red同源重组步骤

Red同源重装步骤
1.制备BL21及HMS的red同源重组大肠杆菌。

(1)目前有pKD46质粒，BL21化学感受态，HMS174电击感受态。

(2)实验准备
①LB液体培养基（无抗/氨苄抗性），LB固体培养基（4个），氨苄抗生素，甘油
(3)实验操作
①化学转化
1)-80℃取出一只感受态（100ul），手指融化后插入冰上，放置5min。

2)在超净台内，加入2ul连接好的pKD46质粒，用手指轻柔的拨动使其混匀，
然后插入冰中静置30min；
3)42℃热激90s，重新插回冰中放置5min；
4)在超净台内每支EP管中各加1mL的LB液体培养基，30℃、200rpm摇晃
培养1h；
5)然后在常温、3000rpm条件下，离心5min。

弃部分上清，留100μL左右
留作吹悬，涂布在含有氨苄青霉素（）的LB固体培养基上，30℃倒置培
养过夜。

6)次日，挑选合适大小的单菌落至含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，
在30℃、220rpm条件下摇晃培养至合适浓度，加15%-30%甘油保菌，保
存至-80℃冰箱中。

②电击转化
1)-80℃取出一只感受态（100ul），手指融化后插入冰上，放置2min。

2)在超净台内，加入2ul连接好的pKD46质粒，用手指轻柔的拨动使其混匀，
然后插入冰中静置2-3min；
3)电击2500v后，立即加入提前预热好的培养基，30℃、200rpm摇晃培养
1h；
4)然后在常温、3000rpm条件下，离心5min。

弃部分上清，留100μL左右
留作吹悬，涂布在含有氨苄青霉素（）的LB固体培养基上，30℃倒置培
养过夜。

5)次日，挑选合适大小的单菌落至含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，
在30℃、220rpm条件下摇晃培养至合适浓度，加15%-30%甘油保菌，保
存至-80℃冰箱中。

2.red同源重组电击感受态制备
(1)实验准备
①泡酸：两个250mL锥形瓶，一个培养皿。

②灭菌：
1)活化培养基25ml（1mL*3*2）
2)50*2感受态培养基
3)一个过滤L-阿拉伯糖的滤器
4)100ml左右去离子水
5)150ml左右15% 甘油（22.5mL甘油）
6) 1.5ml ep管枪尖（黄枪尖要剪）50ml离心管*4
③试剂：
1)Amp 抗生素（）
2)10M的L-阿拉伯糖（1.80g加入1.2ml水中，过滤。

）按1：100稀释。

(2)实验操作
①将平板上的生长的30℃，200rpm 过夜活化，次日按1：100转接摇瓶。

（50
加0.5）
(3)OD在0.25左右，加入L-阿拉伯糖至终浓度为100mM，诱导1.5-2h。

（菌浓度不宜
太过）
(4)将培养好的菌液转入到50mL离心管里，4000rpm，15-20min 去上清。

(5)每个离心管内加入20mL ddH2O悬起清洗，4000rpm，15-20min 去上清。

(6)20mL 15%甘油悬起清洗，4000rpm，15-20min 去上清。

(7)重复（5）
(8)最终沉淀用1mL 15%甘油悬起，分装100uL/支，液氮速冻然后转-80℃保存备用。

3.打靶片段扩增
(1)实验准备
①PCR扩增：上下游引物，模板（氯霉素基因），primer star，pcr仪
②胶回收：1%琼脂糖凝胶，胶回收试剂盒，去离子水。

(2)实验操作
①根据待敲基因上下游的序列和cat基因序列分别设计上下游同源臂和cat基因
PCR上下游引物。

以及设计将各段拼接起来的打靶序列全长上下游引物。

送公
司合成以上引物。

②加相应体积的纯水溶解各引物，按水33μL，DNTP4μL，5×buffer 10μL，primer
star 0.5μL，上下游引物各1μL，模板0.5μL比例配置PCR反应液，每支分装
50μL。

根据各自的退火温度、延长时间和循环数进行扩增。

③配置25mL1%的琼脂糖凝胶：称取0.25g琼脂糖凝胶至三角瓶中，加30mL 1×
TAE。

微波炉加热大约1分钟左右，使其全部熔化。

④然后自然冷却到60-70摄氏度，将其缓慢的倒入已经插好梳子的制胶模具中。

加入2μL溴化乙锭（EB）并搅拌均匀。

⑤向50μL体系的PCR产物中加入6μL 10×loading buffer ，用震荡仪器将其
震荡均匀。

⑥待凝胶凝固后，垂直轻拔梳子，将带凝胶的胶床置于单用槽中，点样孔位于电
场负极。

添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2mm为止。

⑦每孔上样55μL ,在一个孔内加入5μL 相相匹配的DNA marker。

⑧140V恒压电泳，溴酚蓝迁移到33%-66%时停止。

在紫外发光仪内打开紫外灯，
观察确认相应条带位置，切割下相应的凝胶放入1.5mLEP管中；
⑨用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行胶回收。

获得以上相对的的扩增产物。

4.Red同源重组
(1)实验准备
①灭菌
1)SOC活化培养基
2)5个氯霉素LB平板
3)25mL培养基*3
4)甘油
5)10ml离心管
(2)实验操作
①保存于-80℃冰箱中的诱导表达重组酶的BL21和HMS174大肠杆菌感受态从
-80℃冰箱中各取一支出，快速插在冰上，静置1-2min；
②在超净台内向两支感受态各加入2μL左右（可以相应增加）的线性打靶片段，
用手指轻柔的拨动使其混匀，放置2-3min；
③电击2500v后，立即加入1mL的SOC培养基，37℃、220rpm摇晃培养2h；
④然后在常温、3000rmp条件下，离心5min。

弃部分上清，留100μL左右留作
吹悬，涂布在含有氯霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。

⑤次日，挑选合适大小的单菌落至含有氯霉素的1ml LB液体培养基的1.5mlEP
管中，在37℃、220rpm条件下摇晃培养至合适浓度，取一部分进行菌液PCR ⑥将鉴定合适的，按1:100接种到5ml的含氯霉素LB培养基的10ml离心管中培
鉴定。

养至OD600约为0.4时。

⑦取一部分加甘油，使其终浓度为15%-30%，保存至-80℃冰箱中。