实验五 大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定

实验五大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定
姓名：任妮 2011302110100
摘要：目的：研究有效的S9代谢活化酶系统的制备方法，掌握用考马斯亮蓝的方法测定蛋白质的含量。

方法：通过使用80mg/kg苯巴比妥钠对大鼠进行诱导（连续3～5d），停止给药后24h采样（无菌取出肝脏），制备肝匀浆，9000g速度0～4℃低温环境下离心，取出上清液（S9组分），最后加入考马斯亮蓝染色液，测定OD595nm值。

通过不同浓度的标准蛋白溶液来建立标准蛋白的标准曲线，根据肝S9组分的OD595nm值计算出样品中蛋白质浓度。

结果：本实验建立的标准曲线方程为y=0.0062x-0.045，相关系数为0.9887,相关性较好。

测得肝S9组分样品蛋白的浓度为25.04mg/ml。

结论：苯巴比妥钠作为诱导剂可以成功制备出大鼠肝S9.
关键词：肝S9；蛋白质含量；考马斯亮蓝染色法（Bradford法）
前言：许多致癌剂的生物转化是依赖细胞内微粒体混合功能氧化酶系来完成的. 大鼠肝S9是许多体外实验常用的体外活化系统,其主要有效成分为混合功能氧化酶( MPO)系统,其中许多酶共同组成电子传递体系,其中细胞色素P450(CYP450)在整个酶系中起着末端氧化酶作用,具有活化氧分子和与底物结合的双重功能。

CYP450在氧化活动和底物结合中的作用决定其在MPO系统中起决定作用,苯巴比妥钠是目前大鼠肝S9常用的诱导剂,能诱导活化许多致癌性化学物所需要的细胞色素。

因此,本文采用苯巴比妥钠作为诱导剂,制备S9,并采用考马斯亮蓝法测定所制备的S9的蛋白含量,进而研究有效的S9代谢活化酶系统制备方法和测定方法。

蛋白质浓度的测定有许多方法，本次试验采用的是考马斯亮蓝染色法（Bradford法），该方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮蓝染色法原理：考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质（主要是碱性氨基酸，特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基）结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm 变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。

染料在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比。

1 实验材料
1.1实验动物
大鼠：健康雄性成年SD 或Wistar 5~6 周龄150g左右
（由于实验条件限制，本次实验采用的是小鼠）
1.2实验器材
可见分光光度计，漩涡混合器，试管和试管架、低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等。

1.3实验试剂
1.17% （0.15M）KCl
Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约80ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml。

标准蛋白质溶液：1mg/ml牛血清清蛋白（BSA）。

考马斯亮兰G-250染料试剂：称考马斯亮兰G-250 100mg，溶于50ml 95％的乙醇后，再加入85％的磷酸120ml ，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。

2 实验方法及步骤
2.1大鼠肝S9的制备
2.1.1 诱导
1）苯巴比妥钠80mg/kg，腹腔注射，连续3～5d，最后一次给药后24h 后采样。

主要诱导P450。

2）戊巴比妥钠80mg/kg，腹腔注射，连续3d，第4d采样。

主要诱导P450。

3）多氯联苯（Aro-clor1254或国产PCB-五氯）。

同时诱导P450和P448。

溶剂玉米油浓度200mg/mL
剂量500mg/kg 方式腹腔注射时间3d
采样第4d
4）β-萘黄酮玉米油，80mg/kg，腹腔注射连续3d，第4d采样。

主要诱导P448。

2.1.2 采样
采样前禁食24h，但可以自由饮水；
断头处死，放尽血液，迅速剖开胸、腹腔，取出肝脏，用冰冷1.17% KCl
溶液洗净血污，并用滤纸吸干表面水分。

无菌取出肝脏，置平皿中称重，用预冷的0.15M KCl溶液淋洗数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。

2.1.3 肝匀浆的制备
弃去淋洗液，称取1g肝脏转入小烧杯，加Tris-HCl缓冲液溶3ml/g（肝湿重），用剪刀剪碎肝脏，转入匀浆器
玻璃匀浆器低于4000r/min，1～2min
或组织匀浆器20000r/min，1min
※以上操作需注意无菌和局部冷环境
2.1.4 S9制备
1）离心肝匀浆高速离心机低温0～4℃速度9000g 离心10min ※g=1.11×10(-6)R平均×（rpm)2
（g 相对离心力；R平均转头的平均直径，以mm计算；rpm 每分钟转数）上清液即为S9组分。

2）分装于无菌冷冻管或安瓿中，安瓿2mL左右。

3）保存液氮速冻后置-80℃低温保存。

4）检查
无菌检查；蛋白含量测定(Bradford法)，每毫升蛋白含量应不超过40mg为宜，因过量蛋白将会抑制回复突变率；生物活性合格。

5）贮存深低温或冰冻干燥；保存期不超过一年。

2.2微量法制作标准曲线
取7支试管按表1顺序加样，各设三个重复管。

样品编号0 1 2 3 4 5 6
标准蛋白含量（μg）0 10 20 40 60 80 100 标准蛋白溶液（ml）0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 蒸馏水（ml）0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 考马斯亮蓝试剂（ml） 5.0
混匀，静止10min，以0号试管为空白对照，于595nm处比色测定各管OD值。

以OD595nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在EXCEL 中绘制标准曲线。

2.3未知样品蛋白质浓度的测定
测定方法同上，肝S9组分10倍稀释后取0.04ml ，测定OD595nm 值，平行测定三次。

根据所测定的平均OD595nm 值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。

3实验结果
3.1 蛋白标准稀释液吸光度
表2 蛋白标准稀释液吸光度
样品 编号 标准蛋白溶液
(mL)
吸光度
1 2 3 平均值 0 0 -- -- -- -- 1 0.01 0.016 -- -- 0.016 2 0.02 0.049 0.074 0.031 0.051 3 0.04 0.109 0.199 0.184 0.164 4 0.06 0.306 0.371 0.345 0.341 5 0.08 0.389 0.419 0.425 0.411 6
0.1
0.590
0.639
0.600
0.610
3.2标准蛋白曲线
图1 标准蛋白曲线
y = 0.0062x - 0.045
R 2 = 0.9775
-0.100.10.20.30.40.50.60.70
20
40
60
80
100
120
标准蛋白含量ug 吸光度
系列1
线性 (系列1)线性 (系列1)
3.3计算未知样品蛋白质浓度
表3 肝S9浓度测定结果
肝S9组分浓度（ml）
吸光度测得蛋白含量
（ug）
原浓度
（mg/ml）1 2 3 平均
0.04 0.599 0.540 0.590 0.576 100.16 25.04
由上图表算出肝S9组分蛋白含量为25.04mg/ml。

4讨论
由结果吸光度值随着蛋白含量的增大呈一梯度变化，基本落在一条直线上，误差不是很大，结果基本准确。

1）本次实验，所建立的标准蛋白的标准曲线方程为y=0.0062x-0.045，相关系数为0.9887,相关性不是很好。

2）最好在试剂加入后的5- 20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色最稳定。

3）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。

测定完后可用95％乙醇将比色杯洗干净。

4）不可使用石英比色皿（不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿。

塑料比色皿不可用乙醇或丙长时间浸泡。

5）取出肝脏后，在制备S9混悬液过程中, 应注意用新鲜冰冷的0.15 mol/l氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次, 以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。