Southern印迹技术应用与注意事项
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1.根据实验目的设计酶切位点； 2.选用酶切效率高的常用限制性内切酶； 3.选用1-2种内切酶。
探针设计：
1.设计引物，遵循引物设计原则。
2.片段长度根据酶切后片段大小决定，不宜过长，否则会影响杂交过程中与膜上 样本的结合效率。
三、操作步骤-样本准备
DNA提取常用方法:
1.CTAB 法提取DNA
•取材料，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5 ml Eppendorf管中； •加入800 μl的CTAB提取缓冲液，混匀（CTAB在65℃水浴预热），每5min轻轻震荡几次， 20min后12000 r/min，离心15 min；
端粒酶长度检测
七、总结
做好Southern杂交的最根本就在于熟悉每一个步骤。前期的准备非常
重要，主要涉及到酶切位点和探针的设计，这个必须根据实验的目的来进 行。在实验操作过程中，每个步骤按常规操作即可，但是，探针的用量， 样本量以及酶切，这几个部分至关重要，否则，要么没有结果，要么结果 呈现不佳。 所以，只有熟悉整个环节，认真做好关键步骤，southern杂交的结果 就会非常漂亮。
检测
PCR 产物分析
六、案例分析
Southern blot已广泛应用于分析DNA和端粒结构. 用限制性核酸内切酶 Hin fⅠ或RsaⅠ消化DNA, 然后琼脂糖电泳分离不同大小的片段, 转移到硝酸 纤维或尼龙膜上. 用32P同位素或生物素、碱性磷酸酯酶标记的端粒特异探针 与其杂交(CCCATT)n. 末端限制酶切片段(TRF)通过光密度计定量测量. TRF法得到的数据除代表所有染色体端粒的长度外, 还包括部分亚端粒 区长度. 因此TRF法不能提供端粒的实际长度.
从而检测特定DNA分子的含量。
三、操作步骤
酶切位点、探针设计
根据酶切位点进行样本的 酶切，低压电泳分离 DNA 片段
杂交过夜，洗膜并显色
实验前
样本 准备
酶切 电泳
转膜 固定
杂交 显色
DNA提取及处理,探针标记
文本
处理电泳之后的凝胶，转 膜，固定DNA
三、操作步骤-酶切位点，探针设计
酶切位点设计原则：
三、操作步骤-酶切和电泳
酶切:
取样本，加入限制性内切酶，37℃酶切1h左右，待样本酶切到适宜程度，即可终止反应，
用作后续试验。
10×FD buffer 4.5 μL 2 μL 2 μL
酶1 酶2
基因组
ddH2O 总体积
6 μg
水至45 μL 45 μL
电泳：
酶切1.5 h后，取2μL酶切DNA样品于1%的琼脂糖凝胶上进行检测，判断酶切程度。当酶 切充分时，制备1%的琼脂糖电泳凝胶，样品中加入10×loading buffer，于30-40 V稳压电泳 4-
•小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿（各400μl）溶液，混匀，4℃，12000 r/min，
离心10 min； •小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4℃，12000 r/min，离心10 min。 •重复步骤（4）1-2次，以蛋白层不出现为止； •取上清，-20℃沉淀过夜h，4℃，12000 r/min，离心10 min； •弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次； •室温下干燥后（一般干燥5-15 min），溶于30-50 μl DEPC去离子水中，于-20℃或者70℃下保存备用。
备）；
4) 杂交：弃去预杂交液，往杂交瓶中加入新的Hyb 高效杂交液（10 mL/100㎜2），再加入 6 μL变性好的探针（5-20 ng/ mL杂交液），混匀，置于杂交炉中42℃杂交过夜。
洗膜及DIG信号检测
1) 杂交后，室温下，20 mL 2×SSC+0.1%SDS 洗膜5 min，重复一次 2) 将0.1×SSC+0.1%SDS洗液置于65℃水浴锅中预热后，加入20 mL 进杂交瓶中，65℃洗 涤15 min，重复一次； 3) 将膜取出，置于平板中，加入20 mL 洗涤缓冲液中轻轻晃动5 min，倒掉液体； 4) 加入100 mL 阻断液反应30 min（在摇床上轻轻摇动），倒掉液体； 5) 加入20 mL 含有抗体的缓冲液，摇动孵育30 min后，倒掉液体； 6) 再加入100 mL洗涤缓冲液洗涤15 min，倒掉液体后，重复此步骤一次； 7) 加入20 mL检测缓冲液，平衡5分钟； 8) 将膜放在盛有底物显色液的盒中（10 mL显色液/100 mm2），15-25℃避光孵育3-5h； 9) 当显色到适合效果后用水洗膜5 min，扫描结果。
杂交
将膜放置进入杂交瓶内防止气泡出现，让非片段面贴瓶壁
显色
膜在与显色液反应时严格避光，随时注意条带情况
酶切结果展示
五、应用范围
传统的基因诊断技术主要是以基因探针技术 遗传病 诊断 为基础而建立的一些检测方法-Southern blot
DNA 图谱分析
高度的特异性
稳定的遗传性
体细胞稳定性
Souther n blot
4) 将三张与膜等大的whatman 3mm滤纸放在膜上，利用玻棒使其平整后，放置一叠与凝胶大小一致
的吸水纸，并用玻璃板作为放置重物的平台，压在吸水纸上，再添加500 g左右的重物； 5) 用塑料隔板封闭凝胶四周，以防止吸水纸通过接触凝胶的边缘而直接接触平板造成液流的短路； 6) 转移3小时后，将浸湿的吸水纸换掉，添加干燥的吸水纸，整个转移过程为18-24 h，期间根据吸水
纸湿润情况换纸1-2次；
7) DNA在膜上的固定： 将完成转移后的尼龙膜置于2×SSC缓冲液中短暂洗涤1 min，放置于两张滤纸 中，120℃烘箱中烘干固定30 min。
三、操作步骤-杂交、显色
杂交
1) 预杂交：将尼龙膜上没有固定DNA的一面贴瓶壁，放入杂交瓶中，加入42℃预热的Hyb
高效杂交液（Hyb-100）(10 mL/100 mm2)，置于42℃杂交炉中预杂交2 h； 2) 标记探针：用引物TF和TR进行PCR扩增制备探针，胶回收产物，再按照DIG试剂盒的操 作说明标记探针，并用PCR产物纯化试剂盒纯化探针； 3) 探针变性：将纯化后的探针沸水中水浴变性10 min，立即置于冰上，冰浴2 min（现用现
5 h（包括DNA Marker和阳性对照质粒）。
电泳完成之后，切下样品及质粒部分的凝胶，剩余DNA Marker部分则单独浸泡在添加了 10 μL 10 mg/ mL溴化乙锭（EB）的100 mL 1× TAE buffer中染色30 min。
三、操作步骤-转膜、固定
电泳凝胶预处理
1) 将凝胶浸于适量变性液中（浸没凝胶），室温，于水平摇床上低速晃动15 min，并重复一次； 2) 再将凝胶浸于灭菌的ddH2O中，室温，轻轻晃动10 min； 3) 将凝胶浸在中和液中，室温轻轻晃动15 min，并重复一次； 4) 在20×SSC缓冲液中平衡凝胶10 min以上。
四、注意事项
01
探针设计和标记 引物的特异性要高，产物片段长度适宜，标记后需纯化 样本问题 获得样本时，需要保证DNA的完整性，防止降解，用量≈6ug
02 03
04 05 06
酶切与电泳
酶切体系，时间要合适，防止酶切不完全或酶切过度，电泳要低压长时间电泳
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ转膜
胶片用于防止转膜过程的“短路”，做好标记
（Edwin Mellor Southern UK）
随后于1977年，Alwine等人应用类似方法用于检测经琼脂糖凝胶或聚丙烯酰
胺凝胶（PAGE）电泳中分离的特定RNA，此方法又称为Northern blot（Northern
印迹）。 1979年Towbin等再将该方法扩展到特定的蛋白质检测或分析上，成为Western blot（Western 印迹）
转膜
1) 裁剪一张大小合适（19 cm×20 cm）的whatman 3mm滤纸，经20×SSC buffer浸湿后，放在比凝 胶稍大的支撑平台上，两端浸入20×SSC buffer，形成一个“桥”； 2) 将与凝胶等大的滤纸Ⅰ放在搭好桥的滤纸上，再将凝胶放置于滤纸Ⅰ上（凝胶背面向上放置），切 掉左上角，注意两者之间杜绝气泡； 3) 裁剪尼龙膜，与凝胶等大，放置在凝胶上，利用玻棒使其平整，杜绝气泡出现；
Southern印迹 技术应用与注意事项
威斯腾生物技术中心
400-675-6758
技术简介 技术原理
操作步骤
注意事项 应用范围 案例分析 总结
一、技术简介
Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国人 southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、 DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。
二、技术原理
具有一定同源性的两条核酸单链 在一定的条件下，可按碱基互补的原
则特异性地杂交形成双链。
一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经 限制性内切酶消化的DNA片段。
将胶上的DNA变性并在原位将单
链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相 支持物上，经干烤或者紫外线照射固
定。
再与相对应结构的标记探针进行 杂交，用放射自显影或酶反应显色，
2.Chelex-100树脂法 3.试剂盒抽提 4.磁珠提取法
三、操作步骤-探针标记
用引物TF和TR进行PCR扩增制备探针，胶回收产物，再用标志物进行标记。
常用标志物：
同位素——灵敏度高，效果好； 地高辛——安全性好； 将扩增得到的探针片段煮沸处理，冰浴5min，加入DIG，37℃孵育过夜。 T4多聚核苷酸激酶——人工合成的短寡核苷酸。
探针设计：
1.设计引物，遵循引物设计原则。
2.片段长度根据酶切后片段大小决定，不宜过长，否则会影响杂交过程中与膜上 样本的结合效率。
三、操作步骤-样本准备
DNA提取常用方法:
1.CTAB 法提取DNA
•取材料，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5 ml Eppendorf管中； •加入800 μl的CTAB提取缓冲液，混匀（CTAB在65℃水浴预热），每5min轻轻震荡几次， 20min后12000 r/min，离心15 min；
端粒酶长度检测
七、总结
做好Southern杂交的最根本就在于熟悉每一个步骤。前期的准备非常
重要，主要涉及到酶切位点和探针的设计，这个必须根据实验的目的来进 行。在实验操作过程中，每个步骤按常规操作即可，但是，探针的用量， 样本量以及酶切，这几个部分至关重要，否则，要么没有结果，要么结果 呈现不佳。 所以，只有熟悉整个环节，认真做好关键步骤，southern杂交的结果 就会非常漂亮。
检测
PCR 产物分析
六、案例分析
Southern blot已广泛应用于分析DNA和端粒结构. 用限制性核酸内切酶 Hin fⅠ或RsaⅠ消化DNA, 然后琼脂糖电泳分离不同大小的片段, 转移到硝酸 纤维或尼龙膜上. 用32P同位素或生物素、碱性磷酸酯酶标记的端粒特异探针 与其杂交(CCCATT)n. 末端限制酶切片段(TRF)通过光密度计定量测量. TRF法得到的数据除代表所有染色体端粒的长度外, 还包括部分亚端粒 区长度. 因此TRF法不能提供端粒的实际长度.
从而检测特定DNA分子的含量。
三、操作步骤
酶切位点、探针设计
根据酶切位点进行样本的 酶切，低压电泳分离 DNA 片段
杂交过夜，洗膜并显色
实验前
样本 准备
酶切 电泳
转膜 固定
杂交 显色
DNA提取及处理,探针标记
文本
处理电泳之后的凝胶，转 膜，固定DNA
三、操作步骤-酶切位点，探针设计
酶切位点设计原则：
三、操作步骤-酶切和电泳
酶切:
取样本，加入限制性内切酶，37℃酶切1h左右，待样本酶切到适宜程度，即可终止反应，
用作后续试验。
10×FD buffer 4.5 μL 2 μL 2 μL
酶1 酶2
基因组
ddH2O 总体积
6 μg
水至45 μL 45 μL
电泳：
酶切1.5 h后，取2μL酶切DNA样品于1%的琼脂糖凝胶上进行检测，判断酶切程度。当酶 切充分时，制备1%的琼脂糖电泳凝胶，样品中加入10×loading buffer，于30-40 V稳压电泳 4-
•小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿（各400μl）溶液，混匀，4℃，12000 r/min，
离心10 min； •小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4℃，12000 r/min，离心10 min。 •重复步骤（4）1-2次，以蛋白层不出现为止； •取上清，-20℃沉淀过夜h，4℃，12000 r/min，离心10 min； •弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次； •室温下干燥后（一般干燥5-15 min），溶于30-50 μl DEPC去离子水中，于-20℃或者70℃下保存备用。
备）；
4) 杂交：弃去预杂交液，往杂交瓶中加入新的Hyb 高效杂交液（10 mL/100㎜2），再加入 6 μL变性好的探针（5-20 ng/ mL杂交液），混匀，置于杂交炉中42℃杂交过夜。
洗膜及DIG信号检测
1) 杂交后，室温下，20 mL 2×SSC+0.1%SDS 洗膜5 min，重复一次 2) 将0.1×SSC+0.1%SDS洗液置于65℃水浴锅中预热后，加入20 mL 进杂交瓶中，65℃洗 涤15 min，重复一次； 3) 将膜取出，置于平板中，加入20 mL 洗涤缓冲液中轻轻晃动5 min，倒掉液体； 4) 加入100 mL 阻断液反应30 min（在摇床上轻轻摇动），倒掉液体； 5) 加入20 mL 含有抗体的缓冲液，摇动孵育30 min后，倒掉液体； 6) 再加入100 mL洗涤缓冲液洗涤15 min，倒掉液体后，重复此步骤一次； 7) 加入20 mL检测缓冲液，平衡5分钟； 8) 将膜放在盛有底物显色液的盒中（10 mL显色液/100 mm2），15-25℃避光孵育3-5h； 9) 当显色到适合效果后用水洗膜5 min，扫描结果。
杂交
将膜放置进入杂交瓶内防止气泡出现，让非片段面贴瓶壁
显色
膜在与显色液反应时严格避光，随时注意条带情况
酶切结果展示
五、应用范围
传统的基因诊断技术主要是以基因探针技术 遗传病 诊断 为基础而建立的一些检测方法-Southern blot
DNA 图谱分析
高度的特异性
稳定的遗传性
体细胞稳定性
Souther n blot
4) 将三张与膜等大的whatman 3mm滤纸放在膜上，利用玻棒使其平整后，放置一叠与凝胶大小一致
的吸水纸，并用玻璃板作为放置重物的平台，压在吸水纸上，再添加500 g左右的重物； 5) 用塑料隔板封闭凝胶四周，以防止吸水纸通过接触凝胶的边缘而直接接触平板造成液流的短路； 6) 转移3小时后，将浸湿的吸水纸换掉，添加干燥的吸水纸，整个转移过程为18-24 h，期间根据吸水
纸湿润情况换纸1-2次；
7) DNA在膜上的固定： 将完成转移后的尼龙膜置于2×SSC缓冲液中短暂洗涤1 min，放置于两张滤纸 中，120℃烘箱中烘干固定30 min。
三、操作步骤-杂交、显色
杂交
1) 预杂交：将尼龙膜上没有固定DNA的一面贴瓶壁，放入杂交瓶中，加入42℃预热的Hyb
高效杂交液（Hyb-100）(10 mL/100 mm2)，置于42℃杂交炉中预杂交2 h； 2) 标记探针：用引物TF和TR进行PCR扩增制备探针，胶回收产物，再按照DIG试剂盒的操 作说明标记探针，并用PCR产物纯化试剂盒纯化探针； 3) 探针变性：将纯化后的探针沸水中水浴变性10 min，立即置于冰上，冰浴2 min（现用现
5 h（包括DNA Marker和阳性对照质粒）。
电泳完成之后，切下样品及质粒部分的凝胶，剩余DNA Marker部分则单独浸泡在添加了 10 μL 10 mg/ mL溴化乙锭（EB）的100 mL 1× TAE buffer中染色30 min。
三、操作步骤-转膜、固定
电泳凝胶预处理
1) 将凝胶浸于适量变性液中（浸没凝胶），室温，于水平摇床上低速晃动15 min，并重复一次； 2) 再将凝胶浸于灭菌的ddH2O中，室温，轻轻晃动10 min； 3) 将凝胶浸在中和液中，室温轻轻晃动15 min，并重复一次； 4) 在20×SSC缓冲液中平衡凝胶10 min以上。
四、注意事项
01
探针设计和标记 引物的特异性要高，产物片段长度适宜，标记后需纯化 样本问题 获得样本时，需要保证DNA的完整性，防止降解，用量≈6ug
02 03
04 05 06
酶切与电泳
酶切体系，时间要合适，防止酶切不完全或酶切过度，电泳要低压长时间电泳
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ转膜
胶片用于防止转膜过程的“短路”，做好标记
（Edwin Mellor Southern UK）
随后于1977年，Alwine等人应用类似方法用于检测经琼脂糖凝胶或聚丙烯酰
胺凝胶（PAGE）电泳中分离的特定RNA，此方法又称为Northern blot（Northern
印迹）。 1979年Towbin等再将该方法扩展到特定的蛋白质检测或分析上，成为Western blot（Western 印迹）
转膜
1) 裁剪一张大小合适（19 cm×20 cm）的whatman 3mm滤纸，经20×SSC buffer浸湿后，放在比凝 胶稍大的支撑平台上，两端浸入20×SSC buffer，形成一个“桥”； 2) 将与凝胶等大的滤纸Ⅰ放在搭好桥的滤纸上，再将凝胶放置于滤纸Ⅰ上（凝胶背面向上放置），切 掉左上角，注意两者之间杜绝气泡； 3) 裁剪尼龙膜，与凝胶等大，放置在凝胶上，利用玻棒使其平整，杜绝气泡出现；
Southern印迹 技术应用与注意事项
威斯腾生物技术中心
400-675-6758
技术简介 技术原理
操作步骤
注意事项 应用范围 案例分析 总结
一、技术简介
Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国人 southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、 DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。
二、技术原理
具有一定同源性的两条核酸单链 在一定的条件下，可按碱基互补的原
则特异性地杂交形成双链。
一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经 限制性内切酶消化的DNA片段。
将胶上的DNA变性并在原位将单
链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相 支持物上，经干烤或者紫外线照射固
定。
再与相对应结构的标记探针进行 杂交，用放射自显影或酶反应显色，
2.Chelex-100树脂法 3.试剂盒抽提 4.磁珠提取法
三、操作步骤-探针标记
用引物TF和TR进行PCR扩增制备探针，胶回收产物，再用标志物进行标记。
常用标志物：
同位素——灵敏度高，效果好； 地高辛——安全性好； 将扩增得到的探针片段煮沸处理，冰浴5min，加入DIG，37℃孵育过夜。 T4多聚核苷酸激酶——人工合成的短寡核苷酸。