第十二章-食品中转基因成分的检测
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基因组 启动子 外源目的基因 终止子 基因组
基因重组体示意图
4
外源基因表达的产物主要包括：目的基
因、标记基因和报告基因表达的蛋白，
或意外表达的蛋白。 使得其具有有传统食物有不同的生物特
性，由此产生安全性问题。
5
第二节 食品中转基因成分检验
检测方法概述 主要针对外源DNA 及其表达产物
DNA 分析 蛋白质抗原 特性
2
转基因食品的特征
• 具有其原有基因表达的性状和功能
• 存在外源DNA的表达产物及其生物活性
3
基因重组体
• 载体：自我复制，运载工具 • 目的基因：转基因生物性状改变直接相关DNA • 调控元件：使目的基因表达精确开始和终止， 表达增强 • 标记基因：进行标记以便筛选转化细胞 • 报告基因：编码某种易于检测蛋白质或酶的基 因
15
CTAB法主要试剂
• 按下表配置试剂，定容至200m百度文库,高压灭菌
16
DNA质量和纯度检测
琼脂糖凝胶电泳
在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶里进行电泳，紫外 灯下观察DNA条带判断
核酸定量检测
紫外分光光度计测定基因组DNA溶液的OD值， OD260/OD280一般在1.7~ 1.9，高了表明有RNA污 染，低了表明有蛋白质或有机溶剂污染。
11
DNA提取及纯化
转基因成分检测时需要先提取总DNA，利用 去污剂或有机溶剂破坏细胞膜，裂解细胞，是 DNA与蛋白质分离并游离于提取液中，然后 去除杂质成分。 DNA纯化的原理是根据乙醇或异丙醇竞争结 合水分子的能力远强于DNA，在DNA提取液 中加入乙醇或异丙醇，DNA因溶解度降低而 析出。
18
变性：94℃
退火：56℃
延伸： 72℃
19
我国标准检测方法
核酸PCR定性检测：检测目标基因是否存在 （有没有） 核酸PCR定量检测：检测目标基因存在的量 （有多少）
20
1 核酸PCR定性检测
检测原理是定性PCR检测对象包括转基因 食品目的基因、启动子、终止子、标记基 因等外源基因和元件。 根据转基因产品的特异性序列设计引物， 对试样中外源目的基因进行PCR扩增。依 据扩增产物中是否存在预期特异性片段， 判断样品中是否含有转基因成分。
21
为了提高反应准确性，在试样PCR反应 的同时，应设置阴性和阳性对照。 在阳性对照PCR反应时，内源基因和待 测样品的特异性序列都得到扩增，阴性 对照没有任何扩增，表明PCR体系正常 工作。
22
2 实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR是在普通PCR反应体系中，增 加能与模版结合的两端有荧光基团标记的寡聚核 苷酸探针。 在PCR体系中加入一对引物的同时加入一个特异 性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别 标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基 团吸收。PCR扩增时，两条引物分别与待扩增目 的DNA片段的5’端和3’端互补结合；探针则与两 条引物之间的目的DNA片段互补结合。
8
采样要求
3 抽样数量：根据转基因限量水平确定 每批中应抽取的原始样品最小数量 4 样品制备与保存：分三份，用于检测， 复检和备查；及时加贴标签，注明编号、 货物名称、品种、抽样时间、抽样人及 其他必要信息
9
外源基因检测
• 根据检测目的和检测结果特异性水平不同，
检测方法可分为四类：
初筛试验：普遍存在的基因重组通用元件 基因特异性试验：基因重组体中含有的外源基因 组成结构特异性试验：目的基因与调控基因连接 处的核苷酸序列
14
CTAB法原理
CTAB能溶解细胞膜并能与DNA结合成CTABDNA复合物，该复合物可溶解于高盐溶液中 （如氯化钠），蛋白质、多糖等物质在此溶解 中因溶解度降低而生成沉淀，经离心后与复合 物分离；然后将该复合物置于低盐溶液中，因 其不溶性而沉淀析出；最后将复合物沉淀溶解 于高盐溶液中，加入乙醇使DNA沉淀，离心 后获得纯化的DNA。
12
DNA提取方法
一类：改进的传统方法，如苯酚-氯仿法、 溴化十六烷基三甲基胺法（简称CTAB 法）、二氧化硅法等。 第二类：试剂盒法，试剂盒法因为操作 简便而被广泛应用。
13
CTAB法
样本准备：
固体样本要研磨成大小在2mm以下的颗粒， 也可以用液氮研磨至DNA充分释放并满足 DNA提取的要求； 液态样本可以通过离心沉淀、加热蒸发、冷冻 干燥等方法得到干物质用于DNA提取。
第十二章
食品中转基因成分检验
1
第一节 概述
• 转基因生物：利用基因工程技术改变基因组的构成， 用于农业生产或者农产品加工动植物、微生物及产品。 主要是转基因植物。 • 转基因食品： ①：转基因动植物、微生物产品，如转基因大豆 ②：转基因动植物、微生物产品直接加工品，如转基因大 豆油 ③：以① 和②为原料生产的食品和添加剂，如转基因大 豆油加工成的人造奶油。 • 转基因成分（外源基因成分）：物种本身不具有的，而 是来源于其他物种的功能基因序列。
17
核酸PCR检测
PCR即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特 定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作 是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点， 是能将微量的DNA大幅增加。 PCR反应体系是由DNA模版、引物、dNTP 、 DNA聚合酶、镁离子和缓冲液等组成。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过 程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核 苷酸引物。
事件特异性试验：插入的基因序列和植物基因组 之间的连接区
10
DNA提取及纯化
• 为什么要提取纯化？
植物细胞中DNA主要存在于细胞核和细胞质 中，细胞中各种DNA称为总DNA，其中95% 以上的DNA是与蛋白质结合存在的。植物细 胞中还存在大量多糖、蛋白质、多糖、多酚类 物质和RNA等成分。 这些物质都会影响后续 DNA的PCR检测。
PCR法
ELISA和 蛋白印迹法
6
检测流程
采样 混样 样品制备 目标物质提取
结果判断
PCR或蛋白质检测
结果报告
7
采样要求
1 一般规定：所用器具清洁干燥无DNA 和蛋白质污染；避免样品散落，防止污 染生态环境；短时间内完成，避免样品 组成发生变化 2 抽样方法：随机原则；“三层五点”； 若加工工程损坏DNA,则加大采样量
基因重组体示意图
4
外源基因表达的产物主要包括：目的基
因、标记基因和报告基因表达的蛋白，
或意外表达的蛋白。 使得其具有有传统食物有不同的生物特
性，由此产生安全性问题。
5
第二节 食品中转基因成分检验
检测方法概述 主要针对外源DNA 及其表达产物
DNA 分析 蛋白质抗原 特性
2
转基因食品的特征
• 具有其原有基因表达的性状和功能
• 存在外源DNA的表达产物及其生物活性
3
基因重组体
• 载体：自我复制，运载工具 • 目的基因：转基因生物性状改变直接相关DNA • 调控元件：使目的基因表达精确开始和终止， 表达增强 • 标记基因：进行标记以便筛选转化细胞 • 报告基因：编码某种易于检测蛋白质或酶的基 因
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CTAB法主要试剂
• 按下表配置试剂，定容至200m百度文库,高压灭菌
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DNA质量和纯度检测
琼脂糖凝胶电泳
在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶里进行电泳，紫外 灯下观察DNA条带判断
核酸定量检测
紫外分光光度计测定基因组DNA溶液的OD值， OD260/OD280一般在1.7~ 1.9，高了表明有RNA污 染，低了表明有蛋白质或有机溶剂污染。
11
DNA提取及纯化
转基因成分检测时需要先提取总DNA，利用 去污剂或有机溶剂破坏细胞膜，裂解细胞，是 DNA与蛋白质分离并游离于提取液中，然后 去除杂质成分。 DNA纯化的原理是根据乙醇或异丙醇竞争结 合水分子的能力远强于DNA，在DNA提取液 中加入乙醇或异丙醇，DNA因溶解度降低而 析出。
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变性：94℃
退火：56℃
延伸： 72℃
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我国标准检测方法
核酸PCR定性检测：检测目标基因是否存在 （有没有） 核酸PCR定量检测：检测目标基因存在的量 （有多少）
20
1 核酸PCR定性检测
检测原理是定性PCR检测对象包括转基因 食品目的基因、启动子、终止子、标记基 因等外源基因和元件。 根据转基因产品的特异性序列设计引物， 对试样中外源目的基因进行PCR扩增。依 据扩增产物中是否存在预期特异性片段， 判断样品中是否含有转基因成分。
21
为了提高反应准确性，在试样PCR反应 的同时，应设置阴性和阳性对照。 在阳性对照PCR反应时，内源基因和待 测样品的特异性序列都得到扩增，阴性 对照没有任何扩增，表明PCR体系正常 工作。
22
2 实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR是在普通PCR反应体系中，增 加能与模版结合的两端有荧光基团标记的寡聚核 苷酸探针。 在PCR体系中加入一对引物的同时加入一个特异 性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别 标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基 团吸收。PCR扩增时，两条引物分别与待扩增目 的DNA片段的5’端和3’端互补结合；探针则与两 条引物之间的目的DNA片段互补结合。
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采样要求
3 抽样数量：根据转基因限量水平确定 每批中应抽取的原始样品最小数量 4 样品制备与保存：分三份，用于检测， 复检和备查；及时加贴标签，注明编号、 货物名称、品种、抽样时间、抽样人及 其他必要信息
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外源基因检测
• 根据检测目的和检测结果特异性水平不同，
检测方法可分为四类：
初筛试验：普遍存在的基因重组通用元件 基因特异性试验：基因重组体中含有的外源基因 组成结构特异性试验：目的基因与调控基因连接 处的核苷酸序列
14
CTAB法原理
CTAB能溶解细胞膜并能与DNA结合成CTABDNA复合物，该复合物可溶解于高盐溶液中 （如氯化钠），蛋白质、多糖等物质在此溶解 中因溶解度降低而生成沉淀，经离心后与复合 物分离；然后将该复合物置于低盐溶液中，因 其不溶性而沉淀析出；最后将复合物沉淀溶解 于高盐溶液中，加入乙醇使DNA沉淀，离心 后获得纯化的DNA。
12
DNA提取方法
一类：改进的传统方法，如苯酚-氯仿法、 溴化十六烷基三甲基胺法（简称CTAB 法）、二氧化硅法等。 第二类：试剂盒法，试剂盒法因为操作 简便而被广泛应用。
13
CTAB法
样本准备：
固体样本要研磨成大小在2mm以下的颗粒， 也可以用液氮研磨至DNA充分释放并满足 DNA提取的要求； 液态样本可以通过离心沉淀、加热蒸发、冷冻 干燥等方法得到干物质用于DNA提取。
第十二章
食品中转基因成分检验
1
第一节 概述
• 转基因生物：利用基因工程技术改变基因组的构成， 用于农业生产或者农产品加工动植物、微生物及产品。 主要是转基因植物。 • 转基因食品： ①：转基因动植物、微生物产品，如转基因大豆 ②：转基因动植物、微生物产品直接加工品，如转基因大 豆油 ③：以① 和②为原料生产的食品和添加剂，如转基因大 豆油加工成的人造奶油。 • 转基因成分（外源基因成分）：物种本身不具有的，而 是来源于其他物种的功能基因序列。
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核酸PCR检测
PCR即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特 定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作 是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点， 是能将微量的DNA大幅增加。 PCR反应体系是由DNA模版、引物、dNTP 、 DNA聚合酶、镁离子和缓冲液等组成。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过 程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核 苷酸引物。
事件特异性试验：插入的基因序列和植物基因组 之间的连接区
10
DNA提取及纯化
• 为什么要提取纯化？
植物细胞中DNA主要存在于细胞核和细胞质 中，细胞中各种DNA称为总DNA，其中95% 以上的DNA是与蛋白质结合存在的。植物细 胞中还存在大量多糖、蛋白质、多糖、多酚类 物质和RNA等成分。 这些物质都会影响后续 DNA的PCR检测。
PCR法
ELISA和 蛋白印迹法
6
检测流程
采样 混样 样品制备 目标物质提取
结果判断
PCR或蛋白质检测
结果报告
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采样要求
1 一般规定：所用器具清洁干燥无DNA 和蛋白质污染；避免样品散落，防止污 染生态环境；短时间内完成，避免样品 组成发生变化 2 抽样方法：随机原则；“三层五点”； 若加工工程损坏DNA,则加大采样量