转基因植物

转基因植物
基因工程技术使微生物、动物、植物之间的基因转移成为可能，原来难以实现的远缘杂交成为可能。

于是，形形色色的转基因植物出现了。

日本用转基因水稻生产免疫球蛋白获得成功。

这项成果是日本东京理科大学科学家千叶丈完成的。

他成功地用转基因水稻生产出预防乙肝病毒的球蛋白，这有可能为用廉价而安全的手段生产预防肝炎药物提供新思路。

乙型肝炎在一些国家已成为一种常见病。

迄今为止，有效地预防这种疾病的免疫球蛋白是使用受过感染的人的血液精制而成的，价格昂贵。

千叶丈教授把制造乙型肝炎病毒的抗体基因植入水稻细胞中去，加以栽培后，成功地从其叶子中提取出了这种抗体。

在试管中进行的实验结果表明，这种抗体会对病毒产生抑制作用。

据这位学者计算，用这种方法，每1000平方米的转基因水稻可制取10克球蛋白，足够数万名新生儿注射用。

日本还培育出含母乳成分的番茄。

日本科学家开发出一种基因重组番茄，该番茄能生产母乳中所含的多功能蛋白质——乳铁蛋白。

乳铁蛋白具有提高免疫机能和防止感染的作用，并具有增加铁质的功效。

科学家将人的乳腺中产生乳铁蛋白的基因组导入了番茄品种“秋玉”之中。

实践表明，番茄“秋玉”的果实、叶、根的部分能生成乳铁蛋白。

在其果实中，每100克重量可生成2.5至3.3毫克的乳铁蛋白。

随着植物高效基因载体系统和遗传转化技术的发展，利用转基因植物生产人或动物基因工程疫苗用于疾病的预防及治疗已成为植物基因工程的一个新兴研究领域。

与目前的细菌、酵母及哺乳动物细胞等传统疫苗生产系统相比，用转基因植物生产基因工程疫苗具有其独特的优势：①植物细胞的全能性；②完整的真核细胞表达系统，使表达产物具有较好的免疫原性及生物活性；③口服植物疫苗能诱导粘膜免疫反应；④植物细胞的细胞壁起到生物胶囊的作用；⑤生产简便、成本低廉，不需要冷藏和低温运输；⑥安全性好，无外源性病原污染等。

目前，转基因植物疫苗的研究主要有两个方向，一种是利用植物生产大量的蛋白质抗原，经分离和提纯再制备成疫苗；另一种是不需要分离和提纯，将植物或其某部分作为可以直接口服的疫苗。

l转基因植物生产疫苗的原理与方法
转基因植物疫苗(transgenie plant vaccine)或植物疫苗(plant-based vaccine)是借助植物遗传转化载体将抗原基因导入植物，使其在植物中表达，生产出能使机体获得特异抗病能力的疫苗。

植物遗传转化的受体系统、载体系统和遗传转化方法是转基因植物基因工程疫苗生产技术的关键。

目前在植物生产基因工程疫苗方法上的研究主要有3种，一是以植物病毒为载体的瞬时表达，此途径不属于转基因植物的范畴；二是农杆菌介导的核转化，将携带重组质粒的农杆菌感染植物细胞后，导人的外源基因通过同源重组整合到细胞染色体上，含整合外源基因染色体的植物细胞在一定条件下长成新的植株，此植株在生长过程中表达外源基因并将这种性状传给子代；三是用基因枪法进行叶绿体转化，为了实现外源DNA的定点整合，构建叶绿体表达载体时，一般在外源基因表达盒的两侧连接同源重组片段或定位片段(targeting frag． ment)，当载体被导人叶绿体后可将外源基因整合到叶绿体基因组的特定位点。

2不同植物中表达疫苗抗原及免疫原性评价
近年来，已有众多研究表明转基因植物表达的疫苗抗原能诱导人或动物体内产生特异性中和抗体及激发粘膜免疫应答。

由于动物疫苗的试验能比人用疫苗更快地付诸于临床应用，更多的学者致力于研发预防动物传染病的植物疫苗。

因为不同的受体植物对抗原蛋白翻译后修饰的差异以及植物本身不同蛋白的影响，研究报道的转基因植物疫苗免疫原性及对动物的免疫保护水平差异较大。

2．1 模式植物中表达疫苗抗原的研究植物模式研究工具烟草、拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因表达系统已充分特征化，便于确定蛋白质特征。

Khandelwal等以烟草作为表达牛瘟病毒(finder- pest virus，RPV)血凝素(hemagglutinin，H)蛋白的模型，用烟草花叶提取物腹腔接种小鼠，1—9周其血清中和抗体滴度达1：160～l：640，且H蛋白特异性的高效价抗体能完全中和RPV。

以烟草作为受体植物的还有Bae等研究小组的报道，他们将表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)刺突蛋白(spike protein)中和表位(COE)的烟草花叶提取物饲喂小鼠，在血清和粪样中分别检测到高水平的IgG和 IgA；空斑减数试验(plaque reduction neutralization assay)表明抗COE血清对靶细胞中病毒生长抑制程度比对照组增加了49．7％，说明饲喂此转基因烟草能诱导全身性及粘膜免疫反应且能有效抑制病毒对宿主细胞的感染。

Gomez等培育了转猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)s糖蛋白基因拟南芥，并用ELISA检测叶提取物免疫后的小鼠抗血清，发现产生的抗体能与TGEV发生特异性反应。

2．2 可食性植物中表达疫苗抗原的研究已有越来越多种类的受体植物被考虑用作基因工程亚单位疫苗生产系统的研究。

Zhou等报道将禽传染性支气管炎病毒(IBV)sl糖蛋白基因转人马铃薯(Solanum tuberosum)块茎表达，产物提取液肌注接种小鸡，经三免后用鸡气管环培养(TOC)中和试验检测IBV抗体，抗体滴度可达1：2 187。

在番茄叶片及果实中表达的霍乱毒素B亚单位(CTB)用 Gm1-ELISA检测发现具有天然的Gm1-神经节苷脂结合活性。

Kapusta等研究了HBsAg在转基因羽扇豆(Lupinus luteus L．)和莴苣(Lactuca sativa L．)中的表达，并在服用莴苣的志愿者血清中检测到特异性血清IgG。

用转基因苜蓿表达口蹄疫病毒(FMDV)抗原表位VPl35—160基因，对免疫小鼠进行攻毒试验，具有较好的免疫保护作用。

此外， Bouche等将一特殊重组多肽转入胡萝卜表达，用于抗麻疹病毒的感染，中和试验表明，从胡萝卜提取物免疫小鼠体内分离的血清能特异性抑制包括实验室毒株在内的15个不同地理分离株在麻疹病毒细胞受体CDl50转染的Vero细胞中复制繁殖。

2．3 转基因农作物疫苗的免疫原性研究豆类(大豆、花生)或谷类植物(玉米、水稻、小麦)广泛种植且产量高，种子中蛋白丰富且易于贮存，重组蛋白水平较高，作为动物疫苗极适合饲喂免疫。

Lamphear等在玉米种子中表达出传染性胃肠炎病毒刺突蛋白(TGEV-S)和E．coli不耐热肠毒素B亚单位(Lt-B)作为预防肠毒性大肠杆菌(ETEC)及 TGEV的疫苗，研究发现抗原蛋白在谷物加工过程中能保持自身活性且均能诱导血清和粘膜免疫应答，4 qC 下种子的贮藏期可达10个月以上。

Khan— delwal等报道用转RPV H蛋白基因花生(Am—chis hypogea L．)叶片饲喂牛可诱导产生H一特异性抗体，且能诱导其外周血单核细胞(PBMC)体外增殖反应。

最近有报道将小反刍兽瘟病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)的抗原蛋白血凝素一神经氨酸苷酶(HN)基因转入鸽豆(Cajanus caja~(L．)Millsp．)内表达，并测得植物源HN蛋白具有较好的神经氨酸苷酶活性。

3 免疫原基因的高效表达策略
转基因植物疫苗最主要的技术问题是要取得重组抗原在植物中的高水平表达，即抗原的有效表达。

早期的研究报道中，抗原在植物中表达量大多数占总可溶蛋白(total solution protein，TSP)的 O．001％～0．3％。

为了提高抗原的表达量使植物疫苗达到有效的免疫作用，众多学者开展了如何使免疫原基因能高效表达的研究工作，并取得了一定的进展。

3．1 优化重组基因结构免疫原在植物中的有效表达，在一定程度上依赖于选择合适的保护性抗原编码序列以及构建适宜于植物转化的表达盒。

已有许多方法来优化重组基因的结构，使其能更适合在某种特定的植物中表达(表1)。

3．2植物膜泡运输机制靶向表达抗原蛋白真核细胞内许多蛋白质需靠膜泡从一种细胞器运输到另一种细胞器，它的基本过程包括：膜泡在供膜(donor membrane)处芽生(budding)形成，将被运输蛋白包在其中，定向地运输到受膜(acceptor mem— brane)，通过Rab蛋白的调控与受膜相互融合将被运输蛋白释放，从而完成膜泡运输过程。

若将表达的不同抗原蛋白通过各种分选信号(sorting signals)经植物细胞内膜泡定向运输到内质网(ER)、液泡(vacuoles)或分泌到胞外房室(extracel— lular compartments)，则不仅能使蛋白进行正确的翻译后修饰(如抗原糖蛋白的糖基化)，而且能提高抗原的表达量。

常用的分选信号为内质网滞留信号肽(ER retrieval signal)SEKDEL，它具有使所表达的外源蛋白在内质网中累加的作用。

Arakawa等在用 CTB转化马铃薯时，在CTB c一末端加上SEKDEL， CTB的表达量提高至0．3％TSP。

Huang等报道在编码麻疹病毒(MV)H蛋白序列的c一未端加上SEKDEL可提高抗原表达量4—6倍，腹腔注射和灌饲(gavage)后能诱导小鼠产生血清特异性抗体。

3．3载体蛋白与抗原决定簇的融合将相关抗原决定簇与合适的载体蛋白融合，以便于筛选高表达量的转基因植株，或使抗原蛋白靶向作用于细胞位点，从而提高疫苗的免疫原性。

霍乱毒素B亚单位(CTB)与大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位(LTB)具有结合神经节苷脂GMI 的功能，可使它们的毒性亚单位(A)紧密结合在肠道黏膜细胞表面，使融合蛋白更易与消化道黏膜作用，进而刺激产生黏膜IgA和血清IgG抗体，加强免疫效果。

Kim等将HIV-1 gpl20 V3环与CTB在转基因马铃薯中融合表达，GⅢ1ELISA检测到 CTB-gpl20融合蛋白五聚体(pentamer)与肠上皮细胞膜受体结合活性。

因此，CTB和LTB可作为免疫佐剂与抗原决定簇基因融合表达，强化半抗原的免疫原性。

此外，还有研究将GUS(glucuronidase)报告基因与病毒抗原多肽基因融合表达，利用 p一葡萄糖苷酸酶活性来筛选获得高表达量的转基因植株。

3．4叶绿体遗传转化叶绿体转化系统独立于传统的核转化，为植物导入外源基因提供了新途径。

它有如下优点：超量表达目的基因；以定点整合方式导入外源基因从而消除了位置效应及基因沉默；具原核表达方式，能以多顺反子的形式表达多个基因；母系遗传方式可防止基因扩散；基因产物区域化并能提供适于某些产物发挥功能的小环境等。

De Cosa等报道叶绿体中外源基因的表达量可高达46％TSP；烟草叶绿体表达的CTB也可达4．1％TSP。

此外，也有学者在马铃薯、番茄中实现了外源基因的叶绿体转化，为生产可饲(食)性植物疫苗奠定基础。

叶绿体遗传转化研究工作还有待于深入开展，限制高等植物叶绿体转化的主要瓶颈是大多数植物的叶绿体基因组序列不清楚，因此无法确定用于载体构建的同源重组片段和外源基
因的插入位点。

叶绿体遗传转化技术的发展前景是诱人的，目前已有众多学者关注其研究工作。

4口服免疫耐受性
作为植物口服疫苗，免疫耐受的产生对疫苗的作用显然是致命的，因此研究其与粘膜免疫反应的关系非常重要。

大量动物实验的结果显示，机体对食物的口服免疫耐受性与免疫系统的抑制性T淋巴细胞(Ts)的功能密切相关。

参与口服耐受性的 Ts细胞是CDs’T淋巴细胞，其表面的T细胞受体可能是αBTCR，迁移至肠系膜淋巴结后进入全身淋巴系统。

转基因植物疫苗是否会引起口服耐受，目前尚无定论。

5转基因植物疫苗研究展望
从过去近十年的研究中可以看出，转基因植物疫苗虽能引起特异性抗体的产生，但产生免疫保护所需的具体剂量还不十分清楚，目前的首要任务仍是提高重组基因在植物组织中的表达水平，解决增强其免疫原性的问题。

其次，考虑到安全性问题，如何在转基因植物的再生过程中筛选得到无抗生素抗性基因的植株也是今后的一个研究方向。

另外，还应选择合适的受体植物作为可饲(食)疫苗的应用。

谷类作物易于贮存、运输、室温稳定且在加工过程中抗原蛋白不失活，将其作为饲料原料的加工用于动物疾病的防治具有较大的可行性。

总之，虽然植物疫苗离临床应用为时尚远，但这一领域有着广阔的前景，吸引着广大科学研究者。