葡萄酒酿酒酵母菌基因工程改良_韩北忠

Ｃａｒｄｏｎａ等选择ＭＳＮ２作为目标基因来提高葡萄酒 酵母的抗性，ＭＳＮ２用于编码启动许多抗性相关基因转 录的蛋白因子，采用基因ＳＰＩ１的启动子代替此基因自身 的启动子，来调控ＭＳＮ２的过量表达，改良的酵母细胞 和对照酵母相比，１５℃和３０℃发酵速率均有所提高［４］。修 饰ＳＵＴ１、ＳＵＴ２、ＰＭＡ１和ＰＭＡ２基因的表达能够提高细 胞中固醇的积累以及细胞膜上ＡＴＰ酶的活性，从而提 高酵母对乙醇的耐受力［１－２］。 ２ 简化产品的生产工艺
市售的葡萄酒应该是澄清、晶亮、有光泽的，因而产
收稿日期： ２００７－０１－０２ 作者简介： 韩北忠（１９６１－），男，山西太原人，教授，主要从事食品微生物的研究工作。
２００７ Ｎｏ．５
· ２ · Ｓ ｅｒｉａｌ Ｎｏ．１７０
Ｃｈｉｎａ Ｂｒｅ ｗｉｎｇ
Ｆｏｒｕｍ ａｎｄ Ｓｕｍｍａｒｙ
品的澄清（化合物吸附，紧随着沉降或沉淀作用）和净化 （沉降、榨取、离心和过滤）是葡萄酒生产中的重要环节，其 主要目标是祛除蛋白质和细胞碎片，保证产品的物理化 学稳定性。葡萄酒的澄清和净化不仅费钱费力、降低葡 萄酒产量，而且还会造成香气和风味成分的流失。因此，人 们开始研究构建可简化此工艺步骤的工程酵母。
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｉｓ ｔｈｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｍｉｃｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｗｉｎｅ ｉｎｄｕｓｔｒｙ． Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ａｆｆｅｃｔｓ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｓｔ ｏｆ ｗｉｎｅ ｄｉｒｅｃｔｌｙ． Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｗｅｒｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ； ｗｉｎｅ； ｓｔｒａｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ
专论与综述
中国酿造
２００７ 年 第 ５ 期
总第 １７０ 期 · １ ·
葡萄酒酿酒酵母菌基因工程改良
韩北忠１， 李双石１， ２， 陈晶瑜１， 段常青１
（ １． 中国农业大学 食品科学与营养工程学院， 北京 １０００８３； ２． 北京电子科技职业学院， 北京 １０００２９）
摘 要： 酿酒酵母是葡萄酒发酵工业中的主导微生物，其发酵性能直接影响葡萄酒的质量与生产成本，该文论述了基因工程在
具有良好絮凝性的酿酒酵母可使葡萄酒发酵液澄 清速度加快，降低酵母分离的能量消耗，还可防止酵母 细胞因长时间悬浮于发酵液中致使细胞自溶而影响葡 萄酒的风味。酿酒酵母的絮凝特性是由其本身的遗传 特性所决定，对絮凝基因的调控表达可以保障酵母在发 酵过程中维持高悬浮态，获得迅速的发酵，而在发酵完 成时，酵母细胞能够进行快速有效地沉淀。Ｖｅｒｓｔｒｅｐｅｎ 的研 究 表 明 ，将 絮 凝 素 基 因 ＦＬＯ１ 与后期发酵启动子 ＨＳＰ３０相连接，通过热击处理进行诱导表达，确保人工 控制的絮凝在发酵结束时实现［５］。 ３ 消除有害微生物的影响
Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ等将酿酒酵母的亚硫酸盐还原酶与亚基 及辅因子相结合，以降低其在发酵过程中硫化氢的生 成量［１４］。 ５．４ 构建抗氧化的酵母菌株
嗜杀酵母的构建就是在酿酒酵母中引入对杂菌有 抑制或 杀 死 作 用 的 基 因 ，以 有 效 控 制 杂 菌的污染。例 如编码鸡蛋蛋清溶菌酶基因 ＨＥＬ１、乳酸片球菌（Ｐｅ－ ｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）的片球菌素基因ＰＥＤ１和明串珠 菌属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃａｒｎｏｓｕｍ）的明串珠菌素基因ＬＣＡ１ 都已用在具有杀菌能力的工程酵母菌中［６］。最理想的是 将各种抗微生物的活性全部整合到葡萄酒酵母中，从 而在葡萄酒酿造过程中抑制所有导致变质的细菌（如 醋菌属、葡萄糖酸菌属、乳酸菌属及小球菌属）、酵母菌 （如酒香酵母属、毕赤酵母属和接合酵母属）及霉菌（如 曲霉菌属、灰霉菌属、青霉菌属及木霉菌属）。 ４ 改善产品的保健及安全性能
葡萄酒酿酒酵母菌种改良中的应用。
关 键 词： 基因工程；酿酒酵母；葡萄酒；菌种改良
中图分类号： Ｑ７８； ＴＳ ２６１．１
文献标识码： Ａ 文章编号： ２０５４－ ０５７１（ ２００７） ０５－ ０００１－ ０３
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｗｉｎｅ ｓｔｒａｉｎｓ
众所周知，适度饮用葡萄酒可缓解人的压力，延缓 衰老，美容养颜，预防心脑血管疾病及癌症的发生，其
原因在于葡萄酒中含有保护性物质，如各种酚类化合 物、白藜芦醇、水杨酸、鞣酸、黄酮类物质、维生素Ｃ、维 生素Ｅ、微量元素硒、锌、锰等。然而，有时也发现有一些 微量的有害物质，如被怀疑有致癌可能的氨基甲酸乙 酯、神经毒素生物胺、引起哮喘的亚硫酸盐等。当开发 新型的葡萄酒酵母菌株时，应特别注意加强菌株优点 如产生白藜芦醇、肉毒碱等，减少其风险如消除氨基甲 酸乙酯和生物胺、降低酒精含量等，以更好地配合适度 饮酒的健康消费趋势。
Ｂｏｎｙ等进行了苹果酸－乳酸酶基因ｍｌｅＳ和粟酒裂 殖酵母苹果酸通透酶基因ｍａｅ１在酿酒酵母中的共表达 研究，结果表明转化子能彻底降解苹果酸［９］。Ｖｏｌｓｃｈｅｎｋ 等从粟酒裂殖酵母中分离到苹果酸通透酶基因ｍａｅ１和 苹果酸酶基因ｍａｅ２，将ｍａｅ１和ｍａｅ２转移至酿酒酵母细 胞中并使其外源基因功能性表达，转化子能够将苹果 酸转化为乙醇，即苹果酸－乙醇发酵（Ｍａｌｏ－Ａｌｃｏｈｏｌ ｆｅｒ－ ｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ＭＡＦ）［１０］。李华等通过克隆包含ｍｌｅＡ和ｍｌｅＰ 基因的ｍｌｅ基因座并转化酿酒酵母，使其中的ｍｌｅＡ基因 得到外源表达，部分Ｌ－苹果酸降解生成乳酸［１１］。
在葡萄酒的整个生产过程中，有害微生物的生长 会改变产品的化学组成，劣化其外观、香气和风味。健 康的原料、卫生的酒窖和严格的酿造操作是防止葡萄 酒腐败变坏的基础，加入化学防腐剂则是控制有害微 生物污染的第二道防线。然而，过多地使用化学防腐剂 不仅会降低葡萄酒的品质，还要面对消费者日益增长 的抵触。因此，一 些 由 酵 母 衍 生 的 代 谢 产 物，抗菌酶以 及短肽等，被认为是化学防腐剂的有效替代品。但是纯 化的抗微生物酶和细菌素的价格昂贵，而且会被葡萄 酒酵母起始发酵剂表达的有效抗菌酶和肽所包 裹 ，丧失其应有的作用。此问题可通过构建嗜杀酵母菌 株来解决。
ＨＡＮ Ｂｅｉ－ｚｈｏｎｇ１，ＬＩ Ｓｈｕａｎｇ－ｓｈｉ１，２，ＣＨＥＮ Ｊｉｎｇ－ｙｕ１，ＤＵＡＮ Ｃｈａｎｇ－ｑｉｎｇ１
（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９４，Ｃｈｉｎａ）
葡萄酒发酵过程中会产生痕量的挥发性含硫化合 物，挥发性很强，具有不愉快气味，通常描述为臭蛋味、 臭鼬气味、大蒜味或洋葱味。虽然其生成水平只有每升 数十至数百微克，但其感官刺激作用明显。含硫化合物 中挥发性最强的是硫化氢，具有臭鸡蛋的气味，硫化氢 的产生与酿酒酵母菌株的性质有关，可通过基因工程 技术构建产硫化氢低的菌株。Biblioteka 专论与综述中国酿造
２００７ 年 第 ５ 期
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物质（芳樟醇、香叶醇等）释放到酒中，但存在于葡萄浆 果及酿酒酵母中的糖苷酶种类有限，且易受到葡萄糖的 强烈抑制，而霉菌中具有多种水解糖苷能力强的酶类， 所以人们开始探索运用基因重组手段构建水解糖苷能 力强的酿酒酵母。
Ｐéｒｅｚ－Ｇｏｎｚáｌｅｚ 等 克 隆 了 长 臂 木 霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）的β（－ １，４）－内切葡聚糖酶基因ｅｇｌ１，使 其在葡萄酒酵母Ｔ７３中表达，Ｇａｎｇａ等将构巢曲霉（Ａｓ－ ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）的β－（１，４）－内切木聚糖酶基因ｘｌｎＡ 拷贝到葡萄酒酿酒酵母中并使其表达，经重组酵母发 酵获得的葡萄酒的果香均有明显增加［１２－１３］。迄今为止，科 学家们在构建能够释放香气的酶（如胶质酶、糖苷酶、 葡聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶） 和酯类修饰酶（如乙 酸乙酯转移酶、酯酶和异戊基乙酸水解酶）的酵母方面 取得了显著地进展［１－２］。 ５．３ 构建消除不良气味的酵母菌株
为当前基因改良育种的主流，科学家们现已为酿酒酵 母构建了多种有效的质粒载体和基因转化方法。本 文 就 葡 萄 酒 酿 酒 酵 母基因工程改良中的应用作一概述。 １ 改善酵母的发酵性能
在改良葡萄酒酿酒酵母发酵性能方面主要的研究 包括：增加酵母的抗压能力和恢复能力；提高其对葡萄 中糖分和氮素的吸收与同化；加强酵母对乙醇、其他微 生物的代谢产物及毒素的耐受力；增强对亚硫酸盐、重金 属和农药的耐受力以及减少发酵过程中泡沫的形成。
葡萄酒的感官品质往往取决于口感、香气与色泽 的和谐统一。 ５．１ 构建调节酸度的酵母菌株
有机酸是葡萄酒的重要成分之一，其含量影响着 葡萄酒的质量和口感。对葡萄酒酸度的生物调节可以通 过含有来源于粟酒裂殖酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ） 和乳酸菌基因组合的重组葡萄酒酵母来实现。
酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）是葡 萄 酒 发 酵工业中占主导地位的微生物，它的性能不仅直接影 响葡萄酒的 产 量 、质 量 和 经 济 性 ，还 对 葡 萄 酒 特 色 的 形成至关重要。有开拓性精神的酿酒师期望获得具有各 种 特 定 优 良 性 能 的 酵 母 菌 株 ，从 而 提 高 葡 萄 酒 的 市 场 竞 争力和商业价值，缩短发酵周期和降低生产成 本，进而提 高 企 业 的 竞 争 优 势 和 获 利 能 力 ，对 葡 萄 酒酵母的这些要求直接推动了酿酒酵母的选育和基 因改良工作。酿酒酵母传统的选育改良方法主要有自 然筛选、诱变育种和杂交育种（杂交、孢子杂交、稀有 杂 交 、胞 导 作 用 和 原 生 质 体 融 合），它 们 基 本 上 都 是 采用霰弹枪式的方法，这些方法可在较大的遗传区 域 甚 至 整 个 基 因 组 区 域 中 使 基 因 重 组 或 重 排 ，因 此 这类方法的专一性不强，可能在改善酵母菌株某些特 征的同时，丢失其他一些人们喜爱的特征［１－２］。而近年 来发展起来的基因工程技术提高了目前选育改良酿酒 酵母方法的特异性，在引入新特征、消除不利特征的同 时，一般不会影响其他性状。随着１９９６年酿酒酵母全基 因组测序工作的完成［３］，利用基因工程改良酿酒酵母成