蛋白质的提取与分离纯化——生化实验设计讲解课件 PPT
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蛋白质分离技术全ppt课件
第十节
蛋白质 的分离与纯化
一、 引言
二、 蛋白质（酶）分 离纯化的前处理三、蛋白质（酶来自分离 与纯化四、层析技术
五、电泳技术
六、离心技术
1
一、 引言
• 蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。蛋白质是生物 功能的执行者，担负着生物催化、物质 运输、运动、防御、调控及记忆、识别 等多种生理功能。
化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷， 破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉 淀。
26
Salting-in
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
27
水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
水化膜 碱
酸
等点电时的蛋白质 （亲水胶体）
脱水
带负电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
• 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八 十多年的历史，其突出的优点是：
• ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 • ②操作简单、安全。 • ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
25
⑴ 盐析的基本原理
• 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水 化膜和电荷。
• 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 • 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水
• 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛 酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将 细胞壁分解。
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
蛋白质 的分离与纯化
一、 引言
二、 蛋白质（酶）分 离纯化的前处理三、蛋白质（酶来自分离 与纯化四、层析技术
五、电泳技术
六、离心技术
1
一、 引言
• 蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。蛋白质是生物 功能的执行者，担负着生物催化、物质 运输、运动、防御、调控及记忆、识别 等多种生理功能。
化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷， 破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉 淀。
26
Salting-in
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
27
水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
水化膜 碱
酸
等点电时的蛋白质 （亲水胶体）
脱水
带负电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
• 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八 十多年的历史，其突出的优点是：
• ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 • ②操作简单、安全。 • ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
25
⑴ 盐析的基本原理
• 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水 化膜和电荷。
• 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 • 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水
• 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛 酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将 细胞壁分解。
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定(共14张PPT)
而增加
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强， 因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀 低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛 孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟 用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强， 因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀 低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛 孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟 用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）
蛋白质的提取和分离ppt课件
答案 C
学习探究区
第14课时
带电性质 大小
本 课 栏 目 开 关
慢 快 小分子
匀浆
电泳 染色
自我检测区
第14课时
1． 在乳酸脱氢酶同工酶分离过程中， 使用缓冲液的作用
本 课 栏 目 开 关
是 A．维持溶液浓度不变 B．维持溶液酸碱度不变 C．催化蛋白质分离过程顺利完成 D．无实际意义
( B )
解析 分离蛋白质时加入缓冲液，其原因是缓冲液在 一定范围内能抵制外界酸和碱对反应溶液溶液 pH 的 影响，保持 pH 基本不变。
学习探究区
第14课时
带电性质 的 差 异 以 及 分 子 本 身 的 ______ 大小 、 种 分 子 __________ 形状 不同。使带电分子产生不同的迁移速度，从而实 ______
现样品中各种分子的分离。
本 课 栏 目 开 关
(2)常用方法种类 ①琼脂糖凝胶电泳：在电泳缓冲液和凝胶中加入琼脂
学习探究区
第14课时
活学活用 2．下列说法不正确的是
本 课 栏 目 开 关
(
)
A．在酶的提取和分离过程中必须保持其生物活性 B．将心脏研磨成匀浆时要在冰浴下进行，是为了保 证酶的活性 C．载样缓冲液中的溴酚蓝是一种酸碱缓冲物质，维 持 pH 稳定 D．电泳的结果是出现了 5 个条带，说明乳酸脱氢酶 有 5 种同工酶
学习探究区 3．结果分析
第14课时
本 课 栏 目 开 关
由图中电泳结果可以看出：
乳酸脱氢酶有5种同工酶 。 5 个条带说明 _______________________ (1)每个器官形成了 __ 心脏 中含量最高，在 ________ 骨骼肌 中含量最低，说明 (2)LDH2 在 _____ 不同的器官同一种同工酶的含量不同 。 _____________________________________ LDH5 ，含量最低的是 ________ LDH1 ， (3)骨骼肌中含量最高的是 _______ 同一器官不同的同工酶含量不同 。 说明 _________________________________
学习探究区
第14课时
带电性质 大小
本 课 栏 目 开 关
慢 快 小分子
匀浆
电泳 染色
自我检测区
第14课时
1． 在乳酸脱氢酶同工酶分离过程中， 使用缓冲液的作用
本 课 栏 目 开 关
是 A．维持溶液浓度不变 B．维持溶液酸碱度不变 C．催化蛋白质分离过程顺利完成 D．无实际意义
( B )
解析 分离蛋白质时加入缓冲液，其原因是缓冲液在 一定范围内能抵制外界酸和碱对反应溶液溶液 pH 的 影响，保持 pH 基本不变。
学习探究区
第14课时
带电性质 的 差 异 以 及 分 子 本 身 的 ______ 大小 、 种 分 子 __________ 形状 不同。使带电分子产生不同的迁移速度，从而实 ______
现样品中各种分子的分离。
本 课 栏 目 开 关
(2)常用方法种类 ①琼脂糖凝胶电泳：在电泳缓冲液和凝胶中加入琼脂
学习探究区
第14课时
活学活用 2．下列说法不正确的是
本 课 栏 目 开 关
(
)
A．在酶的提取和分离过程中必须保持其生物活性 B．将心脏研磨成匀浆时要在冰浴下进行，是为了保 证酶的活性 C．载样缓冲液中的溴酚蓝是一种酸碱缓冲物质，维 持 pH 稳定 D．电泳的结果是出现了 5 个条带，说明乳酸脱氢酶 有 5 种同工酶
学习探究区 3．结果分析
第14课时
本 课 栏 目 开 关
由图中电泳结果可以看出：
乳酸脱氢酶有5种同工酶 。 5 个条带说明 _______________________ (1)每个器官形成了 __ 心脏 中含量最高，在 ________ 骨骼肌 中含量最低，说明 (2)LDH2 在 _____ 不同的器官同一种同工酶的含量不同 。 _____________________________________ LDH5 ，含量最低的是 ________ LDH1 ， (3)骨骼肌中含量最高的是 _______ 同一器官不同的同工酶含量不同 。 说明 _________________________________
蛋白质的提取与分离纯化——生化实验设计讲解课件讲解学习
值得注意的是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白 质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析 以除去小分子的配基。
凝胶层析法属最常用的蛋白质分离方法。系混合
物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时， 混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。 在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶 网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子 量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速 缓慢，致使最后流出柱外。
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当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁 移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，
式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常 数若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质 在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即 可在标准曲线上求得分子量。
玻璃匀浆机
b、细胞器的分离
细胞器的分离一般采用差速离心法。细 胞经过破碎后，在适当介质中进行差速 离心。
三、蛋白质粗提取
从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的， 需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质 分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条 件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是 有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质 （如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后 操作。常用有机溶剂提取除去。
二、a 细胞的破碎
⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破 坏。常用器械有： ①玻璃匀浆器（用两个磨砂面相 互摩擦，将细胞磨碎） ②高速组织捣碎机（转速可 达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于 动物内脏组织的破碎 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织 细胞破碎的方法。 Ⅰ反复冻融法 Ⅱ冷热变替法 Ⅲ超 声波法 ⑶化学及生物化学方法
蛋白质的分离和纯化精品课件
( A)
• A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果
• B、气泡阻碍蛋白质的运动 • C、气泡与蛋白质发生化学反应 • D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密
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34
2、样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A
• A 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱 内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
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40
4、在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷
酸缓冲液处理的目的是 A.防止血红蛋白被O2氧化
( D)
B.血红蛋白是一种碱性物质，需要酸中和
C.磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程
D.让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其 结构和功能
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41
5、下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的
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50cm高
32
样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到 与凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶 端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样， 同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝 胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
• B.采用透析法使蛋白质与其他小分子化合 物分离开来
• C.离心沉降法通过控制离心速率使分子大 小、密度不同的蛋白质分离
• D.蛋白质在电场中可以向与其自身所带电 荷相同的电极方向移动
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18
三、血红蛋白的提取和分离
1.样品处理 2.粗分离 3.纯化 4.纯度鉴定
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19
1.样品处理
叙述中，正确的是 ( D )
A.用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去 除细胞表面杂蛋白
• A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果
• B、气泡阻碍蛋白质的运动 • C、气泡与蛋白质发生化学反应 • D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密
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2、样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A
• A 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱 内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
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4、在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷
酸缓冲液处理的目的是 A.防止血红蛋白被O2氧化
( D)
B.血红蛋白是一种碱性物质，需要酸中和
C.磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程
D.让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其 结构和功能
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5、下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的
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50cm高
32
样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到 与凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶 端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样， 同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝 胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
• B.采用透析法使蛋白质与其他小分子化合 物分离开来
• C.离心沉降法通过控制离心速率使分子大 小、密度不同的蛋白质分离
• D.蛋白质在电场中可以向与其自身所带电 荷相同的电极方向移动
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三、血红蛋白的提取和分离
1.样品处理 2.粗分离 3.纯化 4.纯度鉴定
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1.样品处理
叙述中，正确的是 ( D )
A.用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去 除细胞表面杂蛋白
蛋白的分离纯化详解课件PPT
的分离。 2021/3/10
23
电泳（electrophoresis）
• 带电粒子在电场中向与自身电荷相反的电 极移动的现象称为电泳。蛋白质在电场中 泳动时，受到电场力和摩擦力两种方向相 反的力的作用
• 蛋白质因带电、大小和形状不同而在直流 电场中泳动速度不同。
2021/3/10
24
常用蛋白质电泳技 术
2021/3/10
20
3. 亲和层析
• 以样品的生物活性为依据的分离方法。生物分子 的特点是有专一的活性，如酶与底物的结合，抗 原与抗体，激素与受体，糖与凝集素……等。
• 将上述作用体系的一方连接到层析基质上，使之 固定化，就有可能分离纯化专一作用的另一方。
2021/3/10
21
各种用于抗体识别的标记
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蛋白质的纯化
• 粗分离只是使蛋白质得到浓缩和初步分离 纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大 小、分子形状、分子表面特征或分子带电 状况进一步纯化，这就是蛋白质细分级。
• 常用的实验技术：层析（离子交换等）和 电泳
2021/3/10
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1. 离子交换层析
固相支持物：纤维素、琼脂糖、葡聚糖等高分子聚 合物
• 方法：尿素变性复性从包涵体中纯 化原核表达蛋白
2021/3/10
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二、蛋白质的分离纯化
2021/3/10
10
分离纯化流程
原材料的获取
预处理 （沉淀）
纯化
细胞破碎
研磨 超声 渗透压 酶 ……
2021/3/10
蛋白溶解
酸、碱 醇 去垢剂 尿素 ……
粗提
沉淀 相分离 分子筛 ……
精提
各种色谱 电泳分离 差速离心 ……
《蛋白质的分离纯化》PPT课件
蛋白质的理化性质及分离纯化
精选课件ppt
1
第一节 蛋白质的理化性质 第二节 蛋白质的分离纯化 第三节 蛋白质的分子量测定 第四节 蛋白质的含量测定与纯度鉴定
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2
第一节 蛋白质的理化性质
一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的紫外吸收性质 三、蛋白质的胶体性质和沉淀 四、蛋白质的变性和复性 五、蛋白质的呈色反应
精选课件ppt
40
等电聚焦电泳装置
实际上是利用缓冲液在 电场作用下在凝胶内沿电场 方向制造一个pH梯度。所 用的缓冲液是低分子量的有 机酸和碱的混合物，该混合 物称之两性电解质。
当蛋白质样品在这样的
凝胶上电泳时，每种蛋白质
都将迁移至与它的pI 相一
致的pH处，具有不同pI的
各种蛋白质最后都迁移至凝
当 pH < pI， 蛋白质带正电荷与
生物碱试剂
反应
某些酸根负离子
不溶性沉淀
精选课件ppt
11
5. 加热变性沉淀法
几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。 当蛋白质处于等电点时,加热凝固最完全和最迅速。
加热变性引起蛋白质凝固的原因：
可能是由于热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外 露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破 坏了带电状态。
所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等
电点相同而分子量不同的蛋白质分精选开课件。ppt
43
5.层析聚焦(P310)
是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。
特种多缓冲液 混和蛋白质样品
特种多 缓冲液
特种多 缓冲液
特种多 缓冲液
PH 降低
换特 剂种
多 缓 冲 交
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1
第一节 蛋白质的理化性质 第二节 蛋白质的分离纯化 第三节 蛋白质的分子量测定 第四节 蛋白质的含量测定与纯度鉴定
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第一节 蛋白质的理化性质
一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的紫外吸收性质 三、蛋白质的胶体性质和沉淀 四、蛋白质的变性和复性 五、蛋白质的呈色反应
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40
等电聚焦电泳装置
实际上是利用缓冲液在 电场作用下在凝胶内沿电场 方向制造一个pH梯度。所 用的缓冲液是低分子量的有 机酸和碱的混合物，该混合 物称之两性电解质。
当蛋白质样品在这样的
凝胶上电泳时，每种蛋白质
都将迁移至与它的pI 相一
致的pH处，具有不同pI的
各种蛋白质最后都迁移至凝
当 pH < pI， 蛋白质带正电荷与
生物碱试剂
反应
某些酸根负离子
不溶性沉淀
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11
5. 加热变性沉淀法
几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。 当蛋白质处于等电点时,加热凝固最完全和最迅速。
加热变性引起蛋白质凝固的原因：
可能是由于热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外 露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破 坏了带电状态。
所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等
电点相同而分子量不同的蛋白质分精选开课件。ppt
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5.层析聚焦(P310)
是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。
特种多缓冲液 混和蛋白质样品
特种多 缓冲液
特种多 缓冲液
特种多 缓冲液
PH 降低
换特 剂种
多 缓 冲 交
《蛋白质分离、纯化》PPT课件
聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）
整理ppt
15
带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
16
凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
整理ppt
43
蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
整理ppt
44
• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
整理ppt
12
一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
整理ppt
13
凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
整理ppt
15
带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
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凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
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蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
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• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
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一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
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13
凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
《蛋白质的提取》PPT课件
血红蛋白的分离和纯化红细胞离心破碎红细胞释放血红蛋白从各红细胞的成分中获取血红蛋白离心初步纯化血红蛋白透析精选ppt48精选ppt49精选ppt50精选ppt51精选ppt52精选ppt53精选ppt54精选ppt55精选ppt56精选ppt57精选ppt58精选ppt59精选ppt60精选ppt61比较项目实验原理方法步骤适用范围水蒸气蒸馏法萃取法压榨法利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来使芳香油溶解在有机溶剂中蒸发后得到芳香油通过机械加压压榨出果皮中的芳香油水蒸汽蒸馏分离油层除水过滤粉碎干燥萃取过滤浓缩石灰水浸泡漂洗压榨过滤静臵再次过滤提取玫瑰油薄荷油等挥发性强的芳香油原料颗粒尽可能细小能充分浸泡在有机溶剂中适用于柑橘柠檬等易焦糊原料的提取精选ppt62精选ppt63采集玫瑰花
精选课件ppt
46
本节内容目标：血红蛋白的分离和纯化
获取 红细胞 （离心）
破碎红细胞， 释放血红蛋白
从各红细胞 的成分中获 取血红蛋白 （离心）
初步纯化 血红蛋白 （透析）
精选课件ppt
47
从生物材料中提取某些特定 成分
精选课件ppt
48
背景知识
早在古代，人类就已发现芳香气味 的植株或花卉能使人神清气爽，将这些 植物制成干品后，可当做药物和香料使 用。但是，植物香料易挥发，不易储存。 欧洲中世纪香料贸易的发展，促成了植 物芳香油提取技术的诞生。
精选课件ppt
34
血清蛋白参考值
清蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β球蛋白 γ球蛋白
等电点 4.64
分子量 （kDa）
69
5.06
200
5.06
300
5.12
90~150
6.85
156~950
精选课件ppt
46
本节内容目标：血红蛋白的分离和纯化
获取 红细胞 （离心）
破碎红细胞， 释放血红蛋白
从各红细胞 的成分中获 取血红蛋白 （离心）
初步纯化 血红蛋白 （透析）
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47
从生物材料中提取某些特定 成分
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48
背景知识
早在古代，人类就已发现芳香气味 的植株或花卉能使人神清气爽，将这些 植物制成干品后，可当做药物和香料使 用。但是，植物香料易挥发，不易储存。 欧洲中世纪香料贸易的发展，促成了植 物芳香油提取技术的诞生。
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血清蛋白参考值
清蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β球蛋白 γ球蛋白
等电点 4.64
分子量 （kDa）
69
5.06
200
5.06
300
5.12
90~150
6.85
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蛋白质分离纯化技术PPT课件
第11页/共15页
根据蛋白质带电状态分离
离子交换层析IEC是根据蛋白质的两性解离性质、在溶液中所带 电荷不同进行分离的。
离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电 荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。当蛋白质处于不同的 pH值条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋 白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的 蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交 换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中 的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
第5页/从细胞破碎一步开始蛋白质就脱离 了天然的环境，受到各种不同试剂的干扰，其结构和功能会受 到不同程度的可逆或不可逆的损害。因此，在蛋白质纯化的各 步骤都要小心地控制所采用的提纯条件，以避免蛋白质变性。
在提纯蛋白质过程中需要在每一步检测蛋白质（酶）的存 在及提纯的情况，即建立蛋白质定量检测方法。
第3页/共15页
蛋白质的抽提
一般的蛋白质通常选择适当的缓冲溶液把蛋白质提取出来，再 用离心法除去不溶物得到含有目的物的粗抽提液。抽提所用缓冲溶 液的PH值、离子强度、组成成分等应根据目的蛋白质的性质而定。
第4页/共15页
蛋白质粗分级
采用分级盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方 法将目标蛋白质与其他蛋白质分离开来。
蛋白质分离与纯化技术
蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生 命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的 物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。
蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物当中分离纯化 出所需要的目的蛋白质的方法。由于深入研究蛋白质的结构与功能 需要用到高纯度的蛋白质，因此蛋白质分离与纯化技术是生物产业 中的核心技术。
根据蛋白质带电状态分离
离子交换层析IEC是根据蛋白质的两性解离性质、在溶液中所带 电荷不同进行分离的。
离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电 荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。当蛋白质处于不同的 pH值条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋 白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的 蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交 换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中 的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
第5页/从细胞破碎一步开始蛋白质就脱离 了天然的环境，受到各种不同试剂的干扰，其结构和功能会受 到不同程度的可逆或不可逆的损害。因此，在蛋白质纯化的各 步骤都要小心地控制所采用的提纯条件，以避免蛋白质变性。
在提纯蛋白质过程中需要在每一步检测蛋白质（酶）的存 在及提纯的情况，即建立蛋白质定量检测方法。
第3页/共15页
蛋白质的抽提
一般的蛋白质通常选择适当的缓冲溶液把蛋白质提取出来，再 用离心法除去不溶物得到含有目的物的粗抽提液。抽提所用缓冲溶 液的PH值、离子强度、组成成分等应根据目的蛋白质的性质而定。
第4页/共15页
蛋白质粗分级
采用分级盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方 法将目标蛋白质与其他蛋白质分离开来。
蛋白质分离与纯化技术
蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生 命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的 物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。
蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物当中分离纯化 出所需要的目的蛋白质的方法。由于深入研究蛋白质的结构与功能 需要用到高纯度的蛋白质，因此蛋白质分离与纯化技术是生物产业 中的核心技术。
蛋白质的分离与纯化技术(2007-2008).ppt
除盐的方法：常用的是透析，此外也可用葡萄糖凝胶G-25或
G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
2020/12/22
28
等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力 最小，因而溶解度也最小。
各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节 溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉 淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结 合用。
因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低，蛋白质分子 表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了 蛋白质分子的聚集和沉淀。
有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相似， 与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚集而沉淀。
2020/12/22
31
(3) 细分级分离 (fine fractionation)
2020/12/22
18
如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞 核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用 差速离心方法将它们分开
如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞
器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构
解聚，然后用适当的介质提取。
2020/12/22
19
细胞破碎方法总结
2020/12/22
蛋白质的分离与纯化技术(20072纯化的目的 二． 蛋白质分离纯化的依据（蛋白质的特
性） 三． 蛋白质稳定存在的影响因素 四． 蛋白质分离纯化的一般程序 五． 蛋白质的分离纯化方法 六． 浓缩、干燥及保存
2020/12/22
2
一、蛋白质分离纯化的目的
研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理
2020/12/22
4
蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分 子中保留着游离的末端α—氨基和α—羧 基以及侧链上的各种功能团。蛋白质也 是一类两性电解质，能和酸或碱发生作 用。可解离基团主要来自侧链上的功能 团。
G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
2020/12/22
28
等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力 最小，因而溶解度也最小。
各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节 溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉 淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结 合用。
因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低，蛋白质分子 表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了 蛋白质分子的聚集和沉淀。
有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相似， 与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚集而沉淀。
2020/12/22
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(3) 细分级分离 (fine fractionation)
2020/12/22
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如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞 核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用 差速离心方法将它们分开
如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞
器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构
解聚，然后用适当的介质提取。
2020/12/22
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细胞破碎方法总结
2020/12/22
蛋白质的分离与纯化技术(20072纯化的目的 二． 蛋白质分离纯化的依据（蛋白质的特
性） 三． 蛋白质稳定存在的影响因素 四． 蛋白质分离纯化的一般程序 五． 蛋白质的分离纯化方法 六． 浓缩、干燥及保存
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一、蛋白质分离纯化的目的
研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理
2020/12/22
4
蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分 子中保留着游离的末端α—氨基和α—羧 基以及侧链上的各种功能团。蛋白质也 是一类两性电解质，能和酸或碱发生作 用。可解离基团主要来自侧链上的功能 团。
《蛋白质分离纯化》PPT课件
选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的 配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连 接。将这种连接有配基的载体装入层析柱中。
当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋 白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱 上，而其它蛋白质那么流出柱外。被特异性结合 在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液 洗脱。
发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用 (Precipitation)。
的 纯 化
因为蛋白质分子量大小不同、外表所代 电荷不同、外表的亲水和疏水区域不同，
方 所以可以通过可逆沉淀法将蛋白质别离
法 出来。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
沉淀法具有局部纯化、浓缩特点。
盐析
蛋 白
蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水 化层被破坏和外表电荷被中和，容易发生
五、 蛋白质含量的测定
定氮法：灵敏度较低 双羧脲法：样品量0.2-1.7mg/L Folin-Lowry法：在碱性条件下磷钼酸、磷
钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反响，生成 蓝色化合物，将其与双羧脲法结合起来，蛋白 质形成两种颜色的混合物老绿色，在650nm 具有特定的吸收。灵敏度较高25g250g/ml.
6000转/分 2-3万转/分 3万转/分
2．沉降系数〔S〕概念
沉降系数〔S〕
生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉 降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从 静止状态到达极限速度所需要的时间。其单位用 Svedberg，即S表示，S=1×10-13秒。
沉降系数〔S〕与分子量〔M〕的关系 Svederg方程: M = RTS D(1-)
中移动的速度〔v〕取决于电场强度(E)，所带
的净电荷(q)以及与介质的摩擦系数(f)。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋 白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱 上，而其它蛋白质那么流出柱外。被特异性结合 在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液 洗脱。
发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用 (Precipitation)。
的 纯 化
因为蛋白质分子量大小不同、外表所代 电荷不同、外表的亲水和疏水区域不同，
方 所以可以通过可逆沉淀法将蛋白质别离
法 出来。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
沉淀法具有局部纯化、浓缩特点。
盐析
蛋 白
蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水 化层被破坏和外表电荷被中和，容易发生
五、 蛋白质含量的测定
定氮法：灵敏度较低 双羧脲法：样品量0.2-1.7mg/L Folin-Lowry法：在碱性条件下磷钼酸、磷
钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反响，生成 蓝色化合物，将其与双羧脲法结合起来，蛋白 质形成两种颜色的混合物老绿色，在650nm 具有特定的吸收。灵敏度较高25g250g/ml.
6000转/分 2-3万转/分 3万转/分
2．沉降系数〔S〕概念
沉降系数〔S〕
生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉 降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从 静止状态到达极限速度所需要的时间。其单位用 Svedberg，即S表示，S=1×10-13秒。
沉降系数〔S〕与分子量〔M〕的关系 Svederg方程: M = RTS D(1-)
中移动的速度〔v〕取决于电场强度(E)，所带
的净电荷(q)以及与介质的摩擦系数(f)。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
蛋白质分离纯化技术ppt课件
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10
紫外分光光度法测定蛋白质含量的 实验原理
1.蛋白质分子中，酪氨酸和色氨酸残基含有共轭双键， 使蛋白质具有吸收近紫外光的性质。吸收高峰在280nm 处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。
2.蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。 利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓 度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
.
24
考马斯亮兰G-250
实验原理：考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白 质结合，使染料的最大吸收峰的位置(max),由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为， 染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸和赖
氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
.
6
测定分两步：
① 用沸浓硫酸消化，并以硫酸铜为催化剂，使碳、氢分 别以二氧化碳及水蒸汽形态逸去，而氮转为铵盐。此 过程需时较长，可达数小时。
② 加碱，并将氨自碱液中蒸至标准酸液中，测定中和氨 所消耗的酸量，计算出样品中含氮量，再乘以6．25 （经验平均值），则得蛋白质含量。
.
7
反应：以甘氨酸为例
测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶 剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度 值A280。蛋白质浓度可控制在0.1～ 1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准 石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此 可立即计算出蛋白质的大致浓度。
（二）Folin－酚试剂法（Lowry法）
实验原理:蛋白质中的肽键在碱性条件下与Cu2+反 应，生产紫红色蛋白质-Cu2+复合物，这一复合物 中的氨基酸残基（主要是酪氨酸、色氨酸、半胱 氨酸）还原Folin—酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸 盐，产生钼兰和钨兰复合物的深兰色（745750nm），颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。
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B、定量分析
紫外检测法、考马斯亮蓝法、Folin-酚试剂法（最常用方法）
Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下， 蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物
将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin 试剂）还原，产生深蓝色 （磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正 比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范 围为5～100μg 蛋白质。Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色 氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和 巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、 色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。
玻璃匀浆机
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
b、细胞器的分离
细胞器的分离一般采用差速离心法。细 胞经过破碎后，在适当介质中进行差速 离心。
三、蛋白质粗提取
从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的， 需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质 分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条 件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是 有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质 （如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后 操作。常用有机溶剂提取除去。
文献查得： 钙调蛋白（CaM）是由148个氨基
酸组成的单链分子,其pI值在3.9-4.1之 间,分子量约为17KDa.该蛋白能够耐一 定的高温，在90oC加热3-4min后仍然 能够保持80%的活性。该蛋白分子中 含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合 后可以暴露出它的疏水基团。
整个实验过程一般可分为 5 个阶段：
四、精细纯化
金属螯合亲和层析
固定化金属螯合亲和层析是建立在蛋白质表面 的氨基酸与固定化金属离子的亲和力的不同来进行 蛋白质分离的一项技术。过渡态金属离子能够与电 子供体，如氮、硫、氧等原子以配位键结合，金属 离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点，当它在 溶液中会被水分子或阴离子占据。
钙调蛋白的外形似哑铃,有两个球形的末端,中 间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连,每个末端 有两个Ca2+ 结构域,每个结构域可以结合一个Ca2+ , 这样,一个钙调蛋白可以结合4个Ca2+ ,钙调蛋白与 Ca2+ 结合后的构型相当稳定 。
五、分析鉴定
A、定性分析
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量：是在聚 丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂 分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂 能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还 原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的 SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质 丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子 团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异， 由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳·时， 蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁 移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，
式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常 数若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质 在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即 可在标准曲线上求得分子量。
三、蛋白质粗提取
步骤原：理：利用蛋白质在PH等电点时的溶 1．解向度试最管小中加，入因磷而酸会氢以二沉钠淀和柠的檬方酸式，析使出其。PH=4。 2．试将剂提：取柠的溶檬液酸加、入磷到酸第氢1步二骤钠所配的缓冲液中。
3．静置一段时间，待沉淀完全。 4．过滤或离心出粗产品。 注意事项：防止局部过酸或过碱造成蛋白质变性。
二、a 细胞的破碎
⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破 坏。常用器械有： ①玻璃匀浆器（用两个磨砂面相 互摩擦，将细胞磨碎） ②高速组织捣碎机（转速可 达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于 动物内脏组织的破碎 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织 细胞破碎的方法。 Ⅰ反复冻融法 Ⅱ冷热变替法 Ⅲ超 声波法 ⑶化学及生物化学方法
值得注意的是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白 质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析 以除去小分子的配基。
凝胶层析法属最常用的蛋白质分离方法。系混合
物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时， 混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。 在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶 网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子 量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速 缓慢，致使最后流出柱外。
蛋白质的提取与分离纯化——生化实验设计 讲解课件
已知某蛋白的分子量约为17 kDa，等电点 3.9~4.1，它能耐一定的高温，在90 C加热 3~4 min后仍然能够保持80%的活性。该蛋白 含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴 露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体 内酶的激活剂。请设计一个从脑组织中提取和 分离纯化该蛋白的实验方案，要求写出具体的 步骤和理由，以及检测方法。
①材料的选择和预处理 ②细胞的破碎（有时 需进行细胞器的分离）③提取 ④纯化（包括等 电点沉降法，盐析，有机溶剂沉淀，吸附、层析、 等）⑤分析鉴定。
实验骤：
一、材料的选定：大鼠脑组织 预处理： 将切取的组织用4℃预
冷的0.01mol/l的PBS漂洗去血渍，再用 滤纸吸干残留的PBS（磷酸盐缓冲液 ） 。