进行适当平衡；

再生的树脂未洗净。

4. 纯化的蛋白质产率低

可能原因及解决方法：

树脂上的蛋白质未洗净，可采用增强溶液离子强度，更换活性高的反荷离子或使用去垢剂等办法解决；

PH值不合适，若缓冲体系的PH值与目的蛋白的PI相差太远，目的蛋白与树脂的结合会过于牢固；

蛋白质发生沉淀，可能是因为缓冲体系PH值过于接近蛋白质PI值，溶液离子强度过低或溶液过渡稀释；

蛋白质在初步过滤的时候有损失；

蛋白质或者辅助因子在层析时有损失；

蛋白质水解酶破坏了目的蛋白；

树脂中有微生物。

5. 蛋白质分辨效果差

可能原因及解决办法：

层析时流速太快；

层析柱过短；

上柱蛋白过多；

梯度洗脱时洗脱液浓度变化太快；

蛋白质可在脱离层析柱后再次混合，尽量减少树脂支持物与部分收集期间的管道体积；

不均匀的装柱以至产生碎屑，，上样合洗脱时的错误操作；

树脂未进行适当平衡；

树脂中有微生物。

蛋白质纯化

蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。

一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。用于分离蛋白质的最重要特性有大小、电荷、疏水性和对其他分子的亲和性。通常采用多种方法的组合来实现蛋白质的完全纯化。其蛋白质分离纯化主要方法包括：

（1）根据分子大小不同的分离方法：透析和超过滤（利用蛋白质分子不能通过半透膜）；密度梯度离心（蛋白质在介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快）；凝胶过滤(一种柱层析)

（2）利用溶解度差别分离：等电点沉淀法）由于蛋白质分子在等电点时净电荷为零，减少了分子间静电斥力，因而容易聚集沉淀，此时溶解度最小)；盐溶与盐析(利用一定浓度盐溶液增大或减小蛋白质的溶解度)

（3）根据电荷不同的分离方法，主要包括电泳和离子交换层析分离；

（4）蛋白质的选择吸附分离（利用颗粒吸附力的强弱不同达到分离目的）

（5）根据配体特性的分离——亲和层析（利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异而非共价地结合这一生物性质）

这是一门很深的学问，除了需要高科技还需要科研专用设备，只是简介，希望对你有帮助，不要上当受骗：