选修三1.1基因工程第一轮复习1

耐高温
（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数 量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2 为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高 的退火温度？__引_物__对__B___。
（3）图1步骤③所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱 基序列是否有专一性要求？否。 （4）为将外源基因转入马铃薯，图1步骤⑥转基因所用的 细菌B通常为 农杆菌 。
（3） 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。 （4） 载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到 除受体细胞外的其他生物细胞中去。
（5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大 就不便操作。
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人 工改造后才能用于基因工程操作。
（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的 3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个 DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段 之间形成磷酸二酯键。
（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通 过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶 是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不 需要模板。
2、根据你所掌握的知识，你能分析出限制酶存在 于原核生物中的作用是什么吗？
提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵， 但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的 防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是 细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利 用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。 所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、 使之失效，从而达到保护自身的目的。
• 鉴定:
– 功能活性鉴定 – 抗性鉴定
分别提取什么进行检测
a
DNA
变性
b
DNA杂交
（如检测SARS病毒等）
附着在膜上
c
硝化纤维素
加探针
报告基因（含荧光素分子）
d
①检测是否插入目的基因，利用DNA分子杂交技术，目的基因 DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有 杂交带。 ②检测是否转录出了mRNA，利用DNA分子杂交技术，目的基因 DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有 杂交带。 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗原－ 抗体杂交，看是否有杂交带。 ④还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。 提示：①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高 温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；②抗原－抗体杂 交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生 相应的抗体，并提取出而来的。
（5）对符合设计要求的重组质粒T进行酶切，。假设所用的酶 均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表2 所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。
①采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切，得到_____2____种DNA片断。 ②采用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切，得到____1_____种DNA片断。
1、作用——限制性核酸内切酶能识别双链DNA分 子的某种特定的核苷酸序列，并在使每一条链中特 定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
G
C
A
T
A
T
T
A
T
A
磷酸二酯键
即脱氧核糖、磷 酸之间的连接
C
G
G
C
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组 成，例如，EcoRΙ、SmaΙ，也有少数有4、 5或8个核苷酸组成。
A ATTC
CT TAA
G
思考
要想获得某 个特定性状的基 因必须要用限制 酶切几个切口？ 可产生几个黏性 末端？
两个切口，四 个黏性末端。
2、 DNA连接酶——“分子缝合针”
作用——把两条DNA末端之间的缝隙“缝 合”起来。
GAA T T C C T T AA G
P
G
即脱氧核糖、磷酸基之间的连接 P
二 真核细胞的基因结构
非编码区
编码区
非编码区
编码区下游
外显子
内含子
(能编码蛋白质) (不能编码蛋白质)
调控遗传信息的表达 (调控序列)
将重组DNA分子导入受体细胞
• 导入植物细 胞
（重组DNA分子导入农杆菌， 再让农杆菌感染植物细胞）
补充归纳导入方法
将目的基因导入植物细胞
• 农杆菌转化法 • 基因枪法 • 花粉管通道法
C A．3 B．4 C．9 D．12
二、基因工程的基本操作步骤
1、获得目的基因 2、形成重组DNA分子 3、将重组DNA分子导入受体细胞 4、筛选含有目的基因的受体细胞 5、目的基因的表达
一、获得目的基因
目的基因的核苷酸序列未知
目的基因的核苷酸序列已知
从基因 文库中 寻找
聚合酶链式反应 化学合成法 （PCR）扩增
此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不 相同。
质粒的特点
1. 1、质粒是基因工程中最常用的运载体；2、存在于许 多细菌及酵母菌等生物中；3、细菌DNA外能自主复制 的小型环状DNA分子；4、最常用的质粒是大肠杆菌的 质粒；5、质粒的存在对宿主细胞无影响；6、质粒的 复制只能在宿主细胞内完成。
思考
（１）质粒上会存在某些标记基因，标记基因有什么 用途？
（２）要想将某个特定基因与质粒相连，需要用几种 限制性内切酶和几种DNA连接酶处理？
感受高考
1.已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个 酶切位点，如图中箭头所指。如果在该线性DNA分 子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、 c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性 DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点 被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些 线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数 是 (全国理综4)
因送到宿主细胞中去。
思考：1、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？ 提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒 （plasmid），即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复 制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载 体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。
思考
（１）用DNA连接酶连接两个相同的黏性末端要连接 几个磷酸二酯键？
２个
（２）用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二
酯键？ ４个
３、基因的运输工具——运载体
作用：将外源基因送入受体细胞。
能在宿主细胞内复制并稳定地保存 具备的条件 具有多个限制酶切点
具有某些标记基因 种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。 使用运载体的目的：用它作为运载工具，将目的基
一 原核细胞的基因结构
非编码区
编码区
非编码区
编码区上游
编码区下游
编码蛋白质 (编码序列)
调控遗传信息的表达 (调控序列)
一 原核细胞的基因结构
非编码区
编码区
非编码区
与RNA聚合酶 结合位点
RNA聚合酶是一种蛋白 质，能识别并与调控序 列中的结合位点结合， 能催化DNA转录为RNA
一 原核细胞的基因结构
基因拼接技术或DNA重组技术
操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果
生物体外 基因
ＤＮＡ分子水平 剪切 拼接 导入 表达
人类需要的基因产物
实质：基因重组
基因工程培育抗虫棉的简要过程：
苏云金芽孢杆菌 (有抗虫特性)
普通棉花(无抗虫特性)
提取
与运载体DNA拼接 抗虫基因
导入
棉花细胞(含抗虫基因)
导入动物的方法
将目的基因导入动物细胞
• 显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微 仪注射到受精卵中）
导入微生物
将目的基因导入微生物细胞
Ca2＋处理受 体细胞成为 感受态细胞， 再进行混合。
4检测和鉴定
筛选含有目的基因的受体细胞 目的基因的表达
• 检测:
– 是否插入目的基 因
– 是否转录 – 是否翻译
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
基因组DNA文库
cDNA文库
基因文库中不是直接保管相 应基因，而是保存受体菌，菌 中含基因
归纳：获取目的基因的方法
– 从基因文库中获取 – 利用PCR技术扩增 – 利用化学方法人工合成
2构建载体
形成重组DNA分子
方法：同种限制酶分别 切割载体和目的基因， 再用DNA连接酶把两者连 接。
32．（8分）将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，
饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备
过程相关的图和表。(08江苏)
请根据以上
图表回答下
列问题。
（1）在采用
常规PCR方
法扩增目的
基因的过程 中，使用的 DNA聚合酶 不同于一般
生物体内的 DNA聚合酶， 其最主要的 特点是
A
限制酶切割后有两种不同的结果， 一种产生黏性末端，一种产生平末端。 那么恢复它们的连接时，所用DNA连 接酶是否一样呢？
E.coliDNA连接酶：连接黏性末端
T4DNA连接酶：连接黏性末端和平末端
DNA连接酶连接的部位： 磷酸二酯键（在“梯子”的 扶手处）， 不是氢键（在“梯子”的踏板处）。
结果：两个相同的黏性末端的连接。
与RNA聚合酶 结合位点
AGGTCACGTCG TCCAGTGCAGC
RNA聚合酶
一 原核细胞的基因结构
与RNA聚合酶 结合位点
AGGTCACGTCG TCCAGTGCAGC
RNA聚合酶 A G G U C A C G U C G
一 原核细胞的基因结构
与RNA聚合酶 结合位点
AGGTCACGTCG TCCAGTGCAGC AGGUCACGUCG
大肠杆菌的一种限制酶（EcoRⅠ)能识 别GAATTC序列，SmaI识别CCCGGG 序列:
GAA TT C CT T AAG
中轴线
G
AA T T C
C T TAA
G
黏性末端
CCC GGG GGG CCC
CCC GGG GGG CCC
平末端
限制酶切割ＤＮＡ分子示意图
GA ATBiblioteka BaiduC CT TAAG
G
（1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因 可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，
还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的 插入而失活。
（2） 载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA 上随染色体DNA的复制而同步复制。
基因工程复习一
一、基因工程的基本内容
基因工程，确切地讲就是重组DNA技术，指在体 外将不同来源的DNA进行剪切和重组，形成杂合 DNA或称嵌合DNA分子，然后将其导入特定的宿 主细胞，得到大量扩增和表达，使宿主细胞获得 新的遗传特性，产生新的基因产物。基因工程， 或称遗传工程，兴起于20世纪70年代。人类实现 对基因进行自如地操作、转移和改造的理想，是 在核酸限制性内切酶、载体质粒、连接酶和其它 修饰酶被陆续发现以后。在此基础上，核酸和蛋 白质序列测定、基因体外快速突变、DNA的人工 合成等，则使得基因工程逐渐成熟和发展。
棉花植株(有抗虫特性)
通过观察抗虫棉的培育过程，你认为关键的 步骤是什么？
关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取。 关键步骤二：抗虫基因与运载体DNA连接。 关键步骤三：抗虫基因进入棉细胞。
关键步骤一的工具：基因的剪刀——限制性内切酶。 关键步骤二的工具：基因的针线——DNA连接酶。 关键步骤三的工具：基因的运输工具——运载体。
3、DNA连接酶连接的是什么部位？ DNA连接酶是将一段DNA片段3′端的羟基与另一 DNA片段5′端磷酸基团上的羟基连接起来形成酯键，而 不是连接互补碱基之间的氢键。
4、DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？ 答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是 从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coli连接酶。另一种是从 T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应 基本相同，都是连接双链DNA的缺口（nick），而不能连接单 链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键（在 相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团 的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？